Application de la tomographie par cohérence optique à un modèle murin de rétinopathie

Résumé

Nous décrivons ici une technique d’imagerie in vivo utilisant la tomographie par cohérence optique pour faciliter le diagnostic et la mesure quantitative de la rétinopathie chez la souris.

Résumé

La tomographie par cohérence optique (TCO) offre une méthode non invasive pour le diagnostic de la rétinopathie. La machine OCT peut capturer des images en coupe transversale rétinienne à partir desquelles l’épaisseur rétinienne peut être calculée. Bien que la TCO soit largement utilisée dans la pratique clinique, son application en recherche fondamentale n’est pas aussi répandue, en particulier chez les petits animaux tels que les souris. En raison de la petite taille de leurs globes oculaires, il est difficile de mener des examens d’imagerie du fond d’œil chez la souris. Par conséquent, un système d’imagerie rétinienne spécialisé est nécessaire pour permettre l’imagerie OCT sur les petits animaux. Cet article présente un système spécifique aux petits animaux pour les procédures d’examen OCT et une méthode détaillée pour l’analyse d’images. Les résultats de l’examen OCT rétinien de souris knockout du récepteur des lipoprotéines de très basse densité (Vldlr) et des souris C57BL / 6J sont présentés. Les images OCT de souris C57BL / 6J montraient des couches rétiniennes, tandis que celles de souris knockout Vldlr présentaient une néovascularisation sous-rétinienne et un amincissement de la rétine. En résumé, l’examen OCT pourrait faciliter la détection et la mesure non invasives de la rétinopathie dans des modèles murins.

Introduction

La tomographie par cohérence optique (TCO) est une technique d’imagerie qui permet de fournir in vivo une imagerie à haute résolution et en coupe transversale pour les tissus 1,2,3,4,5,6,7,8, en particulier pour l’examen non invasif de la rétine 9,10,11,12 . Il peut également être utilisé pour quantifier certains biomarqueurs importants, tels que l’épaisseur rétinienne et l’épaisseur de la couche de fibres nerveuses rétiniennes. Le principe de l’OCT est la réflectométrie par cohérence optique, qui obtient des informations de tissu transversal à partir de la cohérence de la lumière réfléchie par un échantillon et la convertit en une forme graphique ou numérique grâce à un système informatique⁷. La TCO est largement utilisée dans les cliniques d’ophtalmologie comme outil essentiel pour le diagnostic, le suivi et la prise en charge des patients atteints de troubles rétiniens. Il peut également fournir un aperçu de la pathogenèse des maladies de la rétine.

En plus des applications cliniques, l’OCT a également été utilisée dans les études animales. Bien que la pathologie soit l’étalon-or de la caractérisation morphologique, la TCO présente l’avantage de l’imagerie in vivo non invasive et du suivi longitudinal. De plus, il a été démontré que la TCO est bien corrélée à l’histopathologie dans les modèles animaux^de rétinopathie 11,13,14,15,16,17,18,19,20. La souris est l’animal le plus couramment utilisé dans les études biomédicales. Cependant, ses petits globes oculaires posent un défi technique à la réalisation de l’imagerie OCT chez la souris.

Par rapport à l’OCT utilisé pour la première fois pour l’imagerie rétinienne chez la souris^21,22, l’OCT chez les petits animaux a maintenant été optimisé en ce qui concerne les systèmes matériels et logiciels. Par exemple, l’OCT, en combinaison avec le tracker, réduit considérablement le rapport signal/bruit; Les mises à niveau du système logiciel OCT permettent de détecter automatiquement un plus grand nombre de couches rétiniennes; et le projecteur DLP intégré aide à réduire les artefacts de mouvement.

Le récepteur des lipoprotéines de très basse densité (Vldlr) est une protéine transmembranaire présente dans les cellules endothéliales. Il est exprimé sur les cellules endothéliales vasculaires rétiniennes, les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes et autour de la membrane limite externe^23,24. La néovascularisation sous-rétinienne est le phénotype des souris knockout Vldlr ²³. Par conséquent, les souris knockout Vldlr sont utilisées pour étudier la pathogenèse et le traitement potentiel de la néovascularisation sous-rétinienne. Cet article démontre l’application de l’imagerie OCT pour détecter les lésions rétiniennes chez les souris knockout Vldlr, dans l’espoir de fournir une référence technique pour la recherche sur la rétinopathie dans de petits modèles animaux.

Protocole

Les opérations ont été effectuées à la suite de la Déclaration sur l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology. La conception expérimentale a été approuvée par le comité institutionnel d’éthique animale (comité d’éthique médicale du JSIEC, EC 20171213(4)-P01). Des souris C57BL / 6J âgées de deux mois et des souris knockout Vldlr ont été utilisées dans cette étude. Il y avait 7 souris dans chaque groupe, toutes femelles et pesant de 20 g à 24 g.

1. Conditions expérimentales

1. Assignez les souris à deux groupes: un groupe expérimental composé de souris knockout Vldlr et un groupe témoin composé de souris C57BL / 6J.
2. Nourrissez les souris avec de la nourriture et de l’eau de manière conventionnelle.
3. Élever les souris dans le laboratoire animalier dans des conditions stables de température ambiante (22 °C), d’humidité (50-60%), de cycle lumière-obscurité (12 h-12 h) et d’intensité lumineuse ambiante (350-400 lux).
4. Préparer l’équipement expérimental : tomographie par cohérence optique avec ophtalmoscope laser à balayage confocal (cSLO) pour petits animaux (Figure 1A).
5. Préparer tout le matériel nécessaire à l’expérience (Figure 1B) et peser les souris (Figure 1C).

2. Dossiers d’information

1. Notez les informations : groupe, code, date de naissance, âge, sexe, poids et dosage anesthésique.

3. Démarrage et test de l’instrument

1. Allumez l’ordinateur et démarrez le logiciel.
2. Cliquez sur le bouton Programme de test pour terminer le programme de test.
3. Allumez le thermostat et préchauffez-le à une température de 37 °C.
4. Démarrez la procédure du module OPO après le test du programme.
5. Créez un nouvel objet et remplissez les informations de la souris.
6. Préchauffez la couverture électrique et couvrez-la de serviettes chirurgicales.

4. Anesthésie

1. Utilisez une poudre anesthésique lyophilisée contenant de la tiletamine et du zolazépam pour préparer le mélange anesthésique.
   REMARQUE: Suivez les recommandations du comité local d’éthique animale pour le choix, la posologie et la voie d’administration de l’anesthésie. Anesthésiez l’animal avec un anesthésique qui procurera une immobilité et une perte de perception de la douleur pendant au moins 1 heure, après quoi l’animal récupère rapidement. La posologie doit être basée sur la durée de l’expérience, le poids de l’animal et d’autres facteurs.
2. Anesthésiez l’animal à l’aide du mélange anesthésique préparé. Assurez-vous de garder l’animal au chaud pendant toute la procédure jusqu’à sa récupération.

5. Application de gouttes mydriatiques

1. Obtenez une retenue manuelle de la souris par la peau, faites légèrement saillir le globe oculaire et faites pivoter la tête de la souris avec un œil tourné vers le haut.
2. Appliquer les gouttes mydriatiques pour dilater les pupilles (Figure 2A).
3. Vérifiez la dilatation de la pupille après 10 min.

6. Placement de la souris

1. Placez une souris sur une plate-forme de couverture électrique.
2. Enduisez les deux yeux de gel médical d’hyaluronate de sodium (figure 2B).
3. Vissez une lentille double sphérique 60D (objectif préréglé) sur le dispositif cSLO (Figure 1A-5, 6).
4. Placer une lentille de contact 100 D sur la cornée de la souris, la face concave touchant le gel d’hyaluronate de sodium sur la surface cornéenne (Figure 2C, D et Figure 3A-II).
5. Placez la souris sur la petite plate-forme animale à température constante et gardez l’œil à une distance de 1 à 2 mm de la lentille du dispositif cSLO (Figure 3A).
6. Ajustez l’angle de la lentille de contact avec une pince pour maintenir la pupille au centre de la lentille.
7. Ajustez les ajustements de la tête pour que l’œil soit droit devant.

7. Ophtalmoscope laser confocale à balayage (cSLO)

1. Cliquez sur le bouton OPO , choisissez le module de souris et démarrez le programme cSLO (Figure 4B).
2. Sélectionnez le mode IR (source lumineuse : lumière rouge) et réglez le paramètre (plage : 2047, Figure 4D).
3. Sélectionnez l’œil à examiner (œil droit : figure 4C-1; œil gauche : figure 4C-2).
4. Contrôlez le levier et déplacez lentement la lentille préréglée vers la lentille de contact.
5. Ajustez la valeur dioptrique jusqu’à ce que l’imagerie du pôle postérieur soit dégagée (figure 4E).
6. Faites d’autres ajustements pour aligner l’image du pôle postérieur rétinien, en le centrant sur la tête du nerf optique.

8. Tomographie par cohérence optique (TCO)

1. Démarrez le programme de l’OPO (Figure 4G).
2. Cliquez sur la barre de progression vers le haut et vers le bas jusqu’à ce que l’image de l’OPO s’affiche (Figure 4H).
3. Ajuster les paramètres : Plage Min (Figure 4I) = 0-20, Plage Max (Figure 4J) = 40-60.
4. Ajustez la distance et la direction de position de l’objectif prédéfinies jusqu’à l’obtention d’une image OCT idéale.
5. Sélectionnez la position de numérisation en déplaçant la ligne standard dans le cSLO (Figure 4M).
6. Commencez à scanner à partir de la tête du nerf optique.
7. Collectez des images dans le même ordre pour chaque œil : ligne horizontale : tête du nerf optique → supérieure → inférieure ; Ligne verticale: tête du nerf optique → nasale → temporel.
8. Collectez des images dans quatre directions.
9. Cliquez sur Moyenne pour superposer les signaux d’image cSLO et OPO (Figure 4F et Figure 4O).
10. Cliquez sur le bouton de prise de vue pour acquérir l’image SLO-OCT (Figure 4P).
11. Enregistrez et exportez toutes les images (Figure 4Q, R).

9. La fin de l’expérience (après l’examen de l’OCT)

1. Placez la souris sur la couverture chauffante pour la garder au chaud jusqu’à ce qu’elle se réveille.
   REMARQUE: La souris doit être surveillée jusqu’à ce qu’elle retrouve suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale. L’exposition postopératoire à la lumière vive doit être minimisée.
2. Retirez la lentille de contact 100 D.
3. Appliquez le gel pour les yeux à la lévofloxacine pour protéger la cornée.
4. Replacez la souris dans la cage après son réveil.
   REMARQUE: Assurez-vous que la souris examinée n’est pas retournée à la compagnie d’autres souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.
5. Éteignez le logiciel et éteignez l’ordinateur.
6. Nettoyez la lentille de contact 100 D avec de l’eau; Sécher la lentille.
7. Nettoyez et désinfectez l’environnement.

10. Analyse d’images

1. Comparez les images OCT des souris knockout Vldlr avec celles des souris C57BL/6J.
2. Observer plusieurs positions : balayages verticaux et horizontaux passant par la papille optique ; scintigraphies supérieures, inférieures, nasales et temporales; et les scintigraphies anormales du site de réflexion.
3. Observez l’épaisseur, la forme, la superposition et les lésions de réflectance anormales de la rétine dans chaque image, ainsi que l’interface vitrée de la rétine et du corps vitré.
4. Notez les emplacements, les caractéristiques et le nombre de lésions.

11. Correction de la stratification rétinienne

1. Cliquez sur Load Examination (Examiner la charge) dans l’interface de l’OPO (Figure 5A).
2. Appelez les images de l’OPO d’une souris à partir d’une fenêtre contextuelle.
3. Sélectionner des images : numérisation d’images OCT à travers la papille optique, horizontalement ou verticalement.
4. Double-cliquez sur l’image dans le conteneur multimédia pour l’afficher à l’écran (Figure 5C).
5. Cliquez sur Détection de couche pour effectuer la superposition automatique sur la rétine (Figure 5D).
6. Sélectionnez les lignes de séparation des deux côtés de la couche préparée pour l’analyse (Figure 6D-10).
7. Sélectionnez une ligne de séparation distincte (Figure 6B-6) et cliquez sur Modifier le calque (Figure 6A-1) pour activer la ligne lorsqu’un cercle rouge apparaît (Figure 6B-7).
8. Ajustez l’espacement (figure 6A-4, p. ex., 50) et la plage limite (figure 6A-5, p. ex., 50).
9. Modifier la ligne de démarcation en déplaçant le cercle rouge (comparer la ligne de démarcation verte de la figure 6B et de la figure 6C; La figure 6C montre le résultat modifié).

12. Épaisseur de la stratification rétinienne

1. Cliquez sur le bouton Marqueur de mesure (Figure 6D-9).
2. Sélectionnez la ligne de séparation de la couche à analyser (p. ex., dans la couche nucléaire externe, sélectionnez la 4e^{et la} 5e ligne^{de division dans} la liste) pour afficher la limite de la couche sur l’image de la TCO (figure 6D-10).
3. Sélectionnez Connect with Layer (Figure 6D-11) et Stay Connected on Move (Connexion avec la couche) (Figure 6D-12).
4. Sélectionnez la zone pour afficher les résultats (la colonne sélectionnée est colorée, Figure 6D-13).
5. Cliquez sur la position à analyser sur l’image de l’OPO pour faire apparaître la ligne de mesure (perpendiculaire à l’axe horizontal et cohérente avec la couleur de la zone résultante) (Figure 6D-14).
6. Cliquez sur la colonne suivante pour la mesure suivante et affichez les données précédentes (Figure 6E-15).
7. Lire la valeur Vert (épaisseur de la position mesurée) dans la ligne Longueur en μm (tissu) (Figure 6E, rectangle rouge).
8. Cliquez sur Supprimer le marqueur (Figure 6E-16) et le Nouveau marqueur (Figure 6E-17) pour effectuer un nouveau test afin que les résultats couvrent les données d’origine (si une nouvelle mesure est nécessaire).
9. Appuyez sur Print Scr ( Imprimer Scr) sur le clavier pour enregistrer des captures d’écran ou cliquez sur Save Examination (Enregistrer l’examen ) pour enregistrer directement (Figure 5H).
10. Entrez les données dans une feuille de calcul ou un logiciel statistique pour l’analyse statistique.

13. Mesure de l’épaisseur totale de la rétine

1. Sélectionnez la ligne 1 (ILM, membrane limitante interne, figure 7B) et la ligne 7 (OS-RPE, OS : segments photorécepteurs externes; EPR : couche épithéliale pigmentaire rétinienne, figure 7C) dans la liste dans le coin supérieur droit.
   REMARQUE: L’épaisseur rétinienne complète signifie l’épaisseur de la couche de neurépithélium rétinien, qui est la rétine entre ILM et OS-RPE sur OCT).
2. Mesurer l’épaisseur rétinienne des deux côtés de la papille optique à un intervalle spécifique.
   1. Par exemple : à partir de l’aspect de la structure rétinienne au bord de la papille optique, mesurer 4 valeurs avec un espacement de 200 μm de la règle horizontale (Figure 7G, H).
3. Enregistrez toutes les valeurs mesurées dans une feuille de calcul.
4. Utilisez plusieurs tests t (un par ligne) pour comparer les valeurs mesurées de chaque position correspondante dans les deux groupes.

Résultats

Grâce aux scans haute résolution de l’OCT, les couches de la rétine de la souris peuvent être observées et les réflexions anormales et leurs emplacements exacts peuvent être identifiés. Les images OCT rétiniennes de souris knockout Vldlr et de souris C57BL / 6J ont été comparées dans cette étude. Les images OCT de toutes les souris C57BL/6J montraient différentes couches rétiniennes avec une réflectivité différente, et la démarcation était claire (Figure 8D). E...

Discussion

Dans cette étude, l’imagerie OCT à l’aide d’un système d’imagerie rétinienne de petits animaux a été appliquée pour évaluer les changements rétiniens chez les souris knockout Vldlr , qui démontrent un décollement postérieur du vitré incomplet, une néovascularisation sous-rétinienne et un amincissement de l’épaisseur rétinienne. L’OCT est une méthode d’imagerie non invasive permettant d’examiner l’état de la rétine in vivo. La plupart des appareils OCT sont conçus p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dpt contact lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel	Alcon	16H01E
Microliter syringes	Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 µL
Povidone iodine solution	Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	Santen Pharmaceutical Co.,LTD		5 mg/mL
Xylazin	Sigma	X1251-5G	5 g
Zoletil 50	Virbac.S.A	7FRPA	Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg