Applicazione della tomografia a coerenza ottica a un modello murino di retinopatia

Riepilogo

Qui, descriviamo una tecnica di imaging in vivo che utilizza la tomografia a coerenza ottica per facilitare la diagnosi e la misurazione quantitativa della retinopatia nei topi.

Abstract

La tomografia a coerenza ottica (OCT) offre un metodo non invasivo per la diagnosi di retinopatia. La macchina OCT può acquisire immagini della sezione trasversale retinica da cui è possibile calcolare lo spessore della retina. Sebbene l'OCT sia ampiamente utilizzato nella pratica clinica, la sua applicazione nella ricerca di base non è così prevalente, specialmente nei piccoli animali come i topi. A causa delle piccole dimensioni dei loro bulbi oculari, è difficile condurre esami di imaging del fondo nei topi. Pertanto, è necessario un sistema di imaging retinico specializzato per ospitare l'imaging OCT su piccoli animali. Questo articolo illustra un sistema specifico per i piccoli animali per le procedure di esame dello PTOM e un metodo dettagliato per l'analisi delle immagini. Vengono presentati i risultati dell'esame OCT retinico di topi knockout a bassissima densità del recettore delle lipoproteine (Vldlr) e topi C57BL/6J. Le immagini OCT dei topi C57BL / 6J hanno mostrato strati retinici, mentre quelle di topi knockout Vldlr hanno mostrato neovascolarizzazione sottoretinica e assottigliamento della retina. In sintesi, l'esame OCT potrebbe facilitare il rilevamento non invasivo e la misurazione della retinopatia nei modelli murini.

Introduzione

La tomografia a coerenza ottica (OCT) è una tecnica di imaging in grado di fornire in vivo l'alta risoluzione e l'imaging trasversale per il tessuto 1,2,3,4,5,6,7,8, in particolare per l'esame non invasivo nella retina 9,10,11,12 . Può anche essere utilizzato per quantificare alcuni importanti biomarcatori, come lo spessore della retina e lo spessore dello strato di fibre nervose retiniche. Il principio dell'OCT è la riflettometria a coerenza ottica, che ottiene informazioni trasversali sui tessuti dalla coerenza della luce riflessa da un campione e la converte in forma grafica o digitale attraverso un sistema informatico⁷. L'OCT è ampiamente utilizzato nelle cliniche oftalmologiche come strumento essenziale per la diagnosi, il follow-up e la gestione per i pazienti con disturbi della retina. Può anche fornire informazioni sulla patogenesi delle malattie della retina.

Oltre alle applicazioni cliniche, l'OCT è stato utilizzato anche negli studi sugli animali. Sebbene la patologia sia il gold standard della caratterizzazione morfologica, l'OCT ha il vantaggio dell'imaging non invasivo in vivo e del follow-up longitudinale. Inoltre, è stato dimostrato che l'OCT è ben correlato con l'istopatologia nei modelli animali di retinopatia 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Il topo è l'animale più comunemente usato negli studi biomedici. Tuttavia, i suoi piccoli bulbi oculari rappresentano una sfida tecnica per condurre l'imaging OCT nei topi.

Rispetto all'OCT utilizzato per la prima volta per l'imaging retinico nei topi^21,22, l'OCT nei piccoli animali è stato ora ottimizzato rispetto ai sistemi hardware e software. Ad esempio, OCT, in combinazione con il tracker, riduce significativamente il rapporto segnale-rumore; Gli aggiornamenti del sistema software OCT consentono di rilevare automaticamente più strati retinici; e il proiettore DLP integrato aiuta a ridurre gli artefatti di movimento.

Il recettore della lipoproteina a bassissima densità (Vldlr) è una proteina transmembrana nelle cellule endoteliali. È espresso sulle cellule endoteliali vascolari retiniche, sulle cellule epiteliali pigmentate retiniche e intorno alla membrana limitante esterna^23,24. La neovascolarizzazione sottoretinica è il fenotipo dei topi knockout Vldlr ²³. Pertanto, i topi knockout Vldlr vengono utilizzati per studiare la patogenesi e la potenziale terapia della neovascolarizzazione sottoretinica. Questo articolo dimostra l'applicazione dell'imaging OCT per rilevare lesioni retiniche nei topi knockout Vldlr, sperando di fornire qualche riferimento tecnico per la ricerca sulla retinopatia in piccoli modelli animali.

Protocollo

Le operazioni sono state eseguite a seguito della Dichiarazione sull'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia. Il progetto sperimentale è stato approvato dal Comitato etico istituzionale per gli animali (Medical Ethics Committee of JSIEC, EC 20171213(4)-P01). In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL / 6J di due mesi e topi knockout Vldlr . C'erano 7 topi in ogni gruppo, tutti femmine e pesavano da 20 g a 24 g.

1. Condizioni sperimentali

1. Assegnare i topi a due gruppi: un gruppo sperimentale composto da topi knockout Vldlr e un gruppo di controllo composto da topi C57BL / 6J.
2. Dai da mangiare ai topi con cibo e acqua in modo convenzionale.
3. Allevare i topi nel laboratorio animale in condizioni stabili di temperatura ambiente (22 ° C), umidità (50-60%), ciclo luce-buio (12 h-12 h) e intensità luminosa ambiente (350-400 lux).
4. Preparare l'attrezzatura sperimentale: tomografia a coerenza ottica con oftalmoscopio laser a scansione confocale (cSLO) per piccoli animali (Figura 1A).
5. Preparare tutti i materiali necessari per l'esperimento (Figura 1B) e pesare i topi (Figura 1C).

2. Registrazioni informative

1. Registra le informazioni: gruppo, codice, data di nascita, età, sesso, peso e dosaggio anestetico.

3. Avviamento e collaudo dello strumento

1. Accendere il computer e avviare il software.
2. Fare clic sul pulsante Programma di test per completare il programma di test.
3. Accendere il termostato e preriscaldarlo alla temperatura di 37 °C.
4. Avviare la procedura del modulo dello Strumento di personalizzazione di Office dopo il test del programma.
5. Crea un nuovo soggetto e inserisci le informazioni del mouse.
6. Preriscaldare la coperta elettrica e coprirla con asciugamani chirurgici.

4. Anestesia

1. Utilizzare polvere anestetica liofilizzata contenente Tiletamina e Zolazepam per preparare la miscela anestetica.
   NOTA: Seguire le raccomandazioni del comitato etico animale locale per la scelta, il dosaggio e la via di somministrazione dell'anestesia. Anestetizzare l'animale con un anestetico che fornirà immobilità e perdita di percezione del dolore per almeno 1 ora, dopo di che l'animale si riprende rapidamente. Il dosaggio deve essere basato sulla durata del tempo di esperimento, sul peso dell'animale e su altri fattori.
2. Anestetizzare l'animale usando la miscela anestetica preparata. Assicurarsi di mantenere l'animale caldo durante l'intera procedura fino al recupero.

5. Applicazione di gocce midriatiche

1. Ottenere il contenimento manuale del mouse per la collottola, far sporgere leggermente il bulbo oculare e ruotare la testa del mouse con un occhio rivolto verso l'alto.
2. Applicare le gocce midriatiche per dilatare le pupille (Figura 2A).
3. Controllare la dilatazione della pupilla dopo 10 minuti.

6. Posizionamento del mouse

1. Posiziona un mouse su una piattaforma elettrica.
2. Rivestire entrambi gli occhi con gel ialuronato di sodio medicale (Figura 2B).
3. Avvitare una doppia lente sferica 60 D (lente preimpostata) sul dispositivo cSLO (Figura 1A-5, 6).
4. Posizionare una lente a contatto 100 D sulla cornea del topo con il lato concavo che tocca il gel ialuronato di sodio sulla superficie corneale (Figura 2C, D e Figura 3A-II).
5. Posizionare il mouse sulla piccola piattaforma animale a temperatura costante e tenere l'occhio a 1-2 mm di distanza dall'obiettivo del dispositivo cSLO (Figura 3A).
6. Regolare l'angolo della lente a contatto con una pinza per mantenere la pupilla al centro della lente.
7. Perfeziona le regolazioni della testa per rendere l'occhio rivolto dritto in avanti.

7. Oftalmoscopio laser a scansione confocale (cSLO)

1. Fare clic sul pulsante dello Strumento di personalizzazione di Office , scegliere il modulo mouse e avviare il programma cSLO (Figura 4B).
2. Selezionare la modalità IR (sorgente luminosa: luce rossa) e regolare il parametro (intervallo: 2047, Figura 4D).
3. Selezionare l'occhio da esaminare (occhio destro: figura 4C-1; occhio sinistro: figura 4C-2).
4. Controllare la leva e spostare lentamente la lente preimpostata verso la lente a contatto.
5. Regolare il valore diottrico fino a quando l'imaging del polo posteriore è chiaro (Figura 4E).
6. Effettuare ulteriori regolazioni per allineare l'immagine del polo posteriore retinico, centrandola sulla testa del nervo ottico.

8. Tomografia a coerenza ottica (OCT)

1. Avviare il programma dello Strumento di personalizzazione di Office (Figura 4G).
2. Fare clic sull'indicatore di stato verso l'alto e verso il basso finché non viene visualizzata l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office (Figura 4H).
3. Regolare i parametri: Range Min (Figura 4I) = 0-20, Range Max (Figura 4J) = 40-60.
4. Regolare la distanza dell'obiettivo preimpostata e la direzione della posizione fino a ottenere un'immagine OCT ideale.
5. Selezionare la posizione di scansione spostando la linea standard nel cSLO (Figura 4M).
6. Avviare la scansione dalla testa del nervo ottico.
7. Raccogli le immagini nello stesso ordine per ciascun occhio: linea orizzontale: testa del nervo ottico → superiore → inferiore; Linea verticale: testa del nervo ottico → nasale → temporale.
8. Raccogli immagini da quattro direzioni.
9. Fare clic su Media per sovrapporre i segnali immagine cSLO e OCT (Figura 4F e Figura 4O).
10. Fare clic sul pulsante di ripresa per acquisire l'immagine SLO-OCT (Figura 4P).
11. Salvare ed esportare tutte le immagini (Figura 4Q, R).

9. La fine dell'esperimento (dopo l'esame OCT)

1. Posizionare il mouse sulla coperta elettrica per tenerlo caldo fino al risveglio.
   NOTA: Il topo deve essere monitorato fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale. L'esposizione postoperatoria alla luce intensa deve essere ridotta al minimo.
2. Rimuovere la lente a contatto 100 D.
3. Applicare il gel per gli occhi levofloxacina per proteggere la cornea.
4. Rimetti il mouse nella gabbia dopo che si è svegliato.
   NOTA: Assicurarsi che il topo esaminato non venga restituito alla compagnia di altri topi fino a quando non si è completamente ristabilito.
5. Spegnere il software e spegnere il computer.
6. Pulire la lente a contatto 100 D con acqua; Asciugare la lente.
7. Pulire e disinfettare l'ambiente.

10. Analisi delle immagini

1. Confronta le immagini OCT dei topi knockout Vldlr con quelle dei topi C57BL / 6J.
2. Osservare più posizioni: scansioni verticali e orizzontali che passano attraverso la papilla ottica; scansioni superiori, inferiori, nasali e temporali; e scansioni anomale del sito di riflessione.
3. Osservare lo spessore, la forma, la stratificazione e le lesioni anomale della riflettanza della retina in ogni immagine, nonché l'interfaccia vitreale della retina e del corpo vitreo.
4. Registrare le posizioni, le caratteristiche e il numero di lesioni.

11. Correzione della stratificazione retinica

1. Fare clic su Esame carico (Load Examination ) nell'interfaccia dello Strumento di personalizzazione di Office (Figura 5A).
2. Richiamare le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office di un mouse da una finestra popup.
3. Seleziona immagini: scansione delle immagini OCT attraverso la papilla ottica, orizzontalmente o verticalmente.
4. Fare doppio clic sull'immagine nel contenitore multimediale per visualizzarla sullo schermo (Figura 5C).
5. Fare clic su Layer Detection (Rilevamento strati ) per completare la stratificazione automatica sulla retina (Figura 5D).
6. Selezionate le linee divisorie su entrambi i lati del livello preparato per l'analisi (Figura 6D-10).
7. Selezionate una linea divisoria separata (Figura 6B-6) e fate clic su Modifica livello (Figura 6A-1) per attivare la linea quando viene visualizzato un cerchio rosso (Figura 6B-7).
8. Regolare la spaziatura (Figura 6A-4, ad esempio, 50) e l'intervallo limite (Figura 6A-5, ad esempio, 50).
9. Modificare la linea di demarcazione spostando il cerchio rosso (confrontare la linea di demarcazione verde nella Figura 6B e nella Figura 6C; La Figura 6C mostra il risultato modificato).

12. Spessore della laminazione retinica

1. Fare clic sul pulsante Marcatore misura (Figura 6D-9).
2. Selezionare la linea di demarcazione dello strato da analizzare (ad esempio, nello strato nucleare esterno, selezionare la 4° e la 5^° linea di divisione nell'elenco) per visualizzare il limite dello strato sull'immagine OCT (Figura 6D-10).
3. Selezionare Connetti con layer (Figura 6D-11) e Rimani connesso in movimento (Figura 6D-12).
4. Selezionare l'area in cui visualizzare i risultati (la colonna selezionata è colorata, Figura 6D-13).
5. Fare clic sulla posizione da analizzare sull'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office per visualizzare la linea di misurazione (perpendicolare all'asse orizzontale e coerente con il colore dell'area risultante) (Figura 6D-14).
6. Fare clic sulla colonna successiva per la misurazione successiva e visualizzare i dati precedenti (Figura 6E-15).
7. Leggere il valore Vert (spessore della posizione misurata) nella riga Lunghezza in μm (tessuto) (Figura 6E, rettangolo rosso).
8. Fare clic su Elimina marcatore (Figura 6E-16) e Nuovo marcatore (Figura 6E-17) per ripetere il test in modo che i risultati coprano i dati originali (se è necessaria una nuova misurazione).
9. Premere Stampa Scr sulla tastiera per salvare le schermate oppure fare clic su Salva esame per salvare direttamente (Figura 5H).
10. Inserisci i dati in un foglio di calcolo o in un software statistico per l'analisi statistica.

13. Misurazione dello spessore retinico completo

1. Selezionare la linea 1 (ILM, membrana limitante interna, Figura 7B) e la linea 7 (OS-RPE, OS: segmenti fotorecettori esterni; RPE: strato epiteliale pigmentato retinico, Figura 7C) nell'elenco nell'angolo in alto a destra.
   NOTA: Lo spessore completo della retina indica lo spessore dello strato di neurepitelio retinico, che è la retina tra ILM e OS-RPE su OCT).
2. Misurare lo spessore retinico su entrambi i lati della papilla ottica ad un intervallo specifico.
   1. Ad esempio: dall'aspetto della struttura retinica sul bordo della papilla ottica, misurare 4 valori con spaziatura di 200 μm del righello orizzontale (Figura 7G, H).
3. Registrare tutti i valori misurati in un foglio di calcolo.
4. Utilizzare più test t (uno per riga) per confrontare i valori misurati di ciascuna posizione corrispondente in entrambi i gruppi.

Risultati

Grazie alle scansioni ad alta risoluzione dell'OCT, è possibile osservare gli strati della retina del topo e identificare riflessi anomali e le loro posizioni esatte. Le immagini OCT retiniche di topi knockout Vldlr e topi C57BL / 6J sono state confrontate in questo studio. Le immagini OCT di tutti i topi C57BL / 6J hanno mostrato vari strati retinici con riflettività diversa e la demarcazione era chiara (Figura 8D). Al contrario, tutti i topi knockout di Vldlr hanno most...

Discussione

In questo studio, l'imaging OCT utilizzando un sistema di imaging retinico di piccoli animali è stato applicato per valutare i cambiamenti retinici nei topi knockout Vldlr , che dimostrano distacco posteriore del vitreo incompleto, neovascolarizzazione sottoretinica e assottigliamento dello spessore retinico. OCT è un metodo di imaging non invasivo per esaminare la condizione della retina in vivo. La maggior parte dei dispositivi OCT sono progettati per l'esame oculistico umano. Le dimensioni dell'app...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dpt contact lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel	Alcon	16H01E
Microliter syringes	Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 µL
Povidone iodine solution	Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	Santen Pharmaceutical Co.,LTD		5 mg/mL
Xylazin	Sigma	X1251-5G	5 g
Zoletil 50	Virbac.S.A	7FRPA	Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg