Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Resumen

La microglía, las células inmunes innatas residentes en el cerebro, son las principales respuestas a la inflamación o lesión en el sistema nervioso central (SNC). La microglía se puede dividir en estado de reposo y estado activado y puede cambiar rápidamente de estado en respuesta al microambiente del cerebro. La microglía se activará bajo diferentes condiciones patológicas y exhibirá diferentes fenotipos. Además, hay muchos subgrupos diferentes de microglía activada y una gran heterogeneidad entre los diferentes subgrupos. La heterogeneidad depende principalmente de la especificidad molecular de la microglía. Los estudios han revelado que la microglía se activará y jugará un papel importante en el proceso patológico de la desmielinización inflamatoria. Para comprender mejor las características de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes como la esclerosis múltiple y el trastorno del espectro de la neuromielitis óptica, proponemos un protocolo de clasificación microglial primaria perilesional. Este protocolo utiliza la clasificación de células activadas magnéticamente columnares (MACS) para obtener microglía primaria altamente purificada y preservar las características moleculares de la microglía para investigar los efectos potenciales de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes.

Introducción

La microglía se origina a partir de progenitores de saco vitelino, que llegan al cerebro embrionario muy temprano y participan en el desarrollo del SNC ^1,2. Por ejemplo, están involucrados en la poda sináptica³ y regulan el crecimiento axonal⁴. Secretan factores que promueven la supervivencia neuronal y ayudan a la localización neuronal⁵. Al mismo tiempo, están involucrados en la eliminación de células anormales y células apoptóticas para garantizar el desarrollo normal del cerebro⁶. Además, como las células inmunocompetentes del cerebro, la microglía vigila continuamente el parénquima cerebral para eliminar las células muertas, las sinapsis disfuncionales y los desechos celulares⁷. Se ha demostrado que la activación microglial juega un papel importante en una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades inflamatorias desmielinizantes, las enfermedades neurodegenerativas y los tumores cerebrales. La microglía activada en la esclerosis múltiple (EM) contribuye a la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y a la regeneración de la mielina al envolver los restos de mielina⁸.

En la enfermedad de Alzheimer (EA), la acumulación de beta amiloide (Aβ) activa la microglía, que afecta las funciones fagocíticas e inflamatorias de la microglía⁹. La microglía activada en el tejido del glioma, llamada microglía asociada al glioma (GAM), puede regular la progresión del glioma y, en última instancia, afectar el pronóstico de los pacientes¹⁰. La activación altera profundamente el transcriptoma microglial, lo que resulta en cambios morfológicos, expresión de receptores inmunes, aumento de la actividad fagocítica y aumento de la secreción de citoquinas¹¹. Existen diferentes subconjuntos de microglía activada en enfermedades neurodegenerativas como la microglía asociada a la enfermedad (DAM), la microglía de respuesta activada (ARM) y el fenotipo neurodegenerativo microglial (MGnD)⁸.

Del mismo modo, múltiples subconjuntos funcionales dinámicos de microglia también coexisten en el cerebro en enfermedades desmielinizantes inflamatorias¹². Comprender la heterogeneidad entre los diferentes subconjuntos de microglía es esencial para investigar la patogénesis de las enfermedades inflamatorias desmielinizantes y encontrar sus posibles estrategias terapéuticas. La heterogeneidad de la microglía depende principalmente de la especificidad molecular⁸. Es esencial describir con precisión las alteraciones moleculares de la microglía para el estudio de la heterogeneidad. Los avances en la tecnología de secuenciación de ARN unicelular (RNA-seq) han permitido identificar las características moleculares de la microglía activada en condiciones patológicas¹³. Por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones celulares es fundamental para una mayor investigación de estas células diana en condiciones específicas.

Los estudios realizados para comprender las características y funciones de la microglía suelen ser estudios in vitro, ya que se ha encontrado que se puede preparar y cultivar un gran número de microglía primaria a partir de cerebros de cachorros de ratón (1-3 días de edad), que se adhieren a los matraces de cultivo y crecen en la superficie plástica con otras células gliales mixtas. Posteriormente, la microglía pura se puede aislar en función de la diferente adhesividad de las células gliales mixtas^14,15. Sin embargo, este método solo puede aislar la microglía del cerebro perinatal y toma varias semanas. Las variables potenciales en el cultivo celular pueden influir en las características microgliales como la expresión molecular¹⁶. Además, la microglía aislada por estos métodos solo puede participar en experimentos in vitro simulando las condiciones de las enfermedades del SNC y no puede representar las características y funciones de la microglía en estados de enfermedad in vivo. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos para aislar la microglía del cerebro del ratón adulto.

La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la separación magnética son dos métodos ampliamente utilizados, aunque tienen sus propias limitaciones diferentes 16,17,18,19. Sus respectivas ventajas y desventajas se contrastarán en la sección de discusión. La maduración de la tecnología MACS ofrece la posibilidad de purificar rápidamente las células. Huang et al. han desarrollado un método conveniente para etiquetar lesiones desmielinizantes en cerebros²⁰. Combinando estos dos enfoques técnicos, proponemos un protocolo de separación magnética columnar CD11b rápido y eficiente, proporcionando una descripción paso a paso para aislar la microglía alrededor de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones adultos y preservar las características moleculares de la microglía. Las lesiones desmielinizantes focales fueron causadas por la inyección estereotáctica de 2 μL de solución de lisolecitina (1% LPC en NaCl al 0,9%) en el cuerpo calloso 3 días antes de iniciar el protocolo²¹. Este protocolo sienta las bases para realizar el siguiente paso en experimentos in vitro. Además, este protocolo ahorra tiempo y sigue siendo factible para su uso generalizado en varios experimentos.

Protocolo

Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado Animal del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, China.

1. Materiales

1. Prepare las siguientes soluciones antes de comenzar el protocolo.
   1. Prepare el tampón de carga agregando suero fetal bovino (FBS, 2%) a solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   2. Agregue el tinte rojo neutro (NR) (1% final) a PBS.
2. Prepare las siguientes soluciones utilizando el kit de disociación cerebral para adultos disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).
   1. Para preparar la mezcla de enzimas 1, pipetee 1,9 ml de Buffer Z y 50 μL de enzima P en un tubo centrífugo de 15 ml.
   2. Para preparar la mezcla de enzimas 2, pipetee 20 μL de Buffer Y y 10 μL de Enzima A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Prepare la solución de eliminación de escombros.

2. Perfusión y disección de ratones

1. Inyecte por vía intraperitoneal (i.p.) al ratón 500 μL de colorante NR al 1% en PBS 2-3 h antes de la anestesia.
   NOTA: La inyección intraperitoneal de NR en modelos de ratón desmielinizantes ayuda a discernir las lesiones (Figura 1).
2. Anestesiar al ratón con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) y asegurarse de que el ratón se anestesia con éxito examinando las respuestas al dolor.
3. Abra la cavidad torácica del ratón y exponga el corazón.
4. Corte una pequeña esquina de la aurícula derecha con cuidado y perfunda intracárdicamente al ratón con 20-30 ml de PBS frío del ventrículo izquierdo.
5. Decapitar al ratón bajo anestesia.
6. Abra el cráneo del ratón y libere cuidadosamente el cerebro del cráneo.
7. Transfiera el cerebro al molde de corte de cerebro de ratón y corte el cerebro en rodajas de 0,1 cm.
8. Retire las rodajas cerebrales y colóquelas en PBS frío en una placa de Petri (60/15 mm). Microdisectar las lesiones marcadas por el tinte NR alrededor del cuerpo calloso bajo un estereomicroscopio utilizando pinzas microquirúrgicas.
   NOTA: Asegúrese de que el tejido disecado sea lo más completo posible para facilitar la transferencia posterior; el progreso total de la disección debe completarse en 2 h.
9. Transfiera el tejido disecado a tubos centrífugos de 15 ml que contengan la cantidad adecuada de tampón de carga en frío.
   NOTA: Agrupe el tejido del cuerpo calloso de 2-3 ratones en un tubo como una muestra.

3. Disociación tisular

1. Centrifugar el tejido diseccionado a 300 ×g durante 30 s (después de alcanzar esta velocidad) para recoger la muestra en la parte inferior del tubo.
2. Precalentar la mezcla de enzimas 1 y mezclar las enzimas de 2 a 37 °C en una incubadora.
3. Añadir 1.950 μL de mezcla de enzimas precalentadas 1 a una muestra y digerir en una incubadora a 37 °C durante 5 min.
4. Añadir 30 μL de mezcla de enzimas precalentadas 2 y mezclar suavemente.
5. Digerir en una incubadora a 37 °C durante 15 min y mezclar suavemente cada 5 min.
6. Agregue 4 ml de PBS frío al tubo después de la digestión y agite suavemente.
7. Coloque filtros de 70 μm en tubos centrífugos de 50 ml y pretuite los filtros con 500 μL de PBS frío. Filtre el tejido disociado pasando las muestras de tejido digerido a través de los filtros y transfiera la suspensión filtrada en el tubo centrífugo de 50 ml a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   NOTA: Omita este paso si la cantidad de tejido es demasiado pequeña.
8. Centrifugar las muestras de tejido filtrado a 300 ×g durante 10 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante lenta y completamente.
   NOTA: Todos los pasos deben realizarse sobre hielo excepto la digestión enzimática.

4. Eliminación de escombros

1. Resuspend el pellet celular suavemente con 1.550 μL de PBS frío.
2. Agregue 450 μL de solución fría para eliminar los desechos y mezcle bien.
3. Superponga la mezcla anterior muy lenta y suavemente con 2 x 1 ml de PBS frío utilizando una pipeta de 1.000 μL.
   NOTA: Incline el tubo de la centrífuga en 45 ° y agregue lentamente PBS a lo largo de la pared del tubo con la pipeta.
4. Transfiera el tubo lenta y suavemente a una centrífuga y gire a 4 °C y 3.000 × g durante 10 min.
5. Busque tres capas después de la centrifugación. Aspirar las dos capas superiores completamente utilizando una pipeta de 1.000 μL (Figura 2).
6. Llene el tubo hasta 5 ml con tampón de carga en frío e invierta suavemente el tubo tres veces.
7. Centrifugadora a 4 °C y 1.000 × g durante 10 min. Aspire el sobrenadante por completo y evite interrumpir el gránulo celular.

5. Separación magnética de células microgliales

1. Resuspend el pellet celular con 90 μL de tampón de carga y agregue 10 μL de perlas CD11b (Microglia).
2. Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.
3. Añadir 1 ml de tampón de carga y pipetear el líquido suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL para lavar las células después de la incubación. Centrifugar las células a 4 °C y 300 × g durante 10 min y aspirar el sobrenadante por completo para eliminar las perlas no unidas.
4. Resuspendir las celdas en 500 μL de tampón de carga.
5. Coloque la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético.
6. Enjuague la columna con 500 μL de tampón de carga para proteger las células y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética basada en el protocolo del fabricante.
7. Aplique la suspensión de celdas en la columna MS y deseche el flujo que contiene celdas sin etiquetar.
8. Agregue 500 μL de búfer de carga a la columna tres veces para eliminar las celdas que se adhieren a la pared de la columna y descartar el flujo.
   NOTA: Solo agregue un nuevo búfer de carga para lavar cuando el depósito de columna esté completamente vacío.
9. Retire la columna del separador después de lavar la columna y colóquela en un tubo centrífugo de 15 ml.
10. Agregue 1 ml de búfer de carga en la columna y empuje el émbolo hacia la parte inferior de la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente. Repita este paso tres veces para recolectar completamente las células marcadas magnéticamente.

Resultados

La microglía aislada con perlas CD11b tiene una alta pureza
Las células microgliales alrededor de las lesiones en modelos de ratón de desmielinización se aislaron utilizando el protocolo mencionado anteriormente y se probaron mediante citometría de flujo. Las células se marcan fluorescentemente con ISOtiocianato de CD11b-fluoresceína (FITC) y CD45-aloficocianina (APC) para determinar la microglía en la citometría de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Existen múltiples lit...

Discusión

El protocolo propone un método para aislar la microglía alrededor de las lesiones desmielinizantes, que puede ayudar a estudiar las características funcionales de la microglía en las enfermedades inflamatorias desmielinizantes. La microglía capturada con perlas CD11b exhibe una alta pureza y viabilidad. Los pasos críticos en el protocolo incluyen la localización precisa de los focos y la purificación microglial óptima. En el paso de protocolo 2.1, es necesario inyectar la solución NR 2 h antes de sacrificar el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Micro Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011500
70 µm Filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-107-677
C57BL/6J Mice	SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse	Miltenyi Biotec	130-093-634
Fetal Bovine Serum	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BD Biosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Neutral Red	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte Flow Cytometer	Agilent		A system consisting of various parts
NovoExpress	Agilent	1.4.1
PBS	BOSTER	PYG0021
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P-010
Stereomicroscope	MshOt	MZ62