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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

Abstract

Le microglia, le cellule immunitarie innate residenti nel cervello, sono i principali rispondenti all'infiammazione o alle lesioni nel sistema nervoso centrale (SNC). La microglia può essere suddivisa in stato di riposo e stato attivato e può cambiare rapidamente stato in risposta al microambiente del cervello. Le microglia saranno attivate in diverse condizioni patologiche e presenteranno fenotipi diversi. Inoltre, ci sono molti sottogruppi diversi di microglia attivate e una grande eterogeneità tra diversi sottogruppi. L'eterogeneità dipende principalmente dalla specificità molecolare della microglia. Gli studi hanno rivelato che la microglia sarà attivata e svolgerà un ruolo importante nel processo patologico di demielinizzazione infiammatoria. Per comprendere meglio le caratteristiche della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti come la sclerosi multipla e il disturbo dello spettro della neuromielite ottica, proponiamo un protocollo di smistamento microgliale primario perilesionale. Questo protocollo utilizza il cartomanziamento cellulare attivato magneticamente colonnare (MACS) per ottenere microglia primarie altamente purificate e preservare le caratteristiche molecolari della microglia per studiare i potenziali effetti della microglia nelle malattie demielinizzanti infiammatorie.

Introduzione

Le microglia provengono da progenitori del sacco vitellino, che raggiungono il cervello embrionale molto presto e partecipano allo sviluppo del SNC 1,2. Ad esempio, sono coinvolti nella potatura sinaptica3 e nella regolazione della crescita assonale4. Secernono fattori che promuovono la sopravvivenza neuronale e aiutano la localizzazione neuronale5. Allo stesso tempo, sono coinvolti nella rimozione di cellule anormali e cellule apoptotiche per garantire il normale sviluppo del cervello6. Inoltre, come cellule immuno-competenti del cervello, le microglia sorvegliano continuamente il parenchima cerebrale per eliminare le cellule morte, le sinapsi disfunzionali e i detriti cellulari7. È stato dimostrato che l'attivazione microgliale svolge un ruolo importante in una varietà di malattie, tra cui malattie infiammatorie demielinizzanti, malattie neurodegenerative e tumori cerebrali. Le microglia attivate nella sclerosi multipla (SM) contribuiscono alla differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) e alla rigenerazione della mielina inghiottendo i detritimielinici 8.

Nella malattia di Alzheimer (AD), l'accumulo di amiloide-beta (Aβ) attiva la microglia, che colpisce le funzioni fagocitiche e infiammatorie della microglia9. La microglia attivata nel tessuto del glioma, chiamata microglia associata al glioma (GAM), può regolare la progressione del glioma e, infine, influenzare la prognosi dei pazienti10. L'attivazione altera profondamente il trascrittoma microgliale, con conseguenti cambiamenti morfologici, espressione dei recettori immunitari, aumento dell'attività fagocitica e aumento della secrezione di citochine11. Esistono diversi sottoinsiemi di microglia attivate nelle malattie neurodegenerative come la microglia associata alla malattia (DAM), la microglia a risposta attivata (ARM) e il fenotipo neurodegenerativo microgliale (MGnD)8.

Allo stesso modo, più sottoinsiemi funzionali dinamici di microglia coesistono anche nel cervello nelle malattie infiammatorie demielinizzanti12. Comprendere l'eterogeneità tra diversi sottoinsiemi di microglia è essenziale per studiare la patogenesi delle malattie demielinizzanti infiammatorie e per trovare le loro potenziali strategie terapeutiche. L'eterogeneità della microglia dipende principalmente dalla specificità molecolare8. È essenziale descrivere accuratamente le alterazioni molecolari della microglia per lo studio dell'eterogeneità. I progressi nella tecnologia di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (RNA-seq) hanno permesso l'identificazione delle caratteristiche molecolari della microglia attivata in condizioni patologiche13. Pertanto, la capacità di isolare le popolazioni cellulari è fondamentale per ulteriori indagini su queste cellule bersaglio in condizioni specifiche.

Gli studi condotti per comprendere le caratteristiche e le funzioni della microglia sono di solito studi in vitro, poiché è stato riscontrato che un gran numero di microglia primarie possono essere preparate e coltivate dal cervello del cucciolo di topo (1-3 giorni), che si attaccano ai palloni di coltura e crescono sulla superficie plastica con altre cellule gliali miste. Successivamente, la microglia pura può essere isolata in base alla diversa adesività delle cellule gliali miste14,15. Tuttavia, questo metodo può solo isolare la microglia dal cervello perinatale e richiede diverse settimane. Le potenziali variabili in coltura cellulare possono influenzare le caratteristiche microgliali come l'espressione molecolare16. Inoltre, le microglia isolate con questi metodi possono partecipare solo a esperimenti in vitro simulando le condizioni delle malattie del SNC e non possono rappresentare le caratteristiche e le funzioni della microglia negli stati di malattia in vivo. Pertanto, è necessario sviluppare metodi per isolare la microglia dal cervello del topo adulto.

Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la separazione magnetica sono due metodi ampiamente utilizzati, sebbene abbiano i loro diversi limiti 16,17,18,19. I loro rispettivi vantaggi e svantaggi saranno contrastati nella sezione di discussione. La maturazione della tecnologia MACS offre la possibilità di purificare rapidamente le cellule. Huang et al. hanno sviluppato un metodo conveniente per etichettare le lesioni demielinizzanti nel cervello20. Combinando questi due approcci tecnici, proponiamo un protocollo di separazione magnetica CD11b colonnare rapido ed efficiente, fornendo una descrizione passo-passo per isolare la microglia attorno a lesioni demielinizzanti nel cervello di topo adulto e preservare le caratteristiche molecolari della microglia. Le lesioni demielinizzanti focali sono state causate dall'iniezione stereotassica di 2 μL di soluzione di lisolecitina (1% LPC in 0,9% NaCl) nel corpo calloso 3 giorni prima di iniziare il protocollo21. Questo protocollo pone le basi per eseguire il passo successivo in esperimenti in vitro. Inoltre, questo protocollo consente di risparmiare tempo e rimane fattibile per un uso diffuso in vari esperimenti.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina.

1. Materiali

  1. Preparare le soluzioni seguenti prima di iniziare il protocollo.
    1. Preparare il tampone di carico aggiungendo siero bovino fetale (FBS, 2%) alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    2. Aggiungere colorante rosso neutro (NR) (finale 1%) al PBS.
  2. Preparare le seguenti soluzioni utilizzando il kit di dissociazione del cervello adulto disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
    1. Per preparare la miscela enzimatica 1, pipettare 1,9 mL di Tampone Z e 50 μL di Enzima P in un tubo centrifuga da 15 mL.
    2. Per preparare la miscela enzimatica 2, pipettare 20 μL di Tampone Y e 10 μL di Enzima A in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
    3. Preparare la soluzione di rimozione dei detriti.

2. Perfusione e dissezione dei topi

  1. Iniettare per via intraperitoneale (i.p.) nel topo 500 μL di colorante NR all'1% in PBS 2-3 ore prima dell'anestesia.
    NOTA: L'iniezione intraperitoneale di NR in modelli murini demielinizzanti aiuta a discernere le lesioni (Figura 1).
  2. Anestetizzare il topo con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) e assicurarsi che il topo sia anestetizzato con successo esaminando le risposte al dolore.
  3. Aprire la cavità toracica del topo ed esporre il cuore.
  4. Tagliare con cura un piccolo angolo dell'atrio destro e perfondere intracardialmente il mouse con 20-30 ml di PBS freddo dal ventricolo sinistro.
  5. Decapitare il topo in anestesia.
  6. Apri il cranio del topo e libera con cura il cervello dal cranio.
  7. Trasferire il cervello alla muffa della fetta di cervello del topo e tagliare il cervello in fette di 0,1 cm.
  8. Rimuovere le fette di cervello e metterle in PBS freddo in una capsula di Petri (60/15 mm). Microdissettare le lesioni marcate dal colorante NR intorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio usando una pinza microchirurgica.
    NOTA: Assicurarsi che il tessuto sezionato sia il più completo possibile per facilitare il successivo trasferimento; il progresso totale della dissezione dovrebbe essere completato in 2 ore.
  9. Trasferire il tessuto sezionato in tubi centrifughi da 15 ml contenenti la quantità appropriata di tampone di carico a freddo.
    NOTA: Raggruppare il tessuto del corpo calloso da 2-3 topi insieme in una provetta come un campione.

3. Dissociazione dei tessuti

  1. Centrifugare il tessuto sezionato a 300 ×g per 30 s (dopo aver raggiunto questa velocità) per raccogliere il campione sul fondo del tubo.
  2. Preriscaldare la miscela enzimatica 1 e la miscela enzimatica da 2 a 37 °C in un incubatore.
  3. Aggiungere 1.950 μL di miscela enzimatica preriscaldata da 1 a un campione e digerire in un incubatore a 37 °C per 5 minuti.
  4. Aggiungere 30 μL di miscela enzimatica preriscaldata 2 e mescolare delicatamente.
  5. Digerire in un incubatore a 37 °C per 15 minuti e mescolare delicatamente ogni 5 minuti.
  6. Aggiungere 4 ml di PBS freddo al tubo dopo la digestione e agitare delicatamente.
  7. Posizionare filtri da 70 μm su tubi centrifuga da 50 mL e preincidere i filtri con 500 μL di PBS freddo. Filtrare il tessuto dissociato facendo passare i campioni di tessuto digerito attraverso i filtri e trasferire la sospensione filtrata nel tubo della centrifuga da 50 ml in un tubo della centrifuga da 15 ml.
    NOTA: saltare questo passaggio se la quantità di tessuto è troppo piccola.
  8. Centrifugare i campioni di tessuto filtrato a 300 ×g per 10 min a 4 °C e aspirare il surnatante lentamente e completamente.
    NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio ad eccezione della digestione enzimatica.

4. Rimozione dei detriti

  1. Risospendare delicatamente il pellet cellulare con 1.550 μL di PBS freddo.
  2. Aggiungere 450 μL di soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolare bene.
  3. Sovrapporre la miscela di cui sopra molto lentamente e delicatamente con 2 x 1 mL di PBS freddo usando una pipetta da 1.000 μL.
    NOTA: Inclinare il tubo della centrifuga di 45 ° e aggiungere lentamente PBS lungo la parete del tubo con la pipetta.
  4. Trasferire il tubo lentamente e delicatamente in una centrifuga e ruotare a 4 °C e 3.000 × g per 10 minuti.
  5. Cerca tre strati dopo la centrifugazione. Aspirare completamente i due strati superiori utilizzando una pipetta da 1.000 μL (Figura 2).
  6. Riempire il tubo fino a 5 ml con tampone di carico a freddo e capovolgere delicatamente il tubo tre volte.
  7. Centrifugare a 4 °C e 1.000 × g per 10 min. Aspirare completamente il surnatante ed evitare di interrompere il pellet cellulare.

5. Separazione magnetica delle cellule microgliali

  1. Risospesciare il pellet cellulare con 90 μL di tampone di carico e aggiungere 10 μL di perline CD11b (Microglia).
  2. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.
  3. Aggiungere 1 mL di tampone di carico e pipettare delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1.000 μL per lavare le cellule dopo l'incubazione. Centrifugare le celle a 4 °C e 300 × g per 10 minuti e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate.
  4. Risospesciare le celle in 500 μL di buffer di carico.
  5. Posizionare la colonna MS con il relativo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico.
  6. Risciacquare la colonna con 500 μL di tampone di carico per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica basata sul protocollo del produttore.
  7. Applicare la sospensione di cella sulla colonna MS ed eliminare il flusso passante contenente celle senza etichetta.
  8. Aggiungere 500 μL di buffer di carico alla colonna tre volte per lavare via le celle che aderiscono alla parete della colonna ed eliminare il flowthrough.
    NOTA: aggiungere un nuovo buffer di carico per il lavaggio solo quando il serbatoio della colonna è completamente vuoto.
  9. Rimuovere la colonna dal separatore dopo aver lavato la colonna e posizionarla su un tubo centrifugo da 15 ml.
  10. Aggiungere 1 mL di buffer di carico nella colonna e spingere lo stantuffo sul fondo della colonna per scovare le celle etichettate magneticamente. Ripetere questo passaggio tre volte per raccogliere completamente le cellule etichettate magneticamente.

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Risultati

Le microglia isolate con perline CD11b hanno un'elevata purezza
Le cellule microgliali intorno alle lesioni nei modelli murini di demielinizzazione sono state isolate utilizzando il protocollo sopra menzionato e testate mediante citometria a flusso. Le cellule sono etichettate fluorescentemente con ISOTIOCIANATO CD11b-Fluoresceina (FITC) e CD45-alloficocianina (APC) per determinare la microglia nella citometria a flusso secondo le istruzioni del produttore. Esistono diverse letterature che dimostrano ...

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Discussione

Il protocollo propone un metodo per isolare la microglia attorno alle lesioni demielinizzanti, che può aiutare a studiare le caratteristiche funzionali della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti. Le microglia catturate utilizzando perline CD11b mostrano un'elevata purezza e vitalità. I passaggi critici del protocollo includono la localizzazione precisa dei fuochi e la purificazione microgliale ottimale. Nella fase di protocollo 2.1, è necessario iniettare la soluzione NR 2 ore prima di sacrificare il...

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Divulgazioni

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Lo studio è stato sostenuto dalla Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Micro Centrifuge TubesBIOFILCFT001015
15 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011150
50 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011500
70 µm FilterMiltenyi Biotec130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-107-677
C57BL/6J MiceSJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouseMiltenyi Biotec130-093-634
Fetal Bovine SerumBOSTERPYG0001
FlowJoBD BiosciencesV10
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Neutral RedSigma-Aldrich1013690025
NovoCyte Flow CytometerAgilentA system consisting of various parts
NovoExpressAgilent1.4.1
PBSBOSTERPYG0021
PentobarbitalSigma-AldrichP-010
StereomicroscopeMshOtMZ62

Riferimenti

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
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  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).
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