Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Resumo

Microglia, as células imunes inatas residentes no cérebro, são os respondentes primários para inflamação ou lesão no sistema nervoso central (SNC). A microglia pode ser dividida em estado de repouso e estado ativado e pode mudar rapidamente o estado em resposta ao microambiente do cérebro. A microglia será ativada em diferentes condições patológicas e apresentará diferentes fenótipos. Além disso, existem muitos subgrupos diferentes de microglia ativada e grande heterogeneidade entre diferentes subgrupos. A heterogeneidade depende principalmente da especificidade molecular da microglia. Estudos revelaram que a microglia será ativada e desempenhará um papel importante no processo patológico da desmielinização inflamatória. Para entender melhor as características da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias, como esclerose múltipla e distúrbio do espectro neuromielite optica, propomos um protocolo de triagem microglial primária perilesional. Este protocolo utiliza a triagem celular ativada por colunaar (MACS) para obter microglia primária altamente purificada e preservar as características moleculares da microglia para investigar os efeitos potenciais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias.

Introdução

A microglia é originária de progenitores de gema-sac, que atingem o cérebro embrionário muito cedo e participam do desenvolvimento do CNS ^1,2. Por exemplo, eles estão envolvidos na poda sináptica³ e na regulação do crescimento axonal⁴. Eles secretam fatores que promovem a sobrevivência neuronal e ajudam a localização neuronal⁵. Ao mesmo tempo, eles estão envolvidos na remoção de células anormais e células apoptóticas para garantir o desenvolvimento cerebral normal⁶. Além disso, como as células imuno-competentes do cérebro, microglia vigia continuamente o parnchyma cerebral para limpar células mortas, sinapses disfuncionais e detritos celulares⁷. Foi demonstrado que a ativação microglial desempenha um papel importante em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias desmielinizantes, doenças neurodegenerativas e tumores cerebrais. Microglia ativada na esclerose múltipla (EM) contribuem para a diferenciação das células precursoras oligodendrocytos (OPCs) e a regeneração da mielina, engolindo detritos de mielina⁸.

Na doença de Alzheimer (DA), o acúmulo de beta amiloide (Aβ) ativa a microglia, que afeta as funções fagocíticas e inflamatórias da microglia⁹. A microglia ativada no tecido glioma, chamada microglia associada ao glioma (GAM), pode regular a progressão do glioma e, em última instância, afetar o prognóstico dos pacientes¹⁰. A ativação altera profundamente o transcriptome microglial, resultando em alterações morfológicas, expressão de receptores imunológicos, aumento da atividade fagocítica e secreção de^{citocinas aprimorada 11}. Existem diferentes subconjuntos de microglia ativada em doenças neurodegenerativas, como microglia associada à doença (DAM), microglia de resposta ativada (ARM) e fenótipo neurodegenerativo microglial (MGnD)⁸.

Da mesma forma, múltiplos subconjuntos funcionais dinâmicos de microglia também coexistem no cérebro em doenças inflamatórias desmielinizantes¹². Compreender a heterogeneidade entre diferentes subconjuntos de microglia é essencial para investigar a patogênese das doenças inflamatórias desmielinizantes e encontrar suas potenciais estratégias terapêuticas. A heterogeneidade da microglia depende principalmente da especificidade molecular⁸. É essencial descrever as alterações moleculares da microglia com precisão para o estudo da heterogeneidade. Os avanços na tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (RNA-seq) permitiram a identificação das características moleculares da microglia ativada em condições patológicas¹³. Portanto, a capacidade de isolar populações celulares é fundamental para uma investigação mais aprofundada dessas células-alvo em condições específicas.

Estudos realizados para entender as características e funções da microglia são geralmente estudos in vitro, uma vez que se descobriu que um grande número de microglia primária pode ser preparada e cultivada a partir de cérebros de filhotes de camundongos (1-3 dias de idade), que se ligam aos frascos de cultura e crescem na superfície plástica com outras células glias mistas. Posteriormente, a microglia pura pode ser isolada com base naadesividade diferente das células glias mistas^14,15. No entanto, este método só pode isolar a microglia do cérebro perinatal e leva várias semanas. Variáveis potenciais na cultura celular podem influenciar características microgliais, como a expressão molecular¹⁶. Além disso, a microglia isolada por esses métodos só pode participar de experimentos in vitro simulando as condições das doenças do SNC e não pode representar as características e funções da microglia in vivo estados da doença. Portanto, é necessário desenvolver métodos para isolar microglia do cérebro de camundongo adulto.

A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) e a separação magnética são dois métodos amplamente utilizados, embora tenham suas próprias limitações diferentes 16,17,18,19. Suas respectivas vantagens e desvantagens serão contrastadas na seção de discussão. O amadurecimento da tecnologia MACS oferece a possibilidade de purificar rapidamente as células. Huang et al. desenvolveram um método conveniente para rotular lesões desmielinizando no cérebro²⁰. Combinando essas duas abordagens técnicas, propomos um protocolo de separação magnética CD11b rápido e eficiente, fornecendo uma descrição passo a passo para isolar a microglia em torno de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos adultos e preservar as características moleculares da microglia. As lesões desmielinizadores focais foram causadas pela injeção estereotática de 2 μL de solução de lisolecithin (1% LPC em 0,9% NaCl) no calosum do corpus 3 dias antes de iniciar o protocolo²¹. Este protocolo estabelece as bases para realizar o próximo passo em experimentos in vitro. Além disso, este protocolo economiza tempo e permanece viável para uso generalizado em vários experimentos.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China.

1. Materiais

1. Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo.
   1. Prepare o tampão de carga adicionando soro bovino fetal (FBS, 2%) à solução salina tamponada de fosfato (PBS).
   2. Adicione corante vermelho neutro (NR) (1%) final ao PBS.
2. Prepare as seguintes soluções utilizando o Kit de Dissociação cerebral Adulta disponível comercialmente (veja a Tabela de Materiais).
   1. Para preparar a mistura de enzimas 1, pipeta 1,9 mL de Buffer Z e 50 μL de Enzima P em um tubo centrífuga de 15 mL.
   2. Para preparar a mistura de enzimas 2, pipeta 20 μL de Buffer Y e 10 μL de Enzima A em um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL.
   3. Prepare a solução de remoção de detritos.

2. Perfusão e dissecção de camundongos

1. Intraperitoneal (i.p.) injete o mouse com 500 μL de corante de 1% NR em PBS 2-3 h antes da anestesia.
   NOTA: A injeção intraperitoneal de NR em modelos desmielinizadores de camundongos ajuda a discernir as lesões (Figura 1).
2. Anestesiar o mouse com pentobarbital (50 mg/kg, i.p.), e garantir que o mouse seja anestesiado com sucesso examinando as respostas à dor.
3. Abra a cavidade torácica do rato e exponha o coração.
4. Corte um pequeno canto do átrio direito cuidadosamente e intracardialmente perprendo o mouse com 20-30 mL de PBS frio do ventrículo esquerdo.
5. Decapitar o rato sob anestesia.
6. Abra o crânio do rato e liberte cuidadosamente o cérebro do crânio.
7. Transfira o cérebro para o cérebro do rato cortar o molde e cortar o cérebro em fatias de 0,1 cm.
8. Remova as fatias cerebrais e coloque-as em PBS frio em uma placa de Petri (60/15 mm). Microdissto as lesões rotuladas por corante NR ao redor do caloso corpus sob um estereoscópio usando fórceps microcirúrgicos.
   NOTA: Certifique-se de que o tecido dissecado esteja o mais completo possível para facilitar a transferência subsequente; o progresso total da dissecção deve ser concluído em 2 h.
9. Transfira o tecido dissecado para tubos de centrífugas de 15 mL contendo a quantidade apropriada de tampão de carga a frio.
   NOTA: Misture o tecido de caloso corpus de 2-3 ratos juntos em um tubo como uma amostra.

3. Dissociação tecidual

1. Centrifugar o tecido dissecado a 300 ×g por 30 s (depois de atingir essa velocidade) para coletar a amostra na parte inferior do tubo.
2. Mistura de enzima pré-aqueça 1 e misture enzimas de 2 a 37 °C em uma incubadora.
3. Adicione 1.950 μL de enzima pré-aque mistura 1 a uma amostra e digerir em uma incubadora a 37 °C por 5 min.
4. Adicione 30 μL de mistura de enzimas pré-aque 2 e misture delicadamente.
5. Digerir em uma incubadora a 37 °C por 15 min e misturar suavemente a cada 5 minutos.
6. Adicione 4 mL de PBS frio ao tubo após a digestão e agite suavemente.
7. Coloque filtros de 70 μm em tubos de centrífugas de 50 mL e prewet os filtros com 500 μL de PBS frio. Filtre o tecido dissociado passando as amostras de tecido digerido através dos filtros e transfira a suspensão filtrada no tubo centrífuga de 50 mL para um tubo de centrífuga de 15 mL.
   NOTA: Pule esta etapa se a quantidade de tecido for muito pequena.
8. Centrifugar as amostras de tecido filtrado a 300 ×g por 10 min a 4 °C e aspirar o sobrenante lentamente e completamente.
   NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas no gelo, exceto pela digestão enzimática.

4. Remoção de detritos

1. Resuspenque a pelota de célula suavemente com 1.550 μL de PBS frio.
2. Adicione 450 μL de solução fria para remoção de detritos e misture bem.
3. Sobreponha a mistura acima muito lentamente e suavemente com 2 x 1 mL de PBS frio usando uma pipeta de 1.000 μL.
   NOTA: Incline o tubo de centrífuga por 45 ° e adicione lentamente PBS ao longo da parede do tubo com a pipeta.
4. Transfira o tubo lentamente e suavemente para uma centrífuga e gire a 4 °C e 3.000 × g por 10 min.
5. Procure por três camadas após a centrifugação. Aspire as duas camadas superiores completamente usando uma pipeta de 1.000 μL (Figura 2).
6. Encha o tubo até 5 mL com tampão de carregamento a frio e inverta suavemente o tubo três vezes.
7. Centrifugar a 4 °C e 1.000 × g por 10 min. Aspire completamente o supernatante e evite interromper a pelota celular.

5. Separação magnética de células microgliais

1. Resuspenja a pelota celular com 90 μL de tampão de carga e adicione 10 μL de contas CD11b (Microglia).
2. Misture bem e incubar por 15 min a 4 °C.
3. Adicione 1 mL de tampão de carga e pipeta o líquido suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL para lavar as células após a incubação. Centrifugar as células a 4 °C e 300 × g por 10 minutos e aspirar o supernatante completamente para remover as contas desvinculadas.
4. Resuspende as células em 500 μL de tampão de carga.
5. Coloque a coluna MS com seu separador para seleção positiva no campo magnético.
6. Enxágüe a coluna com 500 μL de tampão de carga para proteger as células e garantir a eficiência da classificação magnética com base no protocolo do fabricante.
7. Aplique a suspensão da célula na coluna MS e descarte o fluxo através de células não rotuladas.
8. Adicione 500 μL de tampão de carga à coluna três vezes para lavar as células que aderem à parede da coluna e descartar o fluxo através do fluxo.
   NOTA: Adicione apenas um novo tampão de carregamento para lavagem quando o reservatório da coluna estiver completamente vazio.
9. Retire a coluna do separador após lavar a coluna e coloque-a em um tubo de centrífuga de 15 mL.
10. Adicione 1 mL de tampão de carga na coluna e empurre o êmbolo para a parte inferior da coluna para liberar as células rotuladas magneticamente. Repita esta etapa três vezes para coletar completamente as células magneticamente rotuladas.

Resultados

Microglia isolada usando contas CD11b têm alta pureza
As células microgliais ao redor das lesões em modelos de camundongos desmielinização foram isoladas usando o protocolo acima mencionado e testadas por citometria de fluxo. As células são rotuladas fluorescentemente com isothiocyanato cd11b-fluoresceína (FITC) e CD45-alophycocyanin (APC) para determinar microglia na citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Existem várias literaturas demonstrando que os anticorpos CD1...

Discussão

O protocolo propõe um método para isolar a microglia em torno das lesões desmielinizantes, que podem ajudar a estudar as características funcionais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias. Microglia capturadas usando contas CD11b exibem alta pureza e viabilidade. As etapas críticas do protocolo incluem a localização precisa de focos e a purificação microglial ideal. No protocolo passo 2.1, é necessário injetar a solução NR 2 h antes de sacrificar o mouse para garantir que as lesões possam s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Micro Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011500
70 µm Filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-107-677
C57BL/6J Mice	SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse	Miltenyi Biotec	130-093-634
Fetal Bovine Serum	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BD Biosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Neutral Red	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte Flow Cytometer	Agilent		A system consisting of various parts
NovoExpress	Agilent	1.4.1
PBS	BOSTER	PYG0021
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P-010
Stereomicroscope	MshOt	MZ62