בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

Abstract

מיקרוגליה, תאי החיסון המולדים במוח, הם המגיבים העיקריים לדלקת או לפציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS). ניתן לחלק את המיקרוגליה למצב מנוחה ולמצב מופעל והוא יכול לשנות את המצב במהירות בתגובה למיקרו-סביבה של המוח. מיקרוגליה תופעל בתנאים פתולוגיים שונים ותציג פנוטיפים שונים. בנוסף, ישנן תת-קבוצות רבות ושונות של מיקרוגליה מופעלת והטרוגניות רבה בין תת-קבוצות שונות. ההטרוגניות תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית של המיקרוגליה. מחקרים גילו כי מיקרוגליה תופעל ותמלא תפקיד חשוב בתהליך הפתולוגי של דמילינציה דלקתית. כדי להבין טוב יותר את המאפיינים של מיקרוגליה במחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה, אנו מציעים פרוטוקול מיון מיקרוגליאלי ראשוני. פרוטוקול זה משתמש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטית טוררית (MACS) כדי להשיג מיקרוגליה ראשונית מטוהרת מאוד ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של מיקרוגליה במחלות דלקתיות.

Introduction

מקורם של המיקרוגליה הוא באבות חלמון-שק, המגיעים למוח העוברי מוקדם מאוד ומשתתפים בפיתוח מערכת העצבים המרכזית ^1,2. לדוגמה, הם מעורבים בגיזום סינפטי³ ובוויסות הצמיחה האקסונלית⁴. הם מפרישים גורמים המקדמים הישרדות עצבית ומסייעים ללוקליזציה עצבית⁵. במקביל, הם מעורבים בהסרת תאים לא תקינים ותאים אפופטוטיים כדי להבטיח התפתחות^{מוחית תקינה 6}. בנוסף, ככל שהתאים הכשירים לחיסון של המוח, מיקרוגליה חושפת ללא הרף את הפרנכימה המוחית כדי לנקות תאים מתים, סינפסות לא מתפקדות ופסולת תאית⁷. הוכח כי הפעלה מיקרוגליאלית ממלאת תפקיד חשוב במגוון מחלות, כולל מחלות דלקתיות, מחלות נוירודגנרטיביות וגידולי מוח. מיקרוגליה מופעלת בטרשת נפוצה (MS) תורמת להתמיינות של תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים (OPCs) ולהתחדשות של מיאלין על ידי בליעת פסולת מיאלין⁸.

במחלת אלצהיימר (AD), הצטברות של עמילואיד בטא (Aβ) מפעילה מיקרוגליה, המשפיעה על התפקודים הפאגוציטיים והדלקתיים של מיקרוגליה⁹. מיקרוגליה מופעלת ברקמת הגליומה, הנקראת מיקרוגליה הקשורה לגליומה (GAM), יכולה לווסת את התקדמות הגליומה ובסופו של דבר להשפיע על הפרוגנוזה של חולים¹⁰. ההפעלה משנה באופן עמוק את השעתוק המיקרוגליאלי, וכתוצאה מכך שינויים מורפולוגיים, ביטוי של קולטני מערכת החיסון, פעילות פגוציטית מוגברת והפרשת ציטוקינים^{משופרת 11}. ישנן תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה מופעלת במחלות נוירודגנרטיביות כגון מיקרוגליה הקשורה למחלה (DAM), מיקרוגליה בתגובה פעילה (ARM) ופנוטיפ נוירודגנרטיבי מיקרוגליאלי (MGnD)⁸.

באופן דומה, תת-קבוצות תפקודיות דינמיות מרובות של מיקרוגליה מתקיימות גם הן יחד במוח במחלות דלקתיות¹². הבנת ההטרוגניות בין תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה חיונית כדי לחקור את הפתוגנזה של מחלות דלקתיות ולמצוא את האסטרטגיות הטיפוליות הפוטנציאליות שלהן. ההטרוגניות של המיקרוגליה תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית⁸. חיוני לתאר את השינויים המולקולריים של המיקרוגליה במדויק לחקר ההטרוגניות. ההתקדמות בטכנולוגיית ריצוף ה-RNA החד-תאי (RNA-seq) אפשרה לזהות את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה פעילה בתנאים פתולוגיים¹³. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות תאים היא קריטית להמשך חקירה של תאי המטרה האלה בתנאים ספציפיים.

מחקרים שבוצעו כדי להבין את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה הם בדרך כלל מחקרים במבחנה, שכן נמצא כי מספר גדול של מיקרוגליה ראשונית ניתן להכין ולתרבת ממוחות של גורים עכברים (בני 1-3 ימים), אשר מתחברים לצלוחיות התרבית וגדלים על משטח הפלסטיק עם תאי גליה מעורבים אחרים. לאחר מכן, ניתן לבודד מיקרוגליה טהורה על סמך ההדבקה השונה של תאי גליה מעורבים^14,15. עם זאת, שיטה זו יכולה רק לבודד מיקרוגליה מהמוח הפרינטלי ונמשכת מספר שבועות. משתנים פוטנציאליים בתרבית תאים עשויים להשפיע על מאפיינים מיקרוגליאליים כגון ביטוי מולקולרי¹⁶. יתר על כן, מיקרוגליה המבודדת בשיטות אלה יכולה להשתתף רק בניסויים במבחנה על ידי הדמיית התנאים של מחלות CNS ואינה יכולה לייצג את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה במצבי מחלה in vivo. לכן, יש צורך לפתח שיטות לבידוד מיקרוגליה ממוח העכבר הבוגר.

מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) והפרדה מגנטית הם שתי שיטות בשימוש נרחב, אם כי יש להם מגבלות שונות משלהם 16,17,18,19. היתרונות והחסרונות שלהם בהתאמה יהיו מנוגדים בסעיף הדיון. ההבשלה של טכנולוגיית MACS מציעה את האפשרות לטהר במהירות תאים. Huang et al. פיתחו שיטה נוחה לתיוג נגעים demyelinating במוח²⁰. בשילוב שתי הגישות הטכניות הללו, אנו מציעים פרוטוקול הפרדה מגנטית מהיר ויעיל CD11b, המספק תיאור שלב אחר שלב כדי לבודד את המיקרוגליה סביב נגעים מתפרקים במוחות של עכברים בוגרים ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה. נגעי הדמילינאט המוקד נגרמו על ידי הזרקה סטריאוטקטית של 2 μL של תמיסת ליזולצית'ין (1% LPC ב-0.9% NaCl) בקורפוס קלוסום 3 ימים לפני תחילת הפרוטוקול²¹. פרוטוקול זה מניח את היסודות לביצוע השלב הבא בניסויים במבחנה. יתר על כן, פרוטוקול זה חוסך זמן ונשאר אפשרי לשימוש נרחב בניסויים שונים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המכון לטיפול בבעלי חיים של המכללה הרפואית טונגג'י, אוניברסיטת הואז'ונג למדע וטכנולוגיה, סין.

1. חומרים

1. הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול.
   1. הכינו את מאגר ההעמסה על ידי הוספת סרום בקר עוברי (FBS, 2%) לתמיסת מלח מואצרת פוספט (PBS).
   2. הוסף צבע אדום נייטרלי (NR) (1 סופי%) ל- PBS.
2. הכן את הפתרונות הבאים באמצעות ערכת הדיסוציאציה של המוח למבוגרים הזמינה מסחרית (ראה טבלת החומרים).
   1. כדי להכין תערובת אנזימים 1, פיפטה 1.9 מ"ל של Buffer Z ו-50 μL של אנזים P לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
   2. כדי להכין תערובת אנזימים 2, פיפטה 20 μL של Buffer Y ו-10 μL של אנזים A לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   3. הכן את הפתרון להסרת פסולת.

2. קליטת עכברים וכריתתם

1. באופן תוך-צפקי (i.p.) להזריק לעכבר 500 μL של 1% צבע NR ב- PBS 2-3 שעות לפני ההרדמה.
   הערה: הזרקה תוך-צפקית של NR במודלים של עכברים מתפרקים עוזרת להבחין בנגעים (איור 1).
2. מרדימים את העכבר עם פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג, כלומר), וודאו שהעכבר מורדם בהצלחה על ידי בחינת תגובות הכאב.
3. פתח את חלל החזה של העכבר וחשוף את הלב.
4. חתכו פינה קטנה של האטריום הימני בזהירות והטביעו את העכבר באופן תוך-לבי עם 20-30 מ"ל של PBS קר מהחדר השמאלי.
5. ערפו את העכבר בהרדמה.
6. פתח את גולגולת העכבר ושחרר בזהירות את המוח מהגולגולת.
7. העבירו את המוח לתבנית פרוסת המוח של העכבר וחתכו את המוח לפרוסות של 0.1 ס"מ.
8. מוציאים את פרוסות המוח ומניחים אותן ב-PBS קר בצלחת פטרי (60/15 מ"מ). מיקרו-דיסקציה של הנגעים המסומנים על ידי צבע NR סביב קורפוס קלוסום תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות מלקחיים מיקרוכירורגיים.
   הערה: ודא שהרקמה המנותחת שלמה ככל האפשר כדי להקל על ההעברה שלאחר מכן; יש להשלים את התקדמות הנתיחה הכוללת תוך 2 שעות.
9. העבר את הרקמה המנותקת לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל המכילים את הכמות המתאימה של חיץ טעינה קר.
   הערה: אסוף את רקמת הקורפוס קלוסום מ-2-3 עכברים יחד בצינור אחד כדגימה אחת.

3. דיסוציאציה של רקמות

1. צנטריפוגה הרקמה המנותקת ב 300 ×g במשך 30 שניות (לאחר שהגיע למהירות זו) כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.
2. תערובת אנזים קדם-חימום 1 ותערובת אנזימים 2 עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
3. הוסיפו 1,950 μL של תערובת אנזימים מחוממת מראש 1 לדגימה אחת ועכלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
4. מוסיפים 30 μL של תערובת אנזימים מחוממת מראש 2 ומערבבים בעדינות.
5. מעכלים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומערבבים בעדינות כל 5 דקות.
6. מוסיפים 4 מ"ל של PBS קר לצינור לאחר העיכול ומנערים בעדינות.
7. הניחו מסנני 70 מיקרומטר על צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל והניחו מראש את המסננים עם 500 μL של PBS קר. לסנן את הרקמה המנותקת על ידי העברת דגימות הרקמה המעוכלות דרך המסננים, ולהעביר את ההשעיה המסוננת בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
   הערה: דלג על שלב זה אם כמות הרקמה קטנה מדי.
8. צנטריפוגה דגימות הרקמה המסוננות ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ושואף את supernatant לאט ושלם.
   הערה: יש לבצע את כל השלבים על קרח למעט העיכול האנזימטי.

4. פינוי פסולת

1. בצעו החייאה של גלולת התא בעדינות עם 1,550 μL של PBS קר.
2. מוסיפים 450 μL של תמיסה קרה להסרת פסולת ומערבבים היטב.
3. שכבו את התערובת הנ"ל לאט ובעדינות רבה עם 2 x 1 מ"ל של PBS קר באמצעות פיפטה של 1,000 μL.
   הערה: הטה את צינור הצנטריפוגה ב- 45 ° והוסף באיטיות PBS לאורך דופן הצינור עם הפיפטה.
4. מעבירים את הצינור לאט ובעדינות לצנטריפוגה ומסובבים ב-4 מעלות צלזיוס ו-3,000 × גרם למשך 10 דקות.
5. חפשו שלוש שכבות לאחר צנטריפוגה. שאפו את שתי השכבות העליונות לחלוטין על ידי שימוש בפיפטה של 1,000 μL (איור 2).
6. מלאו את הצינור עד 5 מ"ל עם חיץ טעינה קר והפכו בעדינות את הצינור שלוש פעמים.
7. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ו-1,000 × גרם למשך 10 דקות. לשאוף את הסופרנטנט לחלוטין ולהימנע משיבוש כדור התא.

5. הפרדה מגנטית של תאים מיקרוגליאליים

1. בצעו שימוש חוזר בכדור התא עם 90 μL של מאגר טעינה והוסיפו 10 μL של חרוזי CD11b (Microglia).
2. מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר טעינה ופיפטה את הנוזל בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 μL כדי לשטוף את התאים לאחר הדגירה. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-300 × גרם למשך 10 דקות ושואפים את הסופרנאטנט לחלוטין כדי להסיר את החרוזים הלא מאוגדים.
4. בצעו החייאה של התאים ב-500 μL של מאגר טעינה.
5. מקם את העמודה MS עם המפריד שלה לבחירה חיובית בשדה המגנטי.
6. שטפו את העמודה ב-500 μL של מאגר טעינה כדי להגן על התאים ולהבטיח את יעילות המיון המגנטי בהתבסס על פרוטוקול היצרן.
7. החל את תרחיף התא על עמודת הטרשת הנפוצה והשליך את ה-flowthrough המכיל תאים ללא תווית.
8. הוסיפו 500 μL של מאגר טעינה לעמודה שלוש פעמים כדי לשטוף תאים שנצמדים לדופן העמודה ולהשליך את אורך הזרימה.
   הערה: הוסף מאגר טעינה חדש לשטיפה רק כאשר מאגר העמודות ריק לחלוטין.
9. הסר את העמוד מהמפריד לאחר שטיפת העמוד והנח אותו על צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
10. הוסף 1 מ"ל של מאגר טעינה לעמודה ודחף את הבוכנה לתחתית העמודה כדי לשטוף את התאים המסומנים באופן מגנטי. חזור על שלב זה שלוש פעמים כדי לאסוף לחלוטין את התאים המסומנים באופן מגנטי.

תוצאות

מיקרוגליה מבודדת באמצעות חרוזי CD11b בעלי טוהר גבוה
תאים מיקרוגליאליים סביב הנגעים במודלים של עכברי דמילינציה בודדו באמצעות הפרוטוקול הנ"ל ונבדקו על ידי ציטומטריה של זרימה. התאים מסומנים באופן פלואורסצנטי עם CD11b-פלואורסציין איזותיוציאנט (FITC) ו-CD45-אלופיקוקיאנין (APC) כדי לקבוע מיקר...

Discussion

הפרוטוקול מציע שיטה לבודד מיקרוגליה סביב נגעי demyelinating, אשר יכול לעזור לחקור את המאפיינים הפונקציונליים של microglia במחלות demyelinating דלקתיות. מיקרוגליה שצולמה באמצעות חרוזי CD11b מפגינה טוהר וכדאיות גבוהים. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים לוקליזציה מדויקת של מוקדים וטיהור מיקרוגליאלי אופטימלי. ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Micro Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011500
70 µm Filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-107-677
C57BL/6J Mice	SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse	Miltenyi Biotec	130-093-634
Fetal Bovine Serum	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BD Biosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Neutral Red	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte Flow Cytometer	Agilent		A system consisting of various parts
NovoExpress	Agilent	1.4.1
PBS	BOSTER	PYG0021
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P-010
Stereomicroscope	MshOt	MZ62