JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

초록

뇌에 상주하는 선천적 면역 세포 인 Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 염증 또는 손상에 대한 주요 반응자입니다. 미세아교세포는 휴지 상태와 활성화 상태로 나눌 수 있으며 뇌의 미세 환경에 반응하여 상태를 빠르게 변화시킬 수 있습니다. Microglia는 다른 병리학 적 조건 하에서 활성화되고 다른 표현형을 나타낼 것입니다. 또한, 활성화된 미세아교세포의 많은 상이한 하위군이 존재하며, 상이한 하위군 사이에 큰 이질성이 있다. 이질성은 주로 미세아교세포의 분자 특이성에 의존한다. 연구에 따르면 microglia가 활성화되고 염증성 탈수초화의 병리학 적 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 나타났습니다. 다발성 경화증 및 신경 척수염 옵티카 스펙트럼 장애와 같은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 특성을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 perilesional 원발성 미세아교세포 분류 프로토콜을 제안한다. 이 프로토콜은 원주형 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 고도로 정제 된 일차 미세 아교세포를 얻고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하여 염증성 탈수초성 질환에서 미세 아교세포의 잠재적 영향을 조사합니다.

서문

Microglia는 노른자 - 낭 선조에서 유래하며, 배아 뇌에 매우 일찍 도달하여 CNS 1,2의 발달에 참여합니다. 예를 들어, 그들은 시냅스 가지치기3 및 축삭 성장 조절4에 관여한다. 그들은 신경 생존을 촉진하고 신경 국소화를 돕는 인자를 분비합니다5. 동시에, 그들은 정상적인 뇌 발달을 보장하기 위해 비정상적인 세포와 사멸 세포를 제거하는 데 관여합니다6. 또한, 뇌의 면역능력이 있는 세포로서, 미세아교세포는 뇌 실질종을 지속적으로 감시하여 죽은 세포, 기능장애성 시냅스, 세포 파편7을 제거한다. 미세아교세포 활성화가 염증성 탈수초성 질환, 신경 퇴행성 질환 및 뇌종양을 포함한 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다. 다발성 경화증 (MS)에서 활성화된 미세아교세포는 올리고덴드로사이트 전구체 세포 (OPCs)의 분화 및 미엘린 파편을 삼킴으로써 미엘린의 재생에 기여한다8.

알츠하이머 병 (AD)에서 아밀로이드 베타 (Aβ)의 축적은 미세 아교세포를 활성화시켜 미세 아교세포9의 식세포 및 염증 기능에 영향을 미칩니다. 신경교종 관련 미세아교세포(GAM)라고 불리는 신경교종 조직에서 활성화된 미세아교세포는 신경교종의 진행을 조절할 수 있으며 궁극적으로 환자(10)의 예후에 영향을 미칠 수 있다. 활성화는 미세아교세포 전사체를 심오하게 변화시켜 형태학적 변화, 면역 수용체의 발현, 식세포 활성 증가, 사이토카인 분비 강화(11)를 초래한다. 신경 퇴행성 질환에서 활성화된 미세아교세포의 상이한 서브세트, 예컨대 질환 관련 미세아교세포 (DAM), 활성화된 반응 미세아교세포 (ARM), 및 미세아교세포 신경퇴행성 표현형(MGnD)8이 있다.

유사하게, 미세아교세포의 다수의 동적 기능적 서브세트는 또한 염증성 탈수초성 질환(12)에서 뇌에 공존한다. 미세아교세포의 상이한 서브세트 사이의 이질성을 이해하는 것은 염증성 탈수초성 질환의 발병기전을 조사하고 그들의 잠재적인 치료 전략을 찾는 데 필수적이다. 미세아교세포의 이질성은 주로 분자 특이성8에 의존한다. 이질성의 연구를 위해 미세 아교세포의 분자 변화를 정확하게 설명하는 것이 필수적입니다. 단일 세포 RNA-시퀀싱 (RNA-seq) 기술의 발전은 병리학 적 조건13에서 활성화 된 미세 아교세포의 분자 특성의 확인을 가능하게했습니다. 따라서, 세포 집단을 단리하는 능력은 특정 조건 하에서 이들 표적 세포의 추가 조사를 위해 중요하다.

microglia의 특성과 기능을 이해하기 위해 수행 된 연구는 일반적으로 시험관 내 연구이며, 많은 수의 1 차 미세 아교세포가 배양 플라스크에 부착되고 다른 혼합 신경교 세포와 함께 플라스틱 표면에서 자라는 마우스 강아지 두뇌 (1-3 일 이전)에서 제조되고 배양 될 수 있음이 밝혀 졌기 때문입니다. 이어서, 순수한 미세아교세포는 혼합된 신경교세포(14,15)의 상이한 접착성에 기초하여 단리될 수 있다. 그러나이 방법은 주산기 뇌에서 미세 아교세포를 분리 할 수 있으며 몇 주가 걸립니다. 세포 배양에서 잠재적인 변수는 분자 발현16과 같은 미세아교세포 특성에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 이러한 방법에 의해 단리된 미세아교세포는 CNS 질환의 상태를 시뮬레이션함으로써 시험관내 실험에만 참여할 수 있으며, 생체내 질환 상태에서 미세아교세포의 특성과 기능을 나타낼 수 없다. 따라서 성인 마우스 뇌에서 미세 아교세포를 분리하는 방법을 개발할 필요가 있습니다.

형광 활성화 세포 분류 (FACS)와 자기 분리는 널리 사용되는 두 가지 방법이지만 고유 한 제한 사항16,17,18,19이 있습니다. 각각의 장점과 단점은 토론 섹션에서 대조 될 것입니다. MACS 기술의 성숙은 세포를 신속하게 정화 할 수있는 가능성을 제공합니다. Huang et al.은 뇌의 탈수초성 병변을 라벨링하는 편리한 방법을 개발했습니다20. 이 두 가지 기술적 접근 방식을 결합하여 우리는 신속하고 효율적인 원주형 CD11b 자기 분리 프로토콜을 제안하여 성인 마우스 뇌에서 탈수초성 병변 주위의 미세 아교세포를 분리하고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하기위한 단계별 설명을 제공합니다. 국소 탈수초성 병변은 프로토콜 21을 시작하기 3일 전에 코퍼스 캘로섬에 2 μL의 리솔레시틴 용액 (0.9% NaCl 중1% LPC)의 입체주성 주사에 의해 야기되었다. 이 프로토콜은 시험관내 실험에서 다음 단계를 수행하기 위한 토대를 마련합니다. 또한이 프로토콜은 시간을 절약하고 다양한 실험에서 널리 사용할 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

모든 동물 절차는 Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China의 동물 관리위원회 연구소의 승인을 받았습니다.

1. 재료

  1. 프로토콜을 시작하기 전에 다음 해결 방법을 준비하십시오.
    1. 인산완충식염수(PBS)에 우태아혈청(FBS, 2%)을 첨가하여 로딩버퍼를 준비한다.
    2. PBS에 중성 적색 (NR) 염료 (최종 1 %)를 첨가한다.
  2. 시판되는 성인 뇌 해리 키트를 사용하여 다음 용액을 준비 하십시오 (재료 표 참조).
    1. 효소 믹스 1을 제조하기 위해, 1.9 mL의 완충액 Z 및 50 μL의 효소 P를 피펫으로 15 mL 원심분리 튜브에 넣었다.
    2. 효소 믹스 2를 제조하기 위해, 20 μL의 완충액 Y 및 10 μL의 효소 A를 피펫으로 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣었다.
    3. 이물질 제거 용액을 준비하십시오.

2. 생쥐 관류 및 해부

  1. 복강내로(i.p.) 마취 전에 PBS 2-3 h에 1% NR 염료 500 μL를 마우스에 주사한다.
    참고: 탈수초성 마우스 모델에 NR을 복강내 주사하면 병변을 식별하는 데 도움이 됩니다(그림 1).
  2. 펜토바르비탈 (50 mg / kg, i.p.)으로 마우스를 마취시키고 통증 반응을 검사하여 마우스가 성공적으로 마취되었는지 확인하십시오.
  3. 마우스의 흉강을 열고 심장을 노출시킵니다.
  4. 오른쪽 심방의 작은 모서리를 조심스럽게 자르고 좌심실에서 차가운 PBS 20-30 mL로 마우스를 심장 내 관류하십시오.
  5. 마취하에 마우스를 무력화하십시오.
  6. 마우스의 두개골을 열고 조심스럽게 두개골에서 뇌를 해방시킵니다.
  7. 뇌를 마우스 뇌 슬라이스 몰드로 옮기고 뇌를 0.1cm 조각으로 자릅니다.
  8. 뇌 조각을 제거하고 페트리 접시 (60/15mm)의 차가운 PBS에 넣으십시오. NR 염료에 의해 표지된 병변을 미세외과 포셉을 사용하여 입체현미경 하에서 코퍼스 캘로섬 주위에 미세 해부한다.
    참고 : 해부 된 조직이 후속 전달을 용이하게하기 위해 가능한 한 완전한지 확인하십시오. 총 해부 진행은 2 시간 안에 완료되어야합니다.
  9. 해부된 조직을 적절한 양의 차가운 로딩 완충액을 함유하는 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
    참고: 2-3마리의 마우스의 코퍼스 캘로섬 조직을 하나의 튜브에 하나의 샘플로 함께 풀링합니다.

3. 조직 해리

  1. 해부된 조직을 300 ×g에서 30 s 동안 원심분리하여(이 속도에 도달한 후) 튜브의 바닥에서 샘플을 수집한다.
  2. 예열효소 믹스 1과 효소 믹스 2 내지 37°C를 인큐베이터에서 예열한다.
  3. 1,950 μL의 예열된 효소 믹스 1을 샘플 1개에 첨가하고, 37°C의 인큐베이터에서 5분 동안 소화시킨다.
  4. 30 μL의 예열 효소 믹스 2를 넣고 부드럽게 혼합하십시오.
  5. 37°C의 인큐베이터에서 15분 동안 소화하고 5분마다 부드럽게 혼합한다.
  6. 소화 후 차가운 PBS 4 mL를 튜브에 넣고 부드럽게 흔든다.
  7. 70 μm 필터를 50 mL 원심분리 튜브에 놓고 필터를 500 μL의 차가운 PBS로 미리 적시십시오. 소화된 조직 샘플을 필터를 통해 통과시켜 해리된 조직을 여과하고, 여과된 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브로 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
    참고: 조직의 양이 너무 작은 경우 이 단계를 건너뜁니다.
  8. 여과된 조직 샘플을 4°C에서 10분 동안 300 ×g 에서 원심분리하고, 상층액을 천천히 그리고 완전히 흡인한다.
    참고 : 모든 단계는 효소 소화를 제외한 얼음에서 수행되어야합니다.

4. 이물질 제거

  1. 세포 펠릿을 1,550 μL의 차가운 PBS로 부드럽게 재현탁시킨다.
  2. 이물질 제거를 위해 차가운 용액 450μL를 넣고 잘 섞는다.
  3. 상기 혼합물을 1,000 μL 피펫을 사용하여 2 x 1 mL의 차가운 PBS로 매우 천천히 그리고 부드럽게 오버레이한다.
    참고 : 원심 분리 튜브를 45 ° 기울이고 피펫으로 튜브 벽을 따라 PBS를 천천히 추가하십시오.
  4. 튜브를 천천히 부드럽게 원심분리기로 옮기고 4°C 및 3,000 × g 에서 10분 동안 회전시킨다.
  5. 원심 분리 후 세 개의 층을 찾으십시오. 1,000 μL 피펫을 사용하여 두 개의 최상층을 완전히 흡인한다(그림 2).
  6. 튜브를 최대 5mL의 차가운 로딩 버퍼로 채우고 튜브를 세 번 부드럽게 뒤집습니다.
  7. 4°C에서 1,000 × g 을 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 완전히 흡인하고 세포 펠릿을 파괴하지 마십시오.

5. 미세아교세포의 자기분리

  1. 세포 펠렛을 90 μL의 로딩 완충액으로 재현탁시키고 10 μL의 CD11b (Microglia) 비드를 첨가한다.
  2. 잘 섞어서 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
  3. 로딩 버퍼 1 mL를 첨가하고 1,000 μL 피펫으로 액체를 부드럽게 상하로 피펫하여 인큐베이션 후 세포를 세척한다. 세포를 4°C에서 10분 동안 300 × g 으로 원심분리하고, 상층액을 완전히 흡인하여 결합되지 않은 비드를 제거하였다.
  4. 세포를 500 μL의 로딩 완충액에 재현탁시킨다.
  5. MS 컬럼을 자기장에 포지티브 선택을 위한 세퍼레이터와 함께 배치한다.
  6. 500μL의 로딩 버퍼로 컬럼을 헹구어 세포를 보호하고 제조업체의 프로토콜에 기반한 자기 분류 효율을 보장합니다.
  7. 세포 현탁액을 MS 컬럼 상에 적용하고, 표지되지 않은 세포를 함유하는 유동을 폐기한다.
  8. 500 μL의 로딩 버퍼를 컬럼에 세 번 첨가하여 컬럼 벽에 부착된 세포를 세척하고 유류를 버린다.
    참고: 컬럼 저장소가 완전히 비어있는 경우에만 세척을 위해 새 로딩 버퍼를 추가하십시오.
  9. 컬럼을 세척한 후 분리기로부터 컬럼을 제거하고 15 mL 원심분리 튜브 상에 놓는다.
  10. 로딩 버퍼 1 mL를 컬럼에 넣고 플런저를 컬럼 바닥으로 밀어 자기적으로 표지된 세포를 플러시한다. 이 단계를 세 번 반복하여 자기적으로 표지된 세포를 완전히 수집합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

CD11b 비드를 사용하여 분리된 미세아교세포는 고순도를 갖는다.
탈수초화 마우스 모델에서 병변 주위의 미세아교세포를 상기 언급된 프로토콜을 사용하여 단리하고 유세포 분석기에 의해 시험하였다. 세포는 CD11b-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 CD45-알로피코시아닌 (APC)으로 형광 표지되어 제조자의 지시에 따라 유세포 분석기에서 미세아교세포를 결정한다. CD11b 및 CD45 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

이 프로토콜은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 기능적 특성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 탈수초성 병변 주위의 미세아교세포를 분리하는 방법을 제안한다. CD11b 비드를 사용하여 포획된 미세아교세포는 높은 순도 및 생존력을 나타낸다. 프로토콜의 중요한 단계에는 초점의 정확한 국소화와 최적의 미세아교세포 정제가 포함됩니다. 프로토콜 단계 2.1에서, 병변이 정확하게 표시될...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

공개

저자들은 경쟁하는 이익이 존재하지 않는다고 선언했다.

감사의 말

이 연구는 Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06)의 지원을 받았다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Micro Centrifuge TubesBIOFILCFT001015
15 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011150
50 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011500
70 µm FilterMiltenyi Biotec130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-107-677
C57BL/6J MiceSJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouseMiltenyi Biotec130-093-634
Fetal Bovine SerumBOSTERPYG0001
FlowJoBD BiosciencesV10
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Neutral RedSigma-Aldrich1013690025
NovoCyte Flow CytometerAgilentA system consisting of various parts
NovoExpressAgilent1.4.1
PBSBOSTERPYG0021
PentobarbitalSigma-AldrichP-010
StereomicroscopeMshOtMZ62

참고문헌

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유