Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Résumé

Les microglies, les cellules immunitaires innées résidentes dans le cerveau, sont les principaux répondeurs à l’inflammation ou aux blessures du système nerveux central (SNC). La microglie peut être divisée en état de repos et en état activé et peut rapidement changer d’état en réponse au microenvironnement du cerveau. La microglie sera activée dans différentes conditions pathologiques et présentera différents phénotypes. En outre, il existe de nombreux sous-groupes différents de microglies activées et une grande hétérogénéité entre différents sous-groupes. L’hétérogénéité dépend principalement de la spécificité moléculaire de la microglie. Des études ont révélé que la microglie sera activée et jouera un rôle important dans le processus pathologique de démyélinisation inflammatoire. Pour mieux comprendre les caractéristiques de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes telles que la sclérose en plaques et le trouble du spectre de la neuromyélite optique, nous proposons un protocole de tri microglial primaire périlésionnel. Ce protocole utilise le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne (MACS) pour obtenir une microglie primaire hautement purifiée et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie afin d’étudier les effets potentiels de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes.

Introduction

Les microglies proviennent de progéniteurs du sac vitellin, qui atteignent très tôt le cerveau embryonnaire et participent au développement du ^{SNC 1,2}. Par exemple, ils sont impliqués dans l’élagage synaptique³ et la régulation de la croissance axonale⁴. Ils sécrètent des facteurs qui favorisent la survie neuronale et aident à la localisation neuronale⁵. Dans le même temps, ils sont impliqués dans l’élimination des cellules anormales et des cellules apoptotiques pour assurer le développement normal du cerveau⁶. En outre, en tant que cellules immunocompétentes du cerveau, les microglies surveillent continuellement le parenchyme cérébral pour éliminer les cellules mortes, les synapses dysfonctionnelles et les débris cellulaires⁷. Il a été démontré que l’activation microgliale joue un rôle important dans une variété de maladies, y compris les maladies inflammatoires démyélinisantes, les maladies neurodégénératives et les tumeurs cérébrales. Les microglies activées dans la sclérose en plaques (SEP) contribuent à la différenciation des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) et à la régénération de la myéline en engloutissant les débris de myéline⁸.

Dans la maladie d’Alzheimer (MA), l’accumulation de bêta-amyloïde (Aβ) active la microglie, ce qui affecte les fonctions phagocytaires et inflammatoires de la microglie⁹. La microglie activée dans le tissu du gliome, appelée microglie associée au gliome (GAM), peut réguler la progression du gliome et finalement affecter le pronostic des patients¹⁰. L’activation modifie profondément le transcriptome microglial, entraînant des changements morphologiques, l’expression des récepteurs immunitaires, une augmentation de l’activité phagocytaire et une augmentation de la sécrétion de cytokines¹¹. Il existe différents sous-ensembles de microglies activées dans les maladies neurodégénératives telles que la microglie associée à la maladie (DAM), la microglie à réponse activée (ARM) et le phénotype neurodégénératif microglial (MGnD)⁸.

De même, de multiples sous-ensembles fonctionnels dynamiques de microglies coexistent également dans le cerveau dans les maladies inflammatoires démyélinisantes¹². Comprendre l’hétérogénéité entre différents sous-ensembles de microglies est essentiel pour étudier la pathogenèse des maladies inflammatoires démyélinisantes et trouver leurs stratégies thérapeutiques potentielles. L’hétérogénéité de la microglie dépend principalement de la spécificité moléculaire⁸. Il est essentiel de décrire avec précision les altérations moléculaires de la microglie pour l’étude de l’hétérogénéité. Les progrès de la technologie du séquençage de l’ARN unicellulaire (séquençage de l’ARN) ont permis d’identifier les caractéristiques moléculaires de la microglie activée dans des conditions pathologiques¹³. Par conséquent, la capacité d’isoler les populations cellulaires est essentielle pour une étude plus approfondie de ces cellules cibles dans des conditions spécifiques.

Les études effectuées pour comprendre les caractéristiques et les fonctions de la microglie sont généralement des études in vitro, car il a été constaté qu’un grand nombre de microglies primaires peuvent être préparées et cultivées à partir de cerveaux de chiots de souris (âgés de 1 à 3 jours), qui se fixent aux flacons de culture et se développent à la surface du plastique avec d’autres cellules gliales mélangées. Par la suite, la microglie pure peut être isolée en fonction de l’adhérence différente des cellules gliales mélangées^14,15. Cependant, cette méthode ne peut isoler que la microglie du cerveau périnatal et prend plusieurs semaines. Les variables potentielles en culture cellulaire peuvent influencer les caractéristiques microgliales telles que l’expression moléculaire¹⁶. De plus, la microglie isolée par ces méthodes ne peut participer à des expériences in vitro qu’en simulant les conditions des maladies du SNC et ne peut pas représenter les caractéristiques et les fonctions de la microglie dans les états pathologiques in vivo. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes pour isoler la microglie du cerveau de la souris adulte.

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la séparation magnétique sont deux méthodes largement utilisées, bien qu’elles aient leurs propres limites 16,17,18,19. Leurs avantages et inconvénients respectifs seront mis en contraste dans la section de discussion. La maturation de la technologie MACS offre la possibilité de purifier rapidement les cellules. Huang et al. ont développé une méthode pratique pour étiqueter les lésions démyélinisantes dans le cerveau²⁰. En combinant ces deux approches techniques, nous proposons un protocole de séparation magnétique cylindrique CD11b rapide et efficace, fournissant une description étape par étape pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes dans le cerveau de souris adultes et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie. Les lésions démyélinisantes focales ont été causées par l’injection stéréotaxique de 2 μL de solution de lysolécithine (1% LPC dans 0,9% de NaCl) dans le corps calleux 3 jours avant le début du protocole²¹. Ce protocole jette les bases pour effectuer l’étape suivante dans les expériences in vitro. De plus, ce protocole permet de gagner du temps et reste réalisable pour une utilisation généralisée dans diverses expériences.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut des soins aux animaux du Tongji Medical College, Université des sciences et de la technologie de Huazhong, en Chine.

1. Matériaux

1. Préparez les solutions suivantes avant de commencer le protocole.
   1. Préparer le tampon de chargement en ajoutant du sérum bovin fœtal (FBS, 2%) à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Ajouter le colorant rouge neutre (NR) (final 1%) au PBS.
2. Préparez les solutions suivantes à l’aide du kit de dissociation du cerveau adulte disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
   1. Pour préparer le mélange d’enzymes 1, pipeter 1,9 mL de tampon Z et 50 μL d’enzyme P dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
   2. Pour préparer le mélange d’enzymes 2, pipeter 20 μL de tampon Y et 10 μL d’enzyme A dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
   3. Préparez la solution d’enlèvement des débris.

2. Perfusion et dissection de souris

1. Injecter par voie intrapéritonéale (i.p.) à la souris 500 μL de colorant NR à 1 % dans le PBS 2-3 h avant l’anesthésie.
   REMARQUE : L’injection intrapéritonéale de NR dans des modèles murins démyélinisants aide à discerner les lésions (Figure 1).
2. Anesthésiez la souris avec du pentobarbital (50 mg/kg, i.p.), et assurez-vous que la souris est anesthésiée avec succès en examinant les réponses à la douleur.
3. Ouvrez la cavité thoracique de la souris et exposez le cœur.
4. Coupez soigneusement un petit coin de l’oreillette droite et perfusez la souris avec 20 à 30 ml de PBS froid du ventricule gauche.
5. Décapiter la souris sous anesthésie.
6. Ouvrez le crâne de la souris et libérez soigneusement le cerveau du crâne.
7. Transférez le cerveau dans le moule de la tranche de cerveau de la souris et coupez le cerveau en tranches de 0,1 cm.
8. Retirez les tranches de cerveau et placez-les dans du PBS froid dans une boîte de Pétri (60/15 mm). Microdissectionnez les lésions marquées par le colorant NR autour du corps calleux sous un stéréomicroscope à l’aide de pinces microchirurgicales.
   REMARQUE: S’assurer que le tissu disséqué est aussi complet que possible pour faciliter le transfert ultérieur; l’avancement total de la dissection devrait être achevé en 2 h.
9. Transférer le tissu disséqué dans des tubes centrifuges de 15 mL contenant la quantité appropriée de tampon de charge à froid.
   REMARQUE: Regrouper le tissu du corps calleux de 2-3 souris ensemble dans un tube en un seul échantillon.

3. Dissociation tissulaire

1. Centrifuger le tissu disséqué à 300 ×g pendant 30 s (après avoir atteint cette vitesse) pour prélever l’échantillon au fond du tube.
2. Préchauffer le mélange d’enzymes 1 et le mélange d’enzymes de 2 à 37 °C dans un incubateur.
3. Ajouter 1 950 μL de mélange d’enzymes préchauffé 1 à un échantillon et digérer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min.
4. Ajouter 30 μL de mélange d’enzymes préchauffé 2 et mélanger doucement.
5. Digester dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min et mélanger doucement toutes les 5 min.
6. Ajouter 4 mL de PBS froid au tube après la digestion et agiter doucement.
7. Placez des filtres de 70 μm sur des tubes centrifuges de 50 mL et préemballez les filtres avec 500 μL de PBS froid. Filtrer le tissu dissocié en faisant passer les échantillons de tissu digérés à travers les filtres et transférer la suspension filtrée dans le tube de centrifugeuse de 50 mL dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
   REMARQUE: Ignorez cette étape si la quantité de tissu est trop petite.
8. Centrifuger les échantillons de tissus filtrés à 300 ×g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant lentement et complètement.
   REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace, à l’exception de la digestion enzymatique.

4. Enlèvement des débris

1. Remettez en suspension doucement la pastille de la cellule avec 1 550 μL de PBS froid.
2. Ajouter 450 μL de solution froide pour l’élimination des débris et bien mélanger.
3. Superposer le mélange ci-dessus très lentement et doucement avec 2 x 1 mL de PBS froid à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
   REMARQUE: Inclinez le tube de centrifugeuse de 45 ° et ajoutez lentement pbS le long de la paroi du tube avec la pipette.
4. Transférer le tube lentement et doucement dans une centrifugeuse et tourner à 4 °C et 3 000 × g pendant 10 min.
5. Recherchez trois couches après centrifugation. Aspirer complètement les deux couches supérieures à l’aide d’une pipette de 1 000 μL (Figure 2).
6. Remplissez le tube jusqu’à 5 mL avec un tampon de chargement à froid et inversez doucement le tube trois fois.
7. Centrifuger à 4 °C et 1 000 × g pendant 10 min. Aspirez complètement le surnageant et évitez de perturber la pastille cellulaire.

5. Séparation magnétique des cellules microgliales

1. Remettez en suspension la pastille de cellule avec 90 μL de tampon de chargement et ajoutez 10 μL de billes CD11b (Microglia).
2. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.
3. Ajouter 1 mL de tampon de chargement et pipeter doucement le liquide de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL pour laver les cellules après l’incubation. Centrifuger les cellules à 4 °C et 300 × g pendant 10 min et aspirer complètement le surnageant pour éliminer les billes non liées.
4. Remettre en suspension les cellules dans 500 μL de tampon de chargement.
5. Placez la colonne MS avec son séparateur pour une sélection positive dans le champ magnétique.
6. Rincez la colonne avec 500 μL de tampon de charge pour protéger les cellules et assurer l’efficacité du tri magnétique basé sur le protocole du fabricant.
7. Appliquez la suspension de cellule sur la colonne MS et éliminez le flux contenant des cellules non étiquetées.
8. Ajoutez trois fois 500 μL de tampon de chargement à la colonne pour éliminer les cellules qui adhèrent à la paroi de la colonne et éliminer le flux.
   REMARQUE: N’ajoutez un nouveau tampon de chargement pour le lavage que lorsque le réservoir de colonne est complètement vide.
9. Retirez la colonne du séparateur après avoir lavé la colonne et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 mL.
10. Ajoutez 1 mL de tampon de chargement dans la colonne et poussez le piston vers le bas de la colonne pour débusquer les cellules marquées magnétiquement. Répétez cette étape trois fois pour collecter complètement les cellules marquées magnétiquement.

Résultats

Les microglies isolées à l’aide de billes CD11b ont une grande pureté
Les cellules microgliales autour des lésions dans les modèles murins de démyélinisation ont été isolées à l’aide du protocole mentionné ci-dessus et testées par cytométrie en flux. Les cellules sont marquées par fluorescence avec de l’isothiocyanate de fluorescéine CD11b (FITC) et de l’allophycocyanine CD45 (APC) pour déterminer la microglie dans la cytométrie en flux conformément aux instructions du fabri...

Discussion

Le protocole propose une méthode pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes, ce qui peut aider à étudier les caractéristiques fonctionnelles de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes. Les microglies capturées à l’aide de billes CD11b présentent une pureté et une viabilité élevées. Les étapes critiques du protocole comprennent la localisation précise des foyers et la purification microgliale optimale. Dans l’étape de protocole 2.1, il est nécessaire d’injec...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Micro Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011500
70 µm Filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-107-677
C57BL/6J Mice	SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse	Miltenyi Biotec	130-093-634
Fetal Bovine Serum	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BD Biosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Neutral Red	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte Flow Cytometer	Agilent		A system consisting of various parts
NovoExpress	Agilent	1.4.1
PBS	BOSTER	PYG0021
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P-010
Stereomicroscope	MshOt	MZ62