Выделение первичной микроглии мыши методом магнитно-активированной сортировки клеток на животных моделях демиелинизации

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.

Аннотация

Микроглия, резидентные врожденные иммунные клетки в мозге, являются основными ответчиками на воспаление или травму в центральной нервной системе (ЦНС). Микроглия может быть разделена на состояние покоя и активированное состояние и может быстро менять состояние в ответ на микроокружение мозга. Микроглия будет активироваться при разных патологических состояниях и проявлять разные фенотипы. Кроме того, существует множество различных подгрупп активированной микроглии и большая неоднородность между различными подгруппами. Гетерогенность в основном зависит от молекулярной специфичности микроглии. Исследования выявили, что микроглия будет активироваться и играть важную роль в патологическом процессе воспалительной демиелинизации. Чтобы лучше понять характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз и расстройство зрительного спектра нейромиелита, мы предлагаем протокол перилезной первичной сортировки микроглии. Этот протокол использует столбчатую магнитно-активированную сортировку клеток (MACS) для получения высокоочищенной первичной микроглии и сохранения молекулярных характеристик микроглии для исследования потенциальных эффектов микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях.

Введение

Микроглии происходят из желточно-мешочных прародителей, которые достигают эмбрионального мозга очень рано и участвуют в развитии ЦНС ^1,2. Например, они участвуют в синаптической обрезке³ и регуляции роста аксонов⁴. Они выделяют факторы, которые способствуют выживанию нейронов и помогают локализации нейронов⁵. В то же время они участвуют в удалении аномальных клеток и апоптотических клеток для обеспечения нормального развития мозга⁶. Кроме того, как иммунокомпетентные клетки мозга, микроглия пос....

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом института по уходу за животными Медицинского колледжа Тунцзи, Университет науки и технологии Хуачжун, Китай.

1. Материалы

1. Подготовьте следующие решения перед началом протокола.
   1. Подготовьте нагрузочный буфер, добавив фетальную бычью сыворотку (FBS, 2%) в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
   2. Добавьте нейтральный красный (NR) краситель (последний 1%) в PBS.
2. Подготовьте следующие решения, используя коммерчески доступный комплект для диссоциации мозга взрослых (см. Таблицу материалов).
   1. Для п....

Результаты

Микроглия, выделенная с использованием шариков CD11b, имеет высокую чистоту
Микроглиальные клетки вокруг поражений в моделях демиелинизации мышей были выделены с использованием вышеупомянутого протокола и протестированы с помощью проточной цитометрии. Клетки флуоресцентно.......

Обсуждение

Протокол предлагает метод выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений, который может помочь изучить функциональные характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях. Микроглия, отловленная с помощью шариков CD11b, отличается высокой чистотой и жи.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Micro Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes	BIOFIL	CFT011500
70 µm Filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-107-677
C57BL/6J Mice	SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse	Miltenyi Biotec	130-093-634
Fetal Bovine Serum	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BD Biosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Neutral Red	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte Flow Cytometer	Agilent		A system consisting of various parts
NovoExpress	Agilent	1.4.1
PBS	BOSTER	PYG0021
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P-010
Stereomicroscope	MshOt	MZ62