JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.

Аннотация

Микроглия, резидентные врожденные иммунные клетки в мозге, являются основными ответчиками на воспаление или травму в центральной нервной системе (ЦНС). Микроглия может быть разделена на состояние покоя и активированное состояние и может быстро менять состояние в ответ на микроокружение мозга. Микроглия будет активироваться при разных патологических состояниях и проявлять разные фенотипы. Кроме того, существует множество различных подгрупп активированной микроглии и большая неоднородность между различными подгруппами. Гетерогенность в основном зависит от молекулярной специфичности микроглии. Исследования выявили, что микроглия будет активироваться и играть важную роль в патологическом процессе воспалительной демиелинизации. Чтобы лучше понять характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз и расстройство зрительного спектра нейромиелита, мы предлагаем протокол перилезной первичной сортировки микроглии. Этот протокол использует столбчатую магнитно-активированную сортировку клеток (MACS) для получения высокоочищенной первичной микроглии и сохранения молекулярных характеристик микроглии для исследования потенциальных эффектов микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях.

Введение

Микроглии происходят из желточно-мешочных прародителей, которые достигают эмбрионального мозга очень рано и участвуют в развитии ЦНС 1,2. Например, они участвуют в синаптической обрезке3 и регуляции роста аксонов4. Они выделяют факторы, которые способствуют выживанию нейронов и помогают локализации нейронов5. В то же время они участвуют в удалении аномальных клеток и апоптотических клеток для обеспечения нормального развития мозга6. Кроме того, как иммунокомпетентные клетки мозга, микроглия постоянно наблюдает за паренхимой мозга, чтобы очистить мертвые клетки, дисфункциональные синапсы и клеточный мусор7. Было продемонстрировано, что активация микроглии играет важную роль при различных заболеваниях, включая воспалительные демиелинизирующие заболевания, нейродегенеративные заболевания и опухоли головного мозга. Активированные микроглии при рассеянном склерозе (РС) способствуют дифференцировке клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК) и регенерации миелина путем поглощения миелиновых остатков8.

При болезни Альцгеймера (БА) накопление бета-амилоида (Aβ) активирует микроглию, которая влияет на фагоцитарные и воспалительные функции микроглии9. Активированная микроглия в ткани глиомы, называемая глиома-ассоциированной микроглией (GAM), может регулировать прогрессирование глиомы и в конечном итоге влиять на прогноз пациентов10. Активация глубоко изменяет транскриптом микроглии, что приводит к морфологическим изменениям, экспрессии иммунных рецепторов, повышению фагоцитарной активности и усилению секреции цитокинов11. Существуют различные подмножества активированной микроглии при нейродегенеративных заболеваниях, таких как ассоциированная с заболеванием микроглия (DAM), микроглия с активированным ответом (ARM) и микроглиальный нейродегенеративный фенотип (MGnD)8.

Аналогичным образом, множественные динамические функциональные подмножества микроглии также сосуществуют в головном мозге при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях12. Понимание неоднородности между различными подмножествами микроглии имеет важное значение для исследования патогенеза воспалительных демиелинизирующих заболеваний и поиска их потенциальных терапевтических стратегий. Гетерогенность микроглии в основном зависит от молекулярной специфичности8. Важно точно описать молекулярные изменения микроглии для изучения неоднородности. Достижения в технологии одноклеточного РНК-секвенирования (RNA-seq) позволили идентифицировать молекулярные характеристики активированной микроглии в патологических состояниях13. Поэтому способность изолировать клеточные популяции имеет решающее значение для дальнейшего исследования этих клеток-мишеней в определенных условиях.

Исследования, проводимые для понимания характеристик и функций микроглии, обычно являются исследованиями in vitro, поскольку было обнаружено, что большое количество первичной микроглии может быть получено и культивировано из мозга щенка мыши (1-3 дня), которые прикрепляются к колбам культуры и растут на пластиковой поверхности с другими смешанными глиальными клетками. Впоследствии чистую микроглию можно выделить на основе различной адгезивности смешанных глиальных клеток14,15. Однако этот метод позволяет изолировать микроглию только от перинатального мозга и занимает несколько недель. Потенциальные переменные в клеточной культуре могут влиять на характеристики микроглии, такие как молекулярная экспрессия16. Более того, микроглия, выделенная этими методами, может участвовать в экспериментах in vitro только путем моделирования состояний заболеваний ЦНС и не может представлять характеристики и функции микроглии в болезненных состояниях in vivo. Поэтому необходимо разработать методы выделения микроглии из мозга взрослой мыши.

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитная сепарация являются двумя широко используемыми методами, хотя они имеют свои собственные различные ограничения 16,17,18,19. Их соответствующие преимущества и недостатки будут противопоставлены в разделе обсуждения. Созревание технологии MACS дает возможность быстрой очистки клеток. Huang et al. разработали удобный метод маркировки демиелинизирующих поражений в мозге20. Объединив эти два технических подхода, мы предлагаем быстрый и эффективный столбчатый протокол магнитного разделения CD11b, обеспечивающий пошаговое описание для выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений в мозге взрослых мышей и сохранения молекулярных характеристик микроглии. Очаговые демиелинизирующие поражения были вызваны стереотаксическим введением 2 мкл раствора лизолецитина (1% LPC в 0,9% NaCl) в мозолистое тело за 3 дня до начала протокола21. Этот протокол закладывает основу для выполнения следующего шага в экспериментах in vitro. Более того, этот протокол экономит время и остается осуществимым для широкого использования в различных экспериментах.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом института по уходу за животными Медицинского колледжа Тунцзи, Университет науки и технологии Хуачжун, Китай.

1. Материалы

  1. Подготовьте следующие решения перед началом протокола.
    1. Подготовьте нагрузочный буфер, добавив фетальную бычью сыворотку (FBS, 2%) в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
    2. Добавьте нейтральный красный (NR) краситель (последний 1%) в PBS.
  2. Подготовьте следующие решения, используя коммерчески доступный комплект для диссоциации мозга взрослых (см. Таблицу материалов).
    1. Для приготовления ферментной смеси 1 пипетки 1,9 мл буфера Z и 50 мкл фермента Р в 15 мл центрифужной трубки.
    2. Для приготовления ферментной смеси 2 пипетки 20 мкл буфера Y и 10 мкл фермента А в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    3. Подготовьте раствор для удаления мусора.

2. Перфузия и рассечение мышей

  1. Внутрибрюшинно (т..) вводят мышам 500 мкл 1% NR красителя в PBS за 2-3 ч до анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрибрюшинная инъекция NR в моделях демиелинизирующих мышей помогает различать поражения (рисунок 1).
  2. Обезболить мышь пентобарбиталом (50 мг/кг, т..) и убедиться, что мышь успешно обезболена, изучив болевые реакции.
  3. Откройте грудную полость мыши и обнажите сердце.
  4. Аккуратно отрежьте небольшой уголок правого предсердия и внутрисердечно перфьминируйте мышь 20-30 мл холодного PBS из левого желудочка.
  5. Обезглавить мышь под наркозом.
  6. Откройте череп мыши и осторожно освободите мозг от черепа.
  7. Перенесите мозг мышиному мозгу и разрежьте мозг на кусочки по 0,1 см.
  8. Снимите кусочки мозга и поместите их в холодный PBS в чашку Петри (60/15 мм). Микрорассекция поражений, помеченных красителем NR вокруг мозолистого тела под стереомикроскопом с помощью микрохирургических щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рассеченная ткань является как можно более полной, чтобы облегчить последующий перенос; общий прогресс вскрытия должен быть завершен в течение 2 ч.
  9. Переложите рассеченную ткань на 15 мл центрифужных трубок, содержащих соответствующее количество буфера холодной нагрузки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините ткань мозолистого тела 2-3 мышей вместе в одной пробирке в виде одного образца.

3. Диссоциация тканей

  1. Центрифугируйте рассеченную ткань на 300 ×g в течение 30 с (после достижения этой скорости), чтобы собрать образец на дне пробирки.
  2. Разогреть ферментную смесь 1 и ферментную смесь от 2 до 37 °C в инкубаторе.
  3. Добавьте 1 950 мкл предварительно нагретой ферментной смеси 1 к одному образцу и переварите в инкубаторе при 37 °C в течение 5 мин.
  4. Добавьте 30 мкл предварительно нагретой ферментной смеси 2 и аккуратно перемешайте.
  5. Переварить в инкубаторе при 37 °C в течение 15 мин и осторожно перемешивать каждые 5 мин.
  6. Добавьте 4 мл холодного PBS в пробирку после переваривания и аккуратно встряхните.
  7. Поместите фильтры размером 70 мкм на центрифужные трубки объемом 50 мл и дополните фильтры 500 мкл холодного PBS. Отфильтруйте диссоциированную ткань, пропуская образцы переваренной ткани через фильтры, и перенесите отфильтрованную суспензию в 50 мл центрифужной трубки в центрифужную трубку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг, если количество ткани слишком мало.
  8. Центрифугируйте отфильтрованные образцы тканей при 300 ×g в течение 10 мин при 4 °C и медленно и полностью аспирируйте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться на льду, за исключением ферментативного пищеварения.

4. Удаление мусора

  1. Осторожно повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1,550 мкл холодного PBS.
  2. Добавить 450 мкл холодного раствора для удаления мусора и хорошо перемешать.
  3. Наложите вышеуказанную смесь очень медленно и осторожно с 2 х 1 мл холодного PBS, используя пипетку 1000 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните трубку центрифуги на 45° и медленно добавьте PBS вдоль стенки трубки с пипеткой.
  4. Медленно и осторожно переложите трубку в центрифугу и открутите при 4 °C и 3000 × g в течение 10 мин.
  5. Ищите три слоя после центрифугирования. Полностью аспирируйте два верхних слоя с помощью пипетки объемом 1000 мкл (рисунок 2).
  6. Заполните трубку до 5 мл буфером холодной загрузки и аккуратно переверните трубку три раза.
  7. Центрифуга при 4 °C и 1000 × г в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант полностью и избегайте разрушения клеточной гранулы.

5. Магнитное разделение клеток микроглии

  1. Повторно суспендируйте ячейку гранулы с 90 мкл нагрузочного буфера и добавьте 10 мкл ШАРИКОВ CD11b (Microglia).
  2. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
  3. Добавьте 1 мл загрузочного буфера и пипетку жидкости осторожно вверх и вниз с пипеткой 1000 мкл для промывки клеток после инкубации. Центрифугируют ячейки при 4 °C и 300 × г в течение 10 мин и полностью аспирируют супернатант, чтобы удалить несвязанные шарики.
  4. Повторное суспендирование клеток в 500 мкл нагрузочного буфера.
  5. Поместите столбец MS с его разделителем для положительного отбора в магнитном поле.
  6. Промыть колонну 500 мкл загрузочного буфера для защиты ячеек и обеспечения эффективности магнитной сортировки на основе протокола производителя.
  7. Нанесите суспензию ячейки на столбец MS и отбросьте прохождение, содержащее немаркированные ячейки.
  8. Добавьте 500 мкл загрузочного буфера в колонну три раза, чтобы смыть ячейки, которые прилипают к стенке колонны, и отбросить прохождение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте новый загрузочный буфер для промывки только тогда, когда резервуар колонны полностью пуст.
  9. Извлеките колонну из сепаратора после промывки колонны и поместите ее на центрифужную трубку объемом 15 мл.
  10. Добавьте 1 мл загрузочного буфера в колонну и отодвиньте плунжер в нижнюю часть колонны, чтобы смыть магнитно меченые ячейки. Повторите этот шаг три раза, чтобы полностью собрать магнитно меченые клетки.

Результаты

Микроглия, выделенная с использованием шариков CD11b, имеет высокую чистоту
Микроглиальные клетки вокруг поражений в моделях демиелинизации мышей были выделены с использованием вышеупомянутого протокола и протестированы с помощью проточной цитометрии. Клетки флуоресцентно...

Обсуждение

Протокол предлагает метод выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений, который может помочь изучить функциональные характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях. Микроглия, отловленная с помощью шариков CD11b, отличается высокой чистотой и жи...

Раскрытие информации

Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Благодарности

Исследование было поддержано Фондом выдающихся молодых ученых больницы Тунцзи (HUST) (грант No 2020YQ06).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Micro Centrifuge TubesBIOFILCFT001015
15 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011150
50 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011500
70 µm FilterMiltenyi Biotec130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-107-677
C57BL/6J MiceSJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouseMiltenyi Biotec130-093-634
Fetal Bovine SerumBOSTERPYG0001
FlowJoBD BiosciencesV10
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Neutral RedSigma-Aldrich1013690025
NovoCyte Flow CytometerAgilentA system consisting of various parts
NovoExpressAgilent1.4.1
PBSBOSTERPYG0021
PentobarbitalSigma-AldrichP-010
StereomicroscopeMshOtMZ62

Ссылки

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены