Uso de una inyección de trazador celular para investigar el origen de las células formadoras de neointima en un modelo de pared lateral saccular de rata

Resumen

Realizamos una inyección lipofílica de un punto para rastrear las células endoteliales, seguida de una arteriotomía y sutura de aneurismas de la pared lateral en la aorta abdominal de la rata. La formación de neointima parecía depender de la arteria madre en los aneurismas descelularizados y fue promovida por el reclutamiento de células de la pared del aneurisma en paredes vitales ricas en células.

Resumen

El recorte microquirúrgico crea una barrera posterior del flujo sanguíneo hacia los aneurismas intracraneales, mientras que el tratamiento endovascular se basa en la formación de neoíntima y trombo. La fuente de células endoteliales que cubren la capa endoluminal de la neoíntima sigue sin estar clara. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue investigar el origen de las células formadoras de neointima después de la inyección de trazador celular en el modelo de aneurisma microquirúrgico de la pared lateral de la rata de Helsinki ya bien establecido.

Los aneurismas de la pared lateral se crearon suturando bolsas arteriales descelularizadas o vitales de extremo a lado de la aorta en ratas Lewis macho. Antes de la arteriotomía con sutura de aneurisma, se realizó una inyección de trazador celular que contenía colorante CM-Dil en la aorta sujetada para etiquetar las células endoteliales en el vaso adyacente y rastrear su proliferación durante el seguimiento (FU). Tratamiento seguido de enrollamiento (n = 16) o colocación de stent (n = 15). En la FU (7 días o 21 días), todas las ratas se sometieron a angiografía por fluorescencia, seguida de recolección de aneurismas y evaluación macroscópica e histológica con recuentos de células inmunohistológicas para regiones específicas de interés.

Ninguno de los 31 aneurismas se había roto en el seguimiento. Cuatro animales murieron prematuramente. Se observó perfusión macroscópicamente residual en el 75,0% en espiral y el 7,0% de las ratas con stent. La cantidad de células positivas para trazadores celulares se elevó significativamente en los stents descelularizados en comparación con los aneurismas en espiral con respecto al trombo en el día 7 (p = 0,01) y neointima en el día 21 (p = 0,04). No se encontraron diferencias significativas en trombos o neoíntimas en aneurismas vitales.

Estos hallazgos confirman peores patrones de curación en los aneurismas en espiral en comparación con los de stent. La formación de neointima parece particularmente dependiente de la arteria madre en los aneurismas descelularizados, mientras que está respaldada por el reclutamiento de las células de la pared del aneurisma en las paredes vitales ricas en células. En términos de traducción, el tratamiento con stent podría ser más apropiado para los aneurismas altamente degenerados, mientras que el enrollamiento solo podría ser adecuado para los aneurismas con paredes de vasos en su mayoría sanas.

Introducción

La hemorragia subaracnoidea causada por la ruptura de un aneurisma intracraneal (AI) es una condición neuroquirúrgica devastadora asociada con una alta morbilidad y mortalidad 1,2,3,4. Además del recorte microquirúrgico, que proporciona contacto directo de endotelio a endotelio, los dispositivos endovasculares han ganado cada vez más importancia en las últimas décadas para tratar las IA rotas e incidentalmente descubiertas. La respuesta de curación en las EA tratadas endovascularmente depende principalmente de la formación de neoíntima y la organización del trombo. Ambos son procesos sinérgicos, dependiendo de la migración celular desde el vaso adyacente y la pared del aneurisma. ^{5 Hasta} la fecha, el origen de las células endoteliales en la formación neointima de aneurismas tratados con endovascular sigue sin estar claro. Hay un debate en curso en la literatura sobre la fuente de la que se reclutan las células formadoras de neointima.

Mediante el uso de una inyección de trazador celular de colorante CM-Dil (ver la Tabla de Materiales) en la aorta abdominal de ratas, nuestro objetivo fue analizar el papel de las células endoteliales, originadas en la arteria madre, en la formación de neointima en dos puntos de tiempo fu diferentes (día 7 y día 21) (Figura 1). Una ventaja del modelo es la incubación local directa del trazador celular in vivo en una arteria madre antes de la sutura del aneurisma, lo que permite la FU en puntos de tiempo posteriores. Las técnicas de inyección in vivo , como la incubación de trazadores celulares, no se han descrito en la literatura. Una ventaja de esta técnica es la inyección directa, de un punto, intraoperatoria, in vivo , que hace que el modelo sea robusto y reproducible.

Protocolo

El apoyo veterinario se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Local, Suiza (BE 60/19). Las directrices de ARRIVE y los principios de 3R se han seguido estrictamente ^6,7. Se incluyeron treinta y una ratas Lewis macho, de 12 semanas de edad y con un peso de 492 ± 8 g. Alojar a todas las ratas a una temperatura ambiente de 23 °C y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Proporcionar acceso gratuito a agua y pellets. Los análisis estadísticos se han realizado mediante la prueba no paramétrica U de Wilcoxon-Mann-Whitney. Los valores de probabilidad (p) de ≤ 0,05 y/o ≤ 0,01 se consideraron significativos.

1. Preparación general de fase preoperatoria y aspectos anestesiológicos

1. Aleatorizar ratas en grupos de tratamiento de bobina o stent (Figura 2) a través de un sistema de aleatorización basado en la web. Ahora, realice un examen clínico preoperatorio de todos los animales planificados para la cirugía junto a un quirófano tranquilo y aséptico manteniendo una temperatura ambiente de 23 ± 3 ° C. Analizar el comportamiento de los animales e inspeccionar las membranas mucosas y la turgencia como parte del examen clínico preoperatorio.
2. Registra el peso de cada animal.
3. Antes de la cirugía, incubar las bolsas arteriales de ratas donantes en dodecil sulfato de sodio al 0,1% durante 10 h a 37 °C para obtener aneurismas descelularizados⁸. Recoja estas bolsas de animales donantes unos días antes de la cirugía.
   1. Prepare toda la longitud de la aorta abdominal con microscisores y fórceps y aplique 6-0 ligaduras no absorbibles en un intervalo de 3-4 mm.
   2. Generar directamente aneurismas vitales intraoperatoriamente por una bolsa de vasos arteriales previamente ligada desde la parte torácica de un animal donante⁹. Realizar toracotomía con tijeras y pinzas quirúrgicas en el punto de tiempo FU indicado y ligar la bolsa del vaso a la longitud deseada.
4. Implantar directamente la bolsa en el receptor y cosechar el aneurisma del animal donante para su posterior análisis macroscópico y procesamiento histológico.
5. Para la inducción de la anestesia, coloque a todas las ratas en una caja limpia provista de oxígeno (O₂) hasta la pérdida del conocimiento después de 5-10 min. Anestesiar a las ratas con una inyección subcutánea (SC) de una mezcla de fentanilo 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg y midazolam 2 mg/kg.
   NOTA: Esto asegura un plano quirúrgico de al menos 45 min.
6. Comprobar la profundidad de la anestesia por la ausencia del reflejo de retirada del pedal.
7. Coloque las ratas en posición supina y afeite la parte toracoabdominal con una afeitadora eléctrica.
8. Fije las 4 patas de las ratas con cinta adhesiva en una placa, cubierta por una almohadilla térmica conectada a una sonda rectal autorreguladora. Inserte la sonda rectal en el ano de la rata para mantener la temperatura deseada de 37 ° C con la ayuda de la almohadilla térmica.
9. Ahora, instale un sensor en la pata trasera derecha conectado a un sistema computarizado para verificar los signos vitales intraoperatoriamente.
10. Cubra la nariz y la boca de la rata con una máscara facial. Si requiere anestesia prolongada, comience con isoflurano (1.0-2.0% titulado para efecto en 100% O₂).
11. Desinfecte el campo quirúrgico con povidona yodada o desinfectantes alternos y cubra el campo quirúrgico de manera estéril.
12. Para el cuidado perianestésico, aplique un lubricante oftálmico estéril en los ojos y cúbralos con una máscara de lámina opaca para evitar el secado y el daño de la lámpara quirúrgica.
13. Durante la cirugía, suministre oxígeno continuamente a través de la máscara facial, controle la temperatura corporal y proporcione calor con una almohadilla térmica, manteniendo la normotermia.
14. Controle continuamente otros signos vitales (distensión del pulso y la respiración, frecuencia cardíaca y respiratoria, y saturación de oxígeno).

2. Fase operatoria - inyección de trazador celular

NOTA: El enfoque quirúrgico detallado en el modelo 9 de aneurisma microquirúrgico de la pared lateral^{de la} rata de Helsinki y las técnicas para la implantación de bobinas y stents se describen en otra parte ^8,10,11.

1. Guarde el trazador de células lipofílicas fluorescente a ≤ -20 °C todo el tiempo, protegido de la luz.
2. Realice la cirugía preparando la aorta de rata y la vena cava, seguida de la separación de ambas, así como el pinzamiento temporal proximal y distal de la aorta.
   NOTA: Esta técnica ha sido descrita anteriormente⁹.
   1. Sujete las partes proximal y distal de la aorta con dos clips temporales de titán.
3. Coloque un microswab con acolchado púrpura cada uno debajo de las partes proximal y distal de la aorta para una mejor visualización de la arteria.
4. Ahora, proteja el abdomen con una gasa húmeda.
5. El día de la operación, disolver 2 μL del trazador celular mediante pipeteo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
6. Transfiera la mezcla a una jeringa de 1 ml equipada con una cánula estéril de 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
   NOTA: Tenga cuidado de evitar la exposición a la luz mientras realiza los pasos 2.5 y 2.6.
7. Apague la luz en el quirófano. Mientras mira bajo un microscopio, realice la inyección de un punto en la parte ventral media de la aorta usando micro fórceps e inyecte cuidadosamente 1 ml de solución salina heparinizada al 0,9%.
8. Inyecte el trazador celular con cuidado (Video 1) e inmediatamente apague el microscopio operativo también. Una vez más, proteja el abdomen con una gasa húmeda.
9. Deje que el tinte se incube durante al menos 15 min. Después del período de incubación, encienda el microscopio y las luces de la sala de operaciones.
10. Realizar la arteriotomía longitudinal y sutura del aneurisma, como se describe en otra parte¹¹.
    1. Use microfuerzas y microscisores para realizar la arteriotomía de modo que su longitud promedie el diámetro del aneurisma cosechado (paso 1.3). Para asegurar la longitud correcta, coloque el aneurisma al lado de la aorta antes de realizar la arteriotomía. Suturar el aneurisma con 8-10 puntos únicos utilizando una sutura 10-0 no absorbible, y retirar cuidadosamente las abrazaderas temporales -comenzando distalmente- bajo riego continuo con solución salina heparinizada. Cierre la herida en capas. Cabe destacar que utilice una densidad de embalaje de bobina de 1 cm.
       NOTA: La técnica de implantación de bobina o stent se ha descrito en otra parte ^8,10.

3. Monitorización de fase postoperatoria y cuidados analgésicos

1. Al final de la cirugía, invierta la anestesia con una mezcla de inyección SC de buprenorfina 0,05 mg/kg, atipamezol 0,75 mg/kg y flumazenil 0,2 mg/kg. Deje que cada animal operado se recupere en una jaula limpia hasta que esté completamente despierto y caliente, según sea necesario, con una lámpara de calefacción.
2. Durante 3 días, administrar 1 mg/kg de meloxicam (una inyección o aplicación oral al día) y buprenorfina (0,05 mg/kg cuatro veces al día) SC. Durante la noche, proporcione buprenorfina continuamente en el agua potable con la misma dosis: 6 ml de buprenorfina 0,3 mg/ml, 360 ml de agua potable, 10 ml de glucosa al 5%.
3. En la fase postoperatoria inmediata, alberge a cada animal en una sola jaula para su protección. Reagrupar a los animales después de 24 h.
4. Si alguna rata muestra un comportamiento angustiado o agresivo después de la inyección de SC, administre buprenorfina en el agua potable durante el día.
5. Proporcione alimentación suave en el piso de la jaula para apoyar la alimentación y la recuperación después de la operación.
6. Observe y cuide a todos los animales de acuerdo con la hoja de puntuación de bienestar y dolor.
7. Administrar analgesia de rescate SC (meloxicam 1 mg/kg y 0,05 mg/kg buprenorfina) cuando sea necesario.

Resultados

Un total de 31 animales fueron incluidos en el entorno de laboratorio: 27 ratas fueron incluidas en el análisis estadístico final; 4 ratas murieron prematuramente (tasa de mortalidad del 12,9%). Intraoperatoriamente, la distensión respiratoria se redujo significativamente (p = 0,03) en ratas con stent (12,9 μm ± 0,7) en comparación con ratas tratadas con bobina (13,5 μm ± 0,6). Se realizó una angiografía por fluorescencia para cada rata al final de la FU final. La reperfusión se indicó en los 6 anima...

Discusión

Este estudio demuestra que la formación de neointima está mediada a través de células endoteliales que se originan en la arteria madre del complejo aneurisma, pero está respaldada por el reclutamiento de células derivadas de la pared del aneurisma en aneurismas vitales. Sin embargo, el papel de las células progenitoras circulantes en la curación de aneurismas sigue siendo controvertido^12,13. En general, se incluyeron 31 ratas Lewis macho en esta investiga...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary