שימוש בזריקת מעקב אחר תאים כדי לחקור את מקורם של תאים יוצרי ניאו-אינטימה במודל דופן צד סקולרית של חולדה

Summary

ביצענו זריקה חד-נקודתית, ליפופילית, לאיתור תאי אנדותל, ולאחר מכן טרשת עורקים ותפירה של מפרצות דופן הדופן באבי העורקים של חולדות הבטן. היווצרות ניאו-ינטימה נראתה תלויה בעורק האב במפרצות דה-תאיות וקודמה על ידי גיוס מתאי דופן מפרצת בקירות חיוניים עשירים בתאים.

Abstract

חיתוך מיקרו-כירורגי יוצר מחסום נוסף של זרימת הדם למפרצות תוך גולגולתיות, בעוד שהטיפול האנדווסקולרי מסתמך על ניאו-אינטימה והיווצרות פקקת. מקורם של תאי האנדותל המכסים את השכבה האנדולומינלית של הניאו-אינטימה עדיין אינו ברור. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחקור את מקורם של תאים יוצרי ניאו-אינטימה לאחר הזרקת עוקבים אחר תאים במודל המפרצת המיקרו-כירורגית של חולדות הלסינקי, שכבר היה מבוסס היטב.

מפרצות דופן הדופן נוצרו על ידי תפירה של שקיות עורקים נטולות תאים או חיוניות מקצה לקצה באבי העורקים בחולדות לואיס זכריות. לפני טרשת עורקים עם תפר מפרצת, בוצעה הזרקת מעקב אחר תאים המכילה צבע CM-Dil לתוך אבי העורקים המהודק כדי לתייג תאי אנדותל בכלי הסמוך ולעקוב אחר התפשטותם במהלך מעקב (FU). הטיפול ואחריו סליל (n = 16) או סטנטים (n = 15). ב-FU (7 ימים או 21 ימים), כל החולדות עברו אנגיוגרפיה פלואורסצנטית, ואחריה קצירת מפרצת והערכה מקרוסקופית והיסטולוגית עם ספירת תאים אימונוהיסטולוגית לאזורי עניין ספציפיים.

אף אחת מ-31 המפרצות לא נקרעה במעקב. ארבע חיות מתו בטרם עת. זלוף שיורי מקרוסקופי נצפה ב-75.0% מפותלים וב-7.0% מהחולדות הסטנטיות. כמות התאים החיוביים למעקב אחר תאים עלתה באופן משמעותי בסטנטים דה-תאיים בהשוואה למפרצת מפותלת ביחס לפקקת ביום 7 (p = 0.01) וניאו-ינטימה ביום 21 (p = 0.04). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בפקקת או בניאינטימה במפרצות חיוניות.

ממצאים אלה מאשרים דפוסי ריפוי גרועים יותר במפרצות מפותלות בהשוואה למפרצות סטנטות. נראה כי היווצרות ניאו-ינטימה תלויה במיוחד בעורק האב במפרצות שעברו דה-תאיזציה, בעוד שהיא נתמכת על ידי גיוס מתאי דופן מפרצת בקירות חיוניים עשירים בתאים. במונחים של תרגום, טיפול בסטנט עשוי להיות מתאים יותר למפרצות מנוונות מאוד, בעוד שסליל לבדו עשוי להיות מתאים למפרצות עם דפנות כלי דם בריאות ברובן.

Introduction

דימום תת-עכבישי הנגרם על ידי קרע של מפרצת תוך גולגולתית (IA) הוא מצב נוירוכירורגי הרסני הקשור לתחלואה גבוהה ותמותה ^1,2,3,4. בנוסף לחיתוך מיקרו-כירורגי, המספק מגע ישיר בין אנדותל לאנדותל, התקנים אנדווסקולריים זכו לחשיבות גוברת בעשורים האחרונים לטיפול ב-IAs שנקרעו והתגלו כבדרך אגב. תגובת הריפוי ב- IAs המטופלים באנדווסקולרית תלויה בעיקר בהיווצרות ניאו-ינטימה ובארגון פקקת. שניהם תהליכים סינרגטיים, בהתאם לנדידת התאים מכלי השיט הסמוך ולדופן המפרצת. ⁵ נכון להיום, מקורם של תאי אנדותל בהיווצרות ניאו-ינטימה של מפרצות אנדווסקולריות מטופלות עדיין אינו ברור. יש ויכוח מתמשך בספרות על המקור שממנו מגויסים תאים יוצרי ניאו-אינטימה.

על-ידי שימוש בזריקת מעקב תאים של צבע CM-Dil (ראו טבלת החומרים) באבי העורקים הבטני של חולדות, אנו שואפים לנתח את תפקידם של תאי האנדותל, שמקורם בעורק האב, ביצירת ניאו-אינטימה בשתי נקודות זמן FU שונות (יום 7 ויום 21) (איור 1). יתרון של המודל הוא הדגירה הישירה של עוקבי התאים in vivo בעורק אב לפני תפר המפרצת, המאפשרת FU בנקודות זמן מאוחרות יותר. טכניקות הזרקת In vivo , כגון דגירה של תאי מעקב אחר תאים, לא תוארו בספרות. יתרון של טכניקה זו הוא ההזרקה הישירה, החד-פעמית, התוך-ניתוחית, in vivo , מה שהופך את המודל לחזק וניתן לשחזור.

Protocol

התמיכה הווטרינרית בוצעה על פי הנחיות המוסד. הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית, שוויץ (BE 60/19). הנחיות ה-ARRIVE ועקרונות ה-3R נשמרו בקפדנות^{על 6,7}. 31 חולדות לואיס זכרים, בני 12 שבועות ומשקלם 492 ± 8 גרם, נכללו. ביתו את כל החולדות בטמפרטורת חדר של 23 מעלות צלזיוס ומחזור אור/חושך של 12 שעות. ספק גישה חופשית למים ולכדורים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן וילקוקסון-מאן-וויטני U הלא-פאראמטרי. ערכי הסתברות (p) של ≤ 0.05 ו/או ≤ 0.01 נחשבו משמעותיים.

1. הכנה כללית פאזה טרום ניתוחית והיבטים הרדמה

1. חלקו את החולדות באופן אקראי לקבוצות טיפול בסלילים או בסטנטים (איור 2) באמצעות מערכת אקראיות מבוססת אינטרנט. כעת, בצע בדיקה קלינית טרום ניתוחית של כל בעלי החיים המתוכננים לניתוח ליד חדר ניתוח שקט, אספטי, תוך שמירה על טמפרטורת חדר של 23 ± 3 מעלות צלזיוס. לנתח את התנהגות בעלי החיים ולבדוק את הריריות והטורגור כחלק מהבדיקה הקלינית שלפני הניתוח.
2. רשום את משקלו של כל בעל חיים.
3. לפני הניתוח, הדגירה של שקיות העורקים מחולדות תורמות ב-0.1% נתרן דודציל סולפט למשך 10 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לקבל מפרצות דה-תאיות⁸. אספו את השקיות האלה מבעלי חיים תורמים כמה ימים לפני הניתוח.
   1. להכין את האורך המלא של אבי העורקים הבטני עם microscissors ומלקחת 6-0 ליגטורות שאינן ניתנות לספיגה במרווח של 3-4 מ"מ.
   2. ליצור באופן ישיר מפרצות חיוניות תוך ניתוחיות על ידי שקית כלי עורקים קשורה בעבר מהחלק החזי של בעל חיים תורם⁹. בצעו את בית החזה עם מספריים ומלקחיים כירורגיים בנקודת הזמן FU שצוינה ושחררו את נרתיק כלי השיט באורך הרצוי.
4. השתילו ישירות את השקית במקבל וקטפו את המפרצת מבעל החיים התורם להמשך ניתוח מקרוסקופי ועיבוד היסטולוגי.
5. להשראת הרדמה, הניחו את כל החולדות בקופסה נקייה המסופקת עם חמצן (O₂) עד לאובדן הכרה לאחר 5-10 דקות. מרדימים חולדות עם הזרקה תת עורית (SC) של תערובת של פנטניל 0.005 מ"ג/ק"ג, מדטומידין 0.15 מ"ג/ק"ג ומידזולם 2 מ"ג/ק"ג.
   הערה: זה מבטיח מטוס כירורגי של לפחות 45 דקות.
6. בדוק את עומק ההרדמה על ידי היעדר רפלקס הגמילה מהדוושה.
7. מניחים את החולדות בתנוחת שכיבה ומגלחים את החלק של בית החזה באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
8. קבעו את 4 כפותיהן של החולדות בנייר דבק על לוח, המכוסה על ידי כרית חימום המחוברת לבדיקה רקטלית המווסתת אוטומטית. הכנס את הבדיקה הרקטלית בפי הטבעת של החולדה כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה של 37 °C (74 °F) בעזרת כרית החימום.
9. כעת, התקינו חיישן ברגל האחורית הימנית המחובר למערכת ממוחשבת לבדיקת סימנים חיוניים תוך ניתוחי.
10. כסו את אפה ופיה של החולדה במסכת פנים. אם אתם זקוקים להרדמה ממושכת, התחילו באיזופלורן (1.0-2.0% ב-100% O₂).
11. יש לחטא את השדה הכירורגי באמצעות פובידון-יוד או חומרי חיטוי מתחלפים ולעטוף את שדה הניתוח בצורה סטרילית.
12. לטיפול פריאנסתטי, יש למרוח חומר סיכה אופתלמי סטרילי על העיניים ולכסות אותן במסכת נייר כסף אטומה כדי למנוע ייבוש ונזק מהמנורה הכירורגית.
13. במהלך הניתוח, ספקו חמצן באופן רציף דרך מסכת הפנים, עקבו אחר טמפרטורת הגוף וספקו חום באמצעות כרית חימום, תוך שמירה על נורמותרמיה.
14. עקוב אחר סימנים חיוניים אחרים באופן רציף (התנפחות דופק ונשימה, קצב לב ונשימה וריווי חמצן).

2. שלב ניתוחי - הזרקת מעקב תאים

הערה: הגישה הכירורגית המפורטת במפרצת הדופן המיקרו-כירורגית של חולדות הלסינקי מודל⁹ והטכניקות להשתלת סליל וסטנטים מתוארות במקום אחר ^8,10,11.

1. אחסן את עוקב התאים הליפופיליים הפלואורסצנטיים בטמפרטורה של ≤ -20 מעלות צלזיוס כל הזמן, מוגן מפני אור.
2. בצע את הניתוח על ידי הכנת אבי העורקים של החולדה וווריד החזיר, ולאחר מכן ההפרדה של שניהם, כמו גם הידוק זמני פרוקסימלי ודיסטלי של אבי העורקים.
   הערה: טכניקה זו תוארה בעבר⁹.
   1. הידקו את החלקים הפרוקסימליים והדיסטליים של אבי העורקים באמצעות שני קליפים זמניים של טיטאן.
3. שים מיקרוסוואב אחד עם ריפוד סגול כל אחד מתחת לחלקים הפרוקסימליים והדיסטליים של אבי העורקים להדמיה טובה יותר של העורק.
4. עכשיו, להגן על הבטן עם גזה רטובה.
5. ביום הניתוח, ממיסים 2 μL של עוקב התאים על ידי צנרת ב-1 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (PBS).
6. מעבירים את התערובת למזרק של 1 מ"ל המצויד בצינורית סטרילית בגודל 27-1/2 גרם (0.4 x 13 מ"מ).
   הערה: היזהרו להימנע מחשיפה לאור בעת ביצוע שלבים 2.5 ו-2.6.
7. כבו את האור בחדר הניתוח. תוך כדי התבוננות מתחת למיקרוסקופ, בצעו את ההזרקה החד-פעמית בחלק הגחוני האמצעי של אבי העורקים באמצעות מיקרו-מלקחיים והזיקו בזהירות 1 מ"ל של תמיסת מלח של 0.9% הפריניזציה.
8. הזריקו את עוקב התאים בזהירות (וידאו 1) וכבו מיד גם את המיקרוסקופ הפועל. שוב, להגן על הבטן עם גזה רטובה.
9. תנו לצבע לדגום לפחות 15 דקות. לאחר תקופת הדגירה, הדליקו את אורות המיקרוסקופ וחדר הניתוח.
10. לבצע את העורק האורכי ואת התפירה של המפרצת, כפי שתואר במקום אחר¹¹.
    1. השתמש במיקרו-כוחפים ובמיקרו-חתכים כדי לבצע את העורקים כך שאורכו ממוצע את קוטר המפרצת שנקטפה (שלב 1.3). כדי להבטיח את האורך הנכון, הניחו את המפרצת לצד אבי העורקים לפני ביצוע טרשת עורקים. תפרו את המפרצת עם 8-10 תפרים בודדים באמצעות תפר 10-0 שאינו ניתן לספיגה, והסירו בזהירות את המהדקים הזמניים - המתחילים באופן דיסטלי - תחת השקיה רציפה עם מי מלח הפרין. סגרו את הפצע בצורה מרובדת. שימו לב, השתמשו בצפיפות אריזת סליל של 1 ס"מ.
       הערה: הטכניקה של השתלת סליל או סטנטים תוארה במקום אחר ^8,10.

3. ניטור פאזה לאחר הניתוח וטיפול בשיכוך כאבים

1. בסוף הניתוח, הפכו את ההרדמה עם תערובת הזרקת SC של בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג, אטיפאמזול 0.75 מ"ג/ק"ג, ופלומאזניל 0.2 מ"ג/ק"ג. תנו לכל חיה המופעלת להתאושש בכלוב נקי עד שתהיה ערה לחלוטין וחמה, לפי הצורך, עם מנורת חימום.
2. במשך 3 ימים, מתן 1 מ"ג /ק"ג meloxicam (זריקה אחת או מריחה דרך הפה ליום) ו buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג ארבע פעמים ביום) SC. לילה, לספק buprenorphine ברציפות במי השתייה עם אותו מינון: 6 מ"ל buprenorphine 0.3 מ"ג / מ"ל, 360 מ"ל מי שתייה, 10 מ"ל של גלוקוז 5%.
3. בשלב המיידי שלאחר הניתוח, ישכנו כל בעל חיים בכלוב אחד להגנה. ארגנו מחדש את החיות לאחר 24 שעות.
4. אם חולדה כלשהי מראה התנהגות מצוקה או אגרסיבית לאחר הזרקת SC, יש לתת בופרנורפין במי השתייה במהלך היום.
5. ספקו הזנה רכה על רצפת הכלוב כדי לתמוך בהאכלה ובהתאוששות לאחר הניתוח.
6. להתבונן ולטפל בכל בעלי החיים על פי גיליון הרווחה והכאב.
7. נהלו משכך כאבים להצלה SC (מלוקסיקם 1 מ"ג/ק"ג ו-0.05 מ"ג/ק"ג בופרנורפין) בעת הצורך.

תוצאות

בסך הכל נכללו 31 בעלי חיים בסביבת המעבדה: 27 חולדות נכללו בניתוח הסטטיסטי הסופי; 4 חולדות מתו בטרם עת (שיעור תמותה של 12.9%). באופן תוך ניתוחי, התנפחות הנשימה הופחתה באופן משמעותי (p = 0.03) בסטנטים (12.9 מיקרומטר ± 0.7) בהשוואה לחולדות שטופלו בסליל (13.5 מיקרומטר ± 0.6). אנגיוגרפיה פלואורסצנטית בוצעה עב...

Discussion

מחקר זה מדגים כי היווצרות ניאו-אנטימה מתווכת באמצעות תאי אנדותל שמקורם בעורק האב של קומפלקס המפרצת, אך נתמכת על ידי גיוס תאים שמקורם בדופן המפרצת במפרצות חיוניות. עם זאת, תפקידם של תאי אב במחזור הדם בריפוי מפרצת נותר שנוי במחלוקת^12,13. בסך הכל, 31 חולדות לואיס ז?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary