Usando uma injeção de rastreador de células para investigar a origem de células formadoras de neointima em um modelo de parede lateral saccular de rato

Resumo

Realizamos uma injeção de traço de células lipofílicas de um ponto para rastrear células endoteliais, seguida de uma arteriotomia e sutura de aneurismas de parede lateral na aorta do rato abdominal. A formação de neointima parecia dependente da artéria parental em aneurismas descelularizados e foi promovida pelo recrutamento de células de parede de aneurisma em paredes vitais ricas em células.

Resumo

O recorte microcirúrgico cria uma barreira subsequente do fluxo sanguíneo em aneurismas intracranianos, enquanto o tratamento endovascular depende da formação de neointima e trombo. A fonte de células endoteliais que cobrem a camada endoluminal da neointima permanece incerta. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar a origem das células formadoras de neointima após a injeção de rastreador de células no já bem estabelecido modelo de aneurisma de parede lateral de helsinque.

Os aneurismas sidewall foram criados por bolsas arteriais suturadas ou vitais de ponta a ponta até a aorta em ratos machos de Lewis. Antes da arteriotomia com sutura de aneurisma, foi realizada uma injeção de rastreador de células contendo corante CM-Dil na aorta fixada para rotular células endoteliais no vaso adjacente e rastrear sua proliferação durante o seguimento (FU). Tratamento seguido de enrolamento (n = 16) ou stent (n = 15). Na FU (7 dias ou 21 dias), todos os ratos foram submetidos à angiografia de fluorescência, seguidos de colheita de aneurisma e avaliação macroscópica e histológica com contagem de células imunohistológicas para regiões específicas de interesse.

Nenhum dos 31 aneurismas se rompeu após o acompanhamento. Quatro animais morreram prematuramente. A perfusão macroscopicamente residual foi observada em 75,0% enroladas e 7,0% de ratos stents. A quantidade de células-rastreadas-positivas foi significativamente elevada em stent descelular em comparação com aneurismas enroladas em relação ao trombo no dia 7 (p = 0,01) e neointima no dia 21 (p = 0,04). Não foram encontradas diferenças significativas em trombos ou neointima em aneurismas vitais.

Esses achados confirmam padrões de cura piores em enrolados em comparação com aneurismas stented. A formação de neointima parece particularmente dependente da artéria parental em aneurismas descelularizados, enquanto é apoiada pelo recrutamento de células de parede de aneurisma em paredes vitais ricas em células. Em termos de tradução, o tratamento de stent pode ser mais apropriado para aneurismas altamente degenerados, enquanto o enrolamento sozinho pode ser adequado para aneurismas com paredes de vasos mais saudáveis.

Introdução

A hemorragia subaracnóide causada pela ruptura de um aneurisma intracraniano (IA) é uma condição neurocirúrgica devastadora associada à alta morbidade e mortalidade 1,2,3,4. Além do recorte microcirúrgico, que fornece contato direto entre endotélio endotélio endotélio, os dispositivos endovasculares ganharam cada vez mais importância nas últimas décadas para o tratamento de IAs rompidas e descobertas incidentalmente. A resposta de cura em IAs tratadas endovascularmente depende principalmente da formação de neointima e da organização do trombo. Ambos são processos sinérgicos, dependendo da migração celular do vaso adjacente e da parede do aneurisma. ⁵ Até o momento, a origem das células endoteliais na formação neointima de aneurismas tratados endovasculares permanece incerta. Há um debate em curso na literatura sobre a fonte a partir da qual as células formadoras de neointima são recrutadas.

Utilizando-se uma injeção de corante CM-Dil (ver a Tabela de Materiais) na aorta abdominal de ratos, tivemos como objetivo analisar o papel das células endoteliais, originárias da artéria parental, na formação de neointima em dois pontos de tempo diferentes de FU (dia 7 e dia 21) (Figura 1). Uma vantagem do modelo é a incubação direta local de rastreador de células in vivo em uma artéria parental antes da sutura do aneurisma, permitindo a FU em pontos de tempo posteriores. Técnicas de injeção in vivo , como a incubação de rastreadores de células, não foram descritas na literatura. Uma vantagem dessa técnica é a injeção direta, de um ponto, intraoperatória, in vivo , que torna o modelo robusto e reprodutível.

Protocolo

O apoio veterinário foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Local, suíça (BE 60/19). As diretrizes do ARRIVE e os princípios 3R foram rigorosamente seguidos ^6,7. Trinta e um ratos de Lewis, com 12 semanas de idade e pesando 492 ± 8 g, foram incluídos. Abriga todos os ratos a uma temperatura ambiente de 23 °C e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Fornecer acesso gratuito a água e pelotas. Análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste não paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney U. Os valores de probabilidade (p) de ≤ 0,05 e/ou ≤ 0,01 foram considerados significativos.

1. Preparação em fase-geral pré-operatória e aspectos anestesiológicos

1. Randomize ratos em grupos de tratamento de bobina ou stent (Figura 2) através de um sistema de randomização baseado na Web. Agora, realize um exame clínico pré-operatório de todos os animais planejados para cirurgia ao lado de uma sala de cirurgia tranquila e asséptica mantendo uma temperatura ambiente de 23 ± 3 °C. Analise o comportamento dos animais e inspecione as membranas mucosas e o turgor como parte do exame clínico pré-operatório.
2. Regissuor de cada animal.
3. Antes da cirurgia, incubar as bolsas arteriais de ratos doadores em sulfato de dodecyl de sódio de 0,1% por 10h a 37 °C para obter aneurismas descelularizados⁸. Pegue esses malotes de animais doadores alguns dias antes da cirurgia.
   1. Prepare toda a extensão da aorta abdominal com microscisores e fórceps e aplique ligaduras nãoabsorvíveis de 6-0 em um intervalo de 3-4 mm.
   2. Gerar diretamente aneurismas vitais intraoperatóriamente por uma bolsa de vaso arterial anteriormente ligada da parte torácica de um animal doador⁹. Realize a toracotomia com tesoura e fórceps cirúrgicos no ponto de tempo indicado da FU e ligate a bolsa do vaso no comprimento desejado.
4. Implante diretamente a bolsa no receptor e retire o aneurisma do animal doador para posterior análise macroscópica e processamento histológico.
5. Para indução de anestesia, coloque todos os ratos em uma caixa limpa fornecida com oxigênio (O₂) até a perda de consciência após 5-10 min. Anesthetize ratos com injeção subcutânea (SC) de uma mistura de fentanil 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg e midazolam 2 mg/kg.
   NOTA: Isso garante um plano cirúrgico de pelo menos 45 min.
6. Verifique a profundidade da anestesia pela ausência do reflexo de retirada do pedal.
7. Coloque os ratos em uma posição supina e raspe a parte toracoabdominal com uma máquina de barbear elétrica.
8. Fixar as 4 patas dos ratos com fita em uma tábua, coberta por uma almofada de aquecimento conectada a uma sonda retal autoreguladora. Insira a sonda retal no ânus do rato para manter a temperatura desejada de 37 °C com a ajuda da almofada de aquecimento.
9. Agora, instale um sensor na perna traseira direita conectado a um sistema informatizado para verificar sinais vitais intraoperatóriamente.
10. Cubra o nariz e a boca do rato com uma máscara facial. Se exigir anestesia prolongada, inicie isoflurane (1,0-2,0% titulado para efeito em 100% O₂).
11. Desinfete o campo cirúrgico com povidone-iodo ou desinfetantes alternados e drape o campo cirúrgico de forma estéril.
12. Para cuidados perianestésicos, aplique um lubrificante oftálmico estéril nos olhos e cubra-os com uma máscara de papel alumínio opaca para evitar a secagem e danos causados pela lâmpada cirúrgica.
13. Durante toda a cirurgia, forneça oxigênio continuamente através da máscara facial, monitore a temperatura corporal e forneça calor usando uma almofada de aquecimento, mantendo a normotermia.
14. Monitore outros sinais vitais continuamente (distensão de pulso e respiração, frequência cardíaca e respiração e saturação de oxigênio).

2. Fase operativa - injeção de rastreador de células

NOTA: A abordagem cirúrgica detalhada no aneurisma de parede lateral microcirúrgica de helsinque de helsinque modelo⁹ e técnicas para implantação de bobina e stent são descritas em outros lugares ^8,10,11.

1. Armazene o rastreador de células lipofílicas fluorescentes a ≤ -20 °C o tempo todo, protegido da luz.
2. Realizar a cirurgia preparando a aorta de rato e a veia caval, seguida da separação de ambos, bem como fixação temporária proximal e distal da aorta.
   NOTA: Esta técnica foi descrita anteriormente⁹.
   1. Fixar as partes proximais e distais da aorta com dois clipes de titã temporários.
3. Coloque um microswab com estofamento roxo cada um sob as partes proximais e distal da aorta para melhor visualização da artéria.
4. Agora, proteja o abdômen com gaze molhada.
5. No dia da operação, dissolva 2 μL do rastreador de células por tubulação em 1 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS).
6. Transfira a mistura para uma seringa de 1 mL equipada com uma cânula estéril de 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
   NOTA: Tenha cuidado para evitar a exposição à luz durante a realização das etapas 2.5 e 2.6.
7. Desligue a luz na sala de cirurgia. Ao olhar sob um microscópio, realize a injeção de um ponto na parte ventral média da aorta usando micro fórceps e injete cuidadosamente 1 mL de solução salina heparinizada de 0,9%.
8. Injete cuidadosamente o rastreador de células (Vídeo 1) e desligue imediatamente o microscópio operacional também. Novamente, proteja o abdômen com gaze molhada.
9. Deixe o corante incubar por pelo menos 15 minutos. Após o período de incubação, ligue o microscópio e as luzes da sala de cirurgia.
10. Realize a arteriotomia longitudinal e a sutura do aneurisma, conforme descrito em outros lugares¹¹.
    1. Use microforceps e microscisores para realizar a arteriotomia para que seu comprimento tenha uma média do diâmetro do aneurisma colhido (etapa 1.3). Para garantir o comprimento correto, coloque o aneurisma ao lado da aorta antes de realizar a arteriotomia. Suturar o aneurisma com 8-10 pontos únicos usando uma sutura 10-0 não removível, e remova cuidadosamente os grampos temporários de partida distral sob irrigação contínua com soro fisiológico heparinizado. Feche a ferida de forma em camadas. Note-se, use uma densidade de embalagem de bobina de 1 cm.
       NOTA: A técnica de implantação de bobina ou stent foi descrita em outros lugares ^8,10.

3. Monitoramento de fases pós-operatórias e cuidados analgésicos

1. Ao final da cirurgia, reverta a anestesia com uma mistura de injeção de SC de buprenorfina 0,05 mg/kg, atipamezol 0,75 mg/kg e flumazenil 0,2 mg/kg. Deixe cada animal operado se recuperar em uma gaiola limpa até que esteja totalmente acordado e aquecido, conforme necessário, com uma lâmpada de aquecimento.
2. Durante 3 dias, administre 1 mg/kg de meloxicam (uma injeção ou aplicação oral por dia) e buprenorfina (0,05 mg/kg quatro vezes por dia) SC. Durante a noite, forneça buprenorfina continuamente na água potável com a mesma dose: 6 mL buprenorfina 0,3 mg/mL, 360 mL de água potável, 10 mL de glicose.
3. Na fase pós-operatória imediata, abriga cada animal em uma única gaiola para proteção. Reagrupar os animais depois das 24h.
4. Se algum rato mostrar comportamento angustiado ou agressivo após a injeção de SC, administre buprenorfina na água potável durante o dia.
5. Forneça alimentação macia no chão da gaiola para apoiar a alimentação e a recuperação no pós-operatório.
6. Observe e cuide de todos os animais de acordo com o bem-estar e a folha de escore de dor.
7. Administrar analgesia de salvamento SC (meloxicam 1 mg/kg e 0,05 mg/kg buprenorfina) quando necessário.

Resultados

No cenário laboratorial foram incluídos 31 animais: 27 ratos foram incluídos na análise estatística final; 4 ratos morreram prematuramente (taxa de mortalidade de 12,9%). Intraoperativamente, a distensão respiratória foi significativamente reduzida (p = 0,03) reduzida em stent- (12,9 μm ± 0,7) em comparação com ratos tratados com bobina (13,5 μm ± 0,6). A angiografia da fluorescência foi realizada para cada rato no final da última FU. A reperfusão foi indicada em todos os 6 animais tratados com b...

Discussão

Este estudo demonstra que a formação de neointima é mediada através de células endoteliais originárias da artéria parental do complexo aneurisma, mas é apoiada pelo recrutamento de células derivadas da parede do aneurisma em aneurismas vitais. No entanto, o papel das células progenitoras circulantes na cura do aneurisma permanece controverso^12,13. No total, 31 ratos de Lewis foram incluídos nesta investigação; apenas 4 morreram prematuramente (12,9% ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary