Utilisation d’une injection de traceur cellulaire pour étudier l’origine des cellules formant neointima dans un modèle de paroi latérale sacculaire de rat

Résumé

Nous avons effectué une injection de traceur cellulaire lipophile en un point pour suivre les cellules endothéliales, suivie d’une artériotomie et de la suture d’anévrismes de la paroi latérale sur l’aorte abdominale du rat. La formation de Néoinntima semblait dépendre de l’artère mère dans les anévrismes décellularisés et était favorisée par le recrutement de cellules de la paroi de l’anévrisme dans les parois riches en cellules vitales.

Résumé

La coupure microchirurgicale crée une barrière ultérieure du flux sanguin dans les anévrismes intracrâniens, tandis que le traitement endovasculaire repose sur la formation de néoinntima et de thrombus. La source des cellules endothéliales recouvrant la couche endoluminale du néointame reste incertaine. Par conséquent, l’objectif de la présente étude était d’étudier l’origine des cellules formant le néoinntima après injection de traceur cellulaire dans le modèle d’anévrisme microchirurgical de la paroi latérale du rat d’Helsinki déjà bien établi.

Les anévrismes des flancs ont été créés en suturant des poches artérielles décellularisées ou vitales côte à côte de l’aorte chez les rats Lewis mâles. Avant l’artériotomie avec suture d’anévrisme, une injection de traceur cellulaire contenant du colorant CM-Dil a été effectuée dans l’aorte serrée pour marquer les cellules endothéliales dans le vaisseau adjacent et suivre leur prolifération pendant le suivi (FU). Traitement suivi d’un enroulement (n = 16) ou d’une endoprothèse (n = 15). À FU (7 jours ou 21 jours), tous les rats ont subi une angiographie par fluorescence, suivie d’une récolte d’anévrisme et d’une évaluation macroscopique et histologique avec un nombre de cellules immunohistologiques pour des régions d’intérêt spécifiques.

Aucun des 31 anévrismes ne s’était rompu lors du suivi. Quatre animaux sont morts prématurément. Une perfusion macroscopiquement résiduelle a été observée chez 75,0 % de rats enroulés et 7,0 % de rats stentés. La quantité de cellules cell-tracer-positives était significativement élevée dans les stents décellularisés par rapport aux anévrismes enroulés en ce qui concerne le thrombus au jour 7 (p = 0,01) et le néointame au jour 21 (p = 0,04). Aucune différence significative n’a été trouvée dans le thrombus ou le néointame dans les anévrismes vitaux.

Ces résultats confirment des schémas de guérison pires dans les anévrismes enroulés par rapport aux anévrismes à stent. La formation de Neointima semble particulièrement dépendante de l’artère mère dans les anévrismes décellularisés, alors qu’elle est soutenue par le recrutement à partir des cellules de la paroi de l’anévrisme dans les parois riches en cellules vitales. En termes de traduction, le traitement par stent pourrait être plus approprié pour les anévrismes fortement dégénérés, tandis que l’enroulement seul pourrait être adéquat pour les anévrismes avec des parois vasculaires pour la plupart saines.

Introduction

L’hémorragie sous-arachnoïdienne causée par la rupture d’un anévrisme intracrânien (IA) est une affection neurochirurgicale dévastatrice associée à une morbidité et une mortalité élevées 1,2,3,4. En plus de la coupure microchirurgicale, qui fournit un contact direct entre l’endothélium et l’endothélium, les dispositifs endovasculaires ont acquis une importance croissante au cours des dernières décennies pour traiter les IA rompues et découvertes accidentellement. La réponse cicatrisante dans les IA traitées par endovasculairement dépend principalement de la formation de néointame et de l’organisation du thrombus. Les deux sont des processus synergiques, en fonction de la migration cellulaire du vaisseau adjacent et de la paroi de l’anévrisme. ⁵ À ce jour, l’origine des cellules endothéliales dans la formation de néoiintima des anévrismes endovasculaires traités reste incertaine. Il y a un débat en cours dans la littérature sur la source à partir de laquelle les cellules formant la néoinntima sont recrutées.

En utilisant une injection de traceur cellulaire de colorant CM-Dil (voir le tableau des matériaux) dans l’aorte abdominale de rats, nous avons cherché à analyser le rôle des cellules endothéliales, provenant de l’artère mère, dans la formation de néointame à deux points temporels DIFFÉRENTS (jour 7 et jour 21) (Figure 1). Un avantage du modèle est l’incubation directe in vivo d’un traceur cellulaire local dans une artère parente avant la suture de l’anévrisme, permettant l’UF à des moments ultérieurs. Les techniques d’injection in vivo , telles que l’incubation par traceur cellulaire, n’ont pas été décrites dans la littérature. Un avantage de cette technique est l’injection directe, en un point, peropératoire, in vivo , qui rend le modèle robuste et reproductible.

Protocole

Le soutien vétérinaire a été effectué conformément aux directives institutionnelles. Les expériences ont été approuvées par le Comité local d’éthique de suisse (BE 60/19). Les directives ARRIVE et les principes 3R ont été strictement suivis ^6,7. Trente et un rats Lewis mâles, âgés de 12 semaines et pesant 492 ± 8 g, ont été inclus. Hébergez tous les rats à une température ambiante de 23 °C et à un cycle lumière/obscurité de 12 h. Fournir un accès gratuit à l’eau et aux granulés. Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du test non paramétrique Wilcoxon-Mann-Whitney U. Les valeurs de probabilité (p) de ≤ 0,05 et/ou ≤ 0,01 ont été jugées significatives.

1. Préparation générale de la phase préopératoire et aspects anesthésiologiques

1. Randomiser les rats en groupes de traitement par bobine ou stent (Figure 2) via un système de randomisation basé sur le Web. Maintenant, effectuez un examen clinique préopératoire de tous les animaux prévus pour la chirurgie à côté d’une salle d’opération silencieuse et aseptique en maintenant une température ambiante de 23 ± 3 ° C. Analyser le comportement des animaux et inspecter les muqueuses et la turgescence dans le cadre de l’examen clinique préopératoire.
2. Notez le poids de chaque animal.
3. Avant la chirurgie, incuber les poches artérielles de rats donneurs dans du dodécylsulfate de sodium à 0,1 % pendant 10 h à 37 °C pour obtenir des anévrismes décellularisés⁸. Prélevez ces poches sur des animaux donneurs quelques jours avant la chirurgie.
   1. Préparez toute la longueur de l’aorte abdominale avec des microcissives et des pinces et appliquez 6-0 ligatures non absorbables à un intervalle de 3-4 mm.
   2. Générer directement des anévrismes vitaux en peropératoire par une poche de vaisseau artériel préalablement ligaturée à partir de la partie thoracique d’un animal donneur⁹. Effectuez une thoracotomie avec des ciseaux et des pinces chirurgicales au point de temps FU indiqué et ligaturez la poche du vaisseau à la longueur souhaitée.
4. Implantez directement la poche dans le receveur et récoltez l’anévrisme de l’animal donneur pour une analyse macroscopique et un traitement histologique ultérieurs.
5. Pour l’induction de l’anesthésie, placez tous les rats dans une boîte propre contenant de l’oxygène (O₂) jusqu’à la perte de conscience après 5-10 min. Anesthésier les rats avec une injection sous-cutanée (SC) d’un mélange de fentanyl 0,005 mg/kg, de médétomidine 0,15 mg/kg et de midazolam 2 mg/kg.
   REMARQUE: Cela garantit un plan chirurgical d’au moins 45 min.
6. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence du réflexe de retrait de la pédale.
7. Placez les rats en position couchée et rasez la partie thoraco-abdominale avec un rasoir électrique.
8. Fixez les 4 pattes des rats avec du ruban adhésif sur une planche, recouverte d’un coussin chauffant relié à une sonde rectale autorégulatrice. Insérez la sonde rectale dans l’anus du rat pour maintenir la température souhaitée de 37 °C à l’aide du coussin chauffant.
9. Maintenant, installez un capteur sur la patte arrière droite connecté à un système informatisé pour vérifier les signes vitaux en peropératoire.
10. Couvrez le nez et la bouche du rat avec un masque facial. Si vous avez besoin d’une anesthésie prolongée, commencez l’isoflurane (1,0-2,0% titré pour agir dans 100% O₂).
11. Désinfectez le champ chirurgical avec de la povidone-iode ou des désinfectants alternatifs et drapez le champ chirurgical de manière stérile.
12. Pour les soins périanesthésiques, appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les yeux et couvrez-les d’un masque en aluminium opaque pour éviter le dessèchement et les dommages causés par la lampe chirurgicale.
13. Tout au long de la chirurgie, fournissez de l’oxygène en continu via le masque facial, surveillez la température corporelle et fournissez de la chaleur à l’aide d’un coussin chauffant, en maintenant la normothermie.
14. Surveillez en permanence d’autres signes vitaux (distension du pouls et de la respiration, fréquence cardiaque et respiratoire et saturation en oxygène).

2. Phase opératoire - injection de traceur cellulaire

REMARQUE: L’approche chirurgicale détaillée dans le modèle⁹ de l’anévrisme microchirurgical de la paroi latérale du rat d’Helsinki et les techniques d’implantation de bobines et de stents sont décrites ailleurs ^8,10,11.

1. Conservez le traceur de cellules lipophiles fluorescent à ≤ -20 °C tout le temps, à l’abri de la lumière.
2. Effectuez la chirurgie en préparant l’aorte du rat et la veine cavale, suivie de la séparation des deux, ainsi que du serrage temporaire proximal et distal de l’aorte.
   REMARQUE: Cette technique a été décrite précédemment⁹.
   1. Serrez les parties proximale et distale de l’aorte avec deux clips de titane temporaires.
3. Mettez un micro-ondeur avec un rembourrage violet sous les parties proximale et distale de l’aorte pour une meilleure visualisation de l’artère.
4. Maintenant, protégez l’abdomen avec de la gaze humide.
5. Le jour de l’opération, dissoudre 2 μL du traceur cellulaire par pipetage dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
6. Transférer le mélange dans une seringue de 1 mL munie d’une canule stérile de 27 1/2 G (0,4 x 13 mm).
   REMARQUE: Veillez à éviter l’exposition à la lumière lors de l’exécution des étapes 2.5 et 2.6.
7. Éteignez la lumière dans la salle d’opération. Tout en regardant au microscope, effectuez l’injection en un point dans la partie ventrale moyenne de l’aorte à l’aide de micro-pinces et injectez soigneusement 1 mL de solution saline héparinisée à 0,9%.
8. Injectez soigneusement le traceur de cellules (vidéo 1) et éteignez immédiatement le microscope opératoire. Encore une fois, protégez l’abdomen avec de la gaze humide.
9. Laissez le colorant incuber pendant au moins 15 min. Après la période d’incubation, allumez les lumières du microscope et de la salle d’opération.
10. Effectuer l’artériotomie longitudinale et la suture de l’anévrisme, comme décrit ailleurs¹¹.
    1. Utilisez des microforceps et des microcisseurs pour effectuer l’artériotomie afin que sa longueur soit en moyenne le diamètre de l’anévrisme récolté (étape 1.3). Pour assurer la longueur correcte, placez l’anévrisme à côté de l’aorte avant d’effectuer une artériotomie. Suturez l’anévrisme avec 8-10 points simples à l’aide d’une suture 10-0 non absorbable et retirez soigneusement les pinces temporaires - en commençant distalement - sous irrigation continue avec une solution saline héparinisée. Fermez la plaie de manière stratifiée. Il est à noter d’utiliser une densité d’emballage de bobine de 1 cm.
       NOTE: La technique d’implantation de bobine ou de stent a été décrite ailleurs ^8,10.

3. Surveillance de phase postopératoire et soins analgésiques

1. À la fin de la chirurgie, inverser l’anesthésie avec un mélange d’injection SC de buprénorphine 0,05 mg / kg, d’atipamezol 0,75 mg / kg et de flumazénil 0,2 mg / kg. Laissez chaque animal opéré récupérer dans une cage propre jusqu’à ce qu’il soit complètement éveillé et chaud, au besoin, avec une lampe chauffante.
2. Pendant 3 jours, administrer 1 mg/kg de méloxicam (une injection ou une application orale par jour) et de la buprénorphine (0,05 mg/kg quatre fois par jour) SC. Pendant la nuit, fournir de la buprénorphine en continu dans l’eau potable avec le même dosage : 6 mL de buprénorphine 0,3 mg/mL, 360 mL d’eau potable, 10 mL de glucose à 5 %.
3. Dans la phase postopératoire immédiate, hébergez chaque animal dans une seule cage pour la protéger. Regrouper les animaux après 24 h.
4. Si un rat montre un comportement angoissé ou agressif après l’injection de SC, administrer de la buprénorphine dans l’eau potable pendant la journée.
5. Fournir des aliments mous sur le sol de la cage pour soutenir l’alimentation et la récupération postopératoire.
6. Observez et prenez soin de tous les animaux en fonction de la feuille de score de bien-être et de douleur.
7. Administrer une analgésie de secours SC (méloxicam 1 mg/kg et 0,05 mg/kg de buprénorphine) au besoin.

Résultats

Au total, 31 animaux ont été inclus en laboratoire : 27 rats ont été inclus dans l’analyse statistique finale; 4 rats sont morts prématurément (taux de mortalité de 12,9%). En peropératoire, la distension respiratoire a été significativement réduite (p = 0,03) chez les rats stent( 12,9 μm ± 0,7) par rapport aux rats traités par bobine (13,5 μm ± 0,6). Une angiographie par fluorescence a été réalisée pour chaque rat à la fin de l’UF finale. La reperfusion a été indiquée chez les 6 anim...

Discussion

Cette étude démontre que la formation de néointame est médiée par des cellules endothéliales provenant de l’artère mère du complexe anévrisme, mais est soutenue par le recrutement de cellules dérivées de la paroi de l’anévrisme dans les anévrismes vitaux. Néanmoins, le rôle des cellules progénitrices circulantes dans la guérison de l’anévrisme reste controversé^12,13. Dans l’ensemble, 31 rats Lewis mâles ont été inclus dans cette enqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary