Использование инъекции клеточного индикатора для исследования происхождения неоинтимообразующих клеток в модели мешковидной боковой стенки крысы

Резюме

Мы выполнили одноточечную инъекцию липофильного индикатора клеток для отслеживания эндотелиальных клеток, после чего последовала артериотомия и наложение швов аневризм боковой стенки на брюшную аорту крыс. Образование неоинтимы, по-видимому, зависело от родительской артерии в децеллюляризованных аневризмах и стимулировалось набором из клеток стенки аневризмы в жизненно важные клеточные стенки.

Аннотация

Микрохирургическое обрезание создает последующий барьер кровотока в внутричерепные аневризмы, тогда как эндоваскулярное лечение опирается на образование неоинтимы и тромба. Источник эндотелиальных клеток, покрывающих эндолюминальный слой неоинтимы, остается неясным. Поэтому целью настоящего исследования было исследование происхождения неоинтимообразующих клеток после инъекции клеточного индикатора в уже хорошо зарекомендовавшей себя модели микрохирургической аневризмы боковой стенки крыс в Хельсинки.

Аневризмы боковых стенок были созданы путем наложения швов децеллюляризированных или жизненно важных артериальных мешочков из стороны в сторону к аорте у самцов крыс Льюиса. Перед артериотомией со швом аневризмы в зажатую аорту была выполнена инъекция клеточного индикатора, содержащая краситель CM-Dil, для маркировки эндотелиальных клеток в соседнем сосуде и отслеживания их пролиферации во время наблюдения (FU). Лечение с последующим намоткой (n = 16) или стентированием (n = 15). В FU (7 дней или 21 день) все крысы прошли флуоресцентную ангиографию с последующим сбором аневризмы и макроскопической и гистологической оценкой с иммуногистологическим количеством клеток для конкретных областей, представляющих интерес.

Ни одна из 31 аневризмы не разорвалась при последующем наблюдении. Четыре животных умерли преждевременно. Макроскопически остаточная перфузия наблюдалась у 75,0% спиральных и 7,0% стентированных крыс. Количество клеточно-индикатор-положительных клеток было значительно повышено в децеллюляризированном стентированном стентировании по сравнению с спиральными аневризмами по отношению к тромбу на 7-й день (p = 0,01) и неоинтиме на 21-й день (p = 0,04). Не было обнаружено существенных различий в тромбе или неоинтиме при жизненно важных аневризмах.

Эти результаты подтверждают худшие закономерности заживления в спиральных по сравнению со стентированными аневризмами. Образование неоинтимы, по-видимому, особенно зависит от родительской артерии в децеллюляризированных аневризмах, тогда как оно поддерживается рекрутацией из клеток стенки аневризмы в жизненно важные клеточные стенки. С точки зрения трансляции, лечение стентом может быть более подходящим для сильно дегенеративных аневризм, тогда как одна только спираль может быть адекватной для аневризм с в основном здоровыми стенками сосудов.

Введение

Субарахноидальное кровоизлияние, вызванное разрывом внутричерепной аневризмы (ИА), является разрушительным нейрохирургическим состоянием, связанным с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2,3,4. В дополнение к микрохирургическому клипированию, которое обеспечивает прямой контакт эндотелия с эндотелием, эндоваскулярные устройства приобретают все большее значение за последние десятилетия для лечения разорванных и случайно обнаруженных МА. Реакция заживления в эндоваскулярно обработанных ИА в основном зависит от образования неоинтимы и организации тромба. Оба являются синергетическими процессами, зависящими от миграции клеток из соседнего сосуда и стенки аневризмы. ⁵ На сегодняшний день происхождение эндотелиальных клеток в неоинтиме образование эндоваскулярных обработанных аневризм остается неясным. В литературе продолжаются споры об источнике, из которого набираются неоинтимообразующие клетки.

Используя клеточно-индикаторную инъекцию красителя CM-Dil (см. Таблицу материалов) в брюшную аорту крыс, мы стремились проанализировать роль эндотелиальных клеток, происходящих из родительской артерии, в формировании неоинтимы в двух разных точках времени FU (день 7 и день 21) (рисунок 1). Преимуществом модели является прямая локальная инкубация индикатора клеток in vivo в родительской артерии до шва аневризмы, что позволяет FU в более поздние моменты времени. Методы инъекций in vivo , такие как инкубация клеточного индикатора, не были описаны в литературе. Преимуществом этой методики является прямая, одноточечная, интраоперационная, in vivo инъекция, что делает модель надежной и воспроизводимой.

протокол

Ветеринарная поддержка осуществлялась в соответствии с институциональными руководящими принципами. Эксперименты были одобрены Местным комитетом по этике, Швейцария (BE 60/19). Руководящие принципы ARRIVE и принципы 3R строго^{соблюдаются 6,7}. Тридцать один самец крыс Льюиса, 12 недель и весом 492 ± 8 г, были включены. Разводят всех крыс при комнатной температуре 23 °C и 12-часовом цикле свет/темнота. Обеспечьте свободный доступ к воде и пеллетам. Статистический анализ был выполнен с использованием непараметрического теста Уилкоксона-Манна-Уитни U. Значения вероятности (p) ≤ 0,05 и/или ≤ 0,01 были признаны значимыми.

1. Предоперационная фаза - общая подготовка и анестезиологические аспекты

1. Рандомизируйте крыс в группы обработки катушки или стента (рисунок 2) с помощью веб-системы рандомизации. Теперь проведите предоперационное клиническое обследование всех животных, запланированных к операции, рядом с тихой, асептической операционной, поддерживающей комнатную температуру 23 ± 3 °C. Анализ поведения животных и осмотр слизистых оболочек и тургора в рамках предоперационного клинического обследования.
2. Запишите вес каждого животного.
3. Перед операцией инкубируют артериальные мешочки крыс-доноров в 0,1% додецилсульфата натрия в течение 10 ч при 37 °C для получения децеллюляризованных аневризм⁸. Соберите эти мешочки с животных-доноров за несколько дней до операции.
   1. Подготовьте по всей длине брюшную аорту микросубсидами и щипцами и нанесите 6-0 нерассасывающихся лигатур с интервалом 3-4 мм.
   2. Непосредственно генерировать жизненно важные аневризмы интраоперационно с помощью ранее перевязанного мешочка артериального сосуда из грудной части животного-донора⁹. Выполните торакотомию ножницами и хирургическими щипцами в указанном моменте времени ФУ и обжарьте сосуд мешочек на нужную длину.
4. Непосредственно имплантируйте мешочек в реципиента и соберите аневризму у животного-донора для дальнейшего макроскопического анализа и гистологической обработки.
5. Для индукции анестезии поместите всех крыс в чистую коробку, обеспеченную кислородом (_О2), до потери сознания через 5-10 мин. Анестезируют крыс подкожной (SC) инъекцией смеси фентанила 0,005 мг/кг, медетомидина 0,15 мг/кг и мидазолама 2 мг/кг.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает хирургическую плоскость не менее 45 минут.
6. Проверьте глубину анестезии по отсутствию рефлекса снятия педали.
7. Поместите крыс в лежачее положение и побрейте торакоабдоминальную часть электробритвой.
8. Зафиксируйте 4 лапы крыс лентой на доске, покрытой грелкой, соединенной с авторегуляционным ректальным зондом. Вставьте ректальный зонд в анус крысы для поддержания нужной температуры 37 °C с помощью грелки.
9. Теперь установите датчик на правой задней ноге, подключенный к компьютеризированной системе для интраоперационной проверки жизненно важных показателей.
10. Накройте нос и рот крысы маской для лица. Если требуется длительная анестезия, начинают изофлуран (1,0-2,0% титруют для эффекта в 100%_O2).
11. Продезинфицируйте хирургическое поле повидоном-йодом или чередующимися дезинфицирующими средствами и задрапируйте хирургическое поле стерильным способом.
12. Для перианестетической помощи нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза и накройте их непрозрачной фольгированной маской, чтобы предотвратить высыхание и повреждение от хирургической лампы.
13. На протяжении всей операции непрерывно подавайте кислород через маску для лица, контролируйте температуру тела и поддерживайте тепло с помощью грелки, поддерживая нормотермию.
14. Непрерывно контролируйте другие жизненно важные показатели (пульс и растяжение дыхания, частоту сердечных сокращений и дыхания, а также насыщение кислородом).

2. Оперативная фаза - инъекция клеточного индикатора

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный хирургический подход в модели⁹ микрохирургической аневризмы боковой стенки крыс в Хельсинки и методы имплантации катушек и стентов описаны в другом месте ^8,10,11.

1. Храните флуоресцентный липофильный индикатор клеток при ≤ -20 °C все время, защищенный от света.
2. Выполняют операцию путем подготовки аорты крысы и кавальной вены с последующим отделением обоих, а также проксимальным и дистальным временным зажимом аорты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника была описана ранее⁹.
   1. Зажмите проксимальную и дистальную части аорты двумя временными титановыми зажимами.
3. Поместите один микросваб с фиолетовой прокладкой каждый под проксимальную и дистальную части аорты для лучшей визуализации артерии.
4. Теперь защитите живот мокрой марлей.
5. В день операции растворяют 2 мкл индикатора клеток путем пипетирования в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
6. Переложите смесь на шприц объемом 1 мл, снабженный стерильной канюлей весом 27-1/2 г (0,4 x 13 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать воздействия света при выполнении шагов 2.5 и 2.6.
7. Выключите свет в операционной. Глядя под микроскоп, выполните одноточечную инъекцию в среднюю вентральную часть аорты с помощью микрощипцов и осторожно введите 1 мл гепаринизированного 0,9% физиологического раствора.
8. Осторожно введите индикатор клеток (Видео 1) и немедленно выключите работающий микроскоп. Опять же, защитите живот мокрой марлей.
9. Дайте красителю инкубировать не менее 15 минут. После инкубационного периода включите микроскоп и подсветку операционной.
10. Выполняют продольную артериотомию и наложение швов аневризмы, как описано в другом месте¹¹.
    1. Используйте микрофорфорсы и микросубчики для выполнения артериотомии так, чтобы ее длина усредняла диаметр собранной аневризмы (шаг 1.3). Чтобы обеспечить правильную длину, поместите аневризму рядом с аортой перед выполнением артериотомии. Зашить аневризму 8-10 одиночными швами с помощью нерассасывающегося шва 10-0 и аккуратно снять временные зажимы, начинающиеся дистально, под непрерывным орошением гепаринизированным физиологическим раствором. Закройте рану послойным способом. Следует отметить, что используйте катушку плотности упаковки 1 см.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Методика спиральной или стент-имплантации была описана в другом месте ^8,10.

3. Послеоперационный фазовый мониторинг и обезболивающий уход

1. В конце операции отмените анестезию инъекционной смесью SC бупренорфина 0,05 мг/кг, атипамезола 0,75 мг/кг и флумазенила 0,2 мг/кг. Пусть каждое эксплуатируемое животное выздоровеет в чистой клетке до полного бодрствования и тепла, по мере необходимости, с помощью нагревательной лампы.
2. В течение 3 дней вводят 1 мг/кг мелоксикама (одна инъекция или пероральное применение в день) и бупренорфин (0,05 мг/кг четыре раза в день) SC. На ночь вводят бупренорфин непрерывно в питьевую воду с той же дозировкой: 6 мл бупренорфина 0,3 мг/мл, 360 мл питьевой воды, 10 мл 5% глюкозы.
3. В непосредственной послеоперационной фазе поместите каждое животное в одну клетку для защиты. Перегруппируйте животных через 24 ч.
4. Если какая-либо крыса демонстрирует дистрессное или агрессивное поведение после инъекции СК, вводите бупренорфин в питьевую воду в течение дня.
5. Обеспечьте мягкое кормление на полу клетки для поддержки кормления и восстановления после операции.
6. Наблюдайте и ухаживайте за всеми животными в соответствии с таблицей оценки благополучия и боли.
7. При необходимости вводят спасательную анальгезию SC (мелоксикам 1 мг/кг и 0,05 мг/кг бупренорфина).

Результаты

В лабораторных условиях было включено в общей сложности 31 животное: 27 крыс были включены в окончательный статистический анализ; 4 крысы умерли преждевременно (смертность 12,9%). Интраоперационно растяжение дыхания было значительно снижено (p = 0,03) у стент- (12,9 мкм ± 0,7) по сравнению с кры...

Обсуждение

Это исследование показывает, что образование неоинтимы опосредовано эндотелиальными клетками, происходящими из родительской артерии комплекса аневризмы, но поддерживается набором клеток, полученных из стенки аневризмы в жизненно важных аневризмах. Тем не менее, роль циркулирующих к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary