Bir Sıçan Sakküler Yan Duvar Modelinde Neointima Oluşturan Hücrelerin Kökenini Araştırmak için Bir Hücre İzleyici Enjeksiyonu Kullanma

Özet

Endotel hücrelerini izlemek için tek noktalı, lipofilik hücre izleyici enjeksiyonu, ardından arteriyotomi ve abdominal sıçan aortunda yanak duvar anevrizmalarının dikilmesi yapıldı. Neointima oluşumu, desellülarize anevrizmalarda ana artere bağımlı görünüyordu ve hayati hücre bakımından zengin duvarlardaki anevrizma duvarı hücrelerinden işe alım ile desteklendi.

Özet

Mikrocerrahi kırpma, intrakraniyal anevrizmalara kan akışının daha sonra bir bariyerini oluştururken, endovasküler tedavi neointima ve trombüs oluşumuna dayanır. Neointimanın endoluminal tabakasını kaplayan endotel hücrelerinin kaynağı belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, halihazırda köklü Helsinki sıçan mikrocerrahi yanak anevrizma modelinde hücre izleyici enjeksiyonu sonrası neointima oluşturan hücrelerin kökenini araştırmaktır.

Yanak anevrizmaları, erkek Lewis sıçanlarında desellülarize veya vital arteriyel poşetlerin aortla uçtan yana dikilmesi ile oluşturuldu. Anevrizma sütürü ile arteriyotomiden önce, komşu damardaki endotel hücrelerini etiketlemek ve takip sırasında proliferasyonlarını izlemek için kelepçeli aort içine CM-Dil boyası içeren bir hücre izleyici enjeksiyonu yapıldı (FU). Tedavi sonrasında sarma (n = 16) veya stent (n = 15) uygulanır. FU'da (7 gün veya 21 gün), tüm sıçanlara floresan anjiyografi, ardından anevrizma hasadı ve belirli ilgi alanları için immünohistolojik hücre sayımları ile makroskopik ve histolojik değerlendirme yapıldı.

31 anevrizmanın hiçbiri takipte yırtılmamıştı. Dört hayvan erken öldü. Stentli sıçanların %75.0'ında ve %7.0'ında makroskopik olarak rezidüel perfüzyon gözlendi. Desellülarize stentlerde hücre izleyici pozitif hücre miktarı, 7. günde trombüs (p=0.01) ve 21. günde neointima (p=0.04) açısından sarmal anevrizmalara göre anlamlı derecede artmıştır. Vital anevrizmalarda trombüs veya neointimada anlamlı fark saptanmadı.

Bu bulgular, stentli anevrizmalara kıyasla sarmallarda daha kötü iyileşme paternlerini doğrulamaktadır. Neointima oluşumu özellikle desellülerize anevrizmalarda ana artere bağımlı görünürken, vital hücre bakımından zengin duvarlarda anevrizma duvarı hücrelerinden işe alım ile desteklenmektedir. Translasyon açısından, stent tedavisi yüksek oranda dejenere olmuş anevrizmalar için daha uygun olabilirken, çoğunlukla sağlıklı damar duvarlarına sahip anevrizmalar için tek başına sarma yeterli olabilir.

Giriş

İntrakraniyal anevrizmanın (İA) rüptürü sonucu gelişen subaraknoid kanama, yüksek morbidite ve mortalite^ile ilişkili yıkıcı bir nöroşirürjik durumdur 1,2,3,4. Endotelden endotele doğrudan temas sağlayan mikrocerrahi kırpmaya ek olarak, endovasküler cihazlar son yıllarda rüptüre olmuş ve tesadüfen keşfedilen İA'ların tedavisinde giderek artan bir önem kazanmıştır. Endovasküler olarak tedavi edilen İA'larda iyileşme yanıtı esas olarak neointima oluşumuna ve trombüs organizasyonuna bağlıdır. Her ikisi de bitişik damardan ve anevrizma duvarından hücre göçüne bağlı olarak sinerjik süreçlerdir. ⁵ Endovasküler tedavi edilen anevrizmaların neointima oluşumunda endotel hücrelerinin kökeni bugüne kadar belirsizliğini korumaktadır. Literatürde, neointima oluşturan hücrelerin işe alındığı kaynak hakkında devam eden bir tartışma vardır.

Sıçanların abdominal aortunda CM-Dil boyasının hücre izleyici enjeksiyonunu kullanarak ( Materyal Tablosuna bakınız), iki farklı FU zaman noktasında (gün 7 ve gün 21) neointima oluşumunda ana arterden kaynaklanan endotel hücrelerinin rolünü analiz etmeyi amaçladık (Şekil 1). Modelin bir avantajı, anevrizma sütüründen önce bir ebeveyn arterinde in vivo olarak doğrudan lokal hücre izleyici inkübasyonudur ve daha sonraki zaman noktalarında FU'ya izin verir. Hücre izleyici inkübasyonu gibi in vivo enjeksiyon teknikleri literatürde tanımlanmamıştır. Bu tekniğin bir avantajı, modeli sağlam ve tekrarlanabilir kılan doğrudan, tek noktalı, intraoperatif, in vivo enjeksiyondur.

Protokol

Veteriner desteği kurumsal kılavuzlara göre yapıldı. Deneyler İsviçre Yerel Etik Komitesi (BE 60/19) tarafından onaylanmıştır. ARRIVE yönergeleri ve 3R ilkeleri sıkı bir şekilde takip edilmiştir ^6,7. 12 haftalık ve 492 ± 8 g ağırlığında otuz bir erkek Lewis sıçanı dahil edildi. Tüm sıçanları 23 ° C'lik bir oda sıcaklığında ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırın. Suya ve peletlere ücretsiz erişim sağlayın. İstatistiksel analizler parametrik olmayan Wilcoxon-Mann-Whitney U testi kullanılarak yapılmıştır. 0.05 ve/veya 0.01 ≤ ≤ olasılık değerleri (p) anlamlı kabul edildi.

1. Preoperatif faz-genel hazırlık ve anesteziyolojik yönler

1. Web tabanlı randomizasyon sistemi aracılığıyla sıçanları bobin veya stent tedavi gruplarına randomize edin (Şekil 2). Şimdi, 23 ± 3 ° C'lik bir oda sıcaklığını koruyan sessiz, aseptik bir ameliyathanenin yanında ameliyat için planlanan tüm hayvanların ameliyat öncesi klinik muayenesini yapın. Hayvanların davranışlarını analiz edin ve ameliyat öncesi klinik muayenenin bir parçası olarak mukoza zarlarını ve turgoru inceleyin.
2. Her hayvanın ağırlığını kaydedin.
3. Ameliyattan önce, desellülarize anevrizmalar elde etmek için donör sıçanlardan arteriyel poşetleri 37 ° C'de 10 saat boyunca% 0.1 sodyum dodesil sülfat içinde inkübe edin⁸. Bu keseleri ameliyattan birkaç gün önce donör hayvanlardan toplayın.
   1. Abdominal aortun tam uzunluğunu mikromakas ve forseps ile hazırlayın ve 3-4 mm aralıklarla 6-0 emilemeyen ligatür uygulayın.
   2. Bir donör hayvanın torasik kısmından daha önce bağlanmış bir arteriyel damar kesesi tarafından intraoperatif olarak doğrudan hayati anevrizmalar üretir⁹. Belirtilen FU zaman noktasında makas ve cerrahi forseps ile torakotomi yapın ve damar kesesini istenen uzunlukta yaslanın.
4. Poşeti doğrudan alıcıya implante edin ve daha fazla makroskopik analiz ve histolojik işlem için anevrizmayı donör hayvandan toplayın.
5. Anestezi indüksiyonu için, tüm sıçanları 5-10 dakika sonra bilinç kaybına kadar oksijen (_O2) ile donatılmış temiz bir kutuya yerleştirin. Sıçanları, 0.005 mg / kg, medetomidin 0.15 mg / kg ve midazolam 2 mg / kg karışımının deri altı (SC) enjeksiyonu ile anestezi altına alın.
   NOT: Bu, en az 45 dakikalık bir cerrahi düzlem sağlar.
6. Pedal çekilme refleksinin yokluğunda anestezi derinliğini kontrol edin.
7. Sıçanları sırtüstü pozisyona yerleştirin ve torakoabdominal kısmı elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin.
8. Sıçanların 4 pençesini, otomatik düzenleyici bir rektal proba bağlı bir ısıtma yastığı ile kaplanmış bir tahta üzerine bantla sabitleyin. Isıtma yastığı yardımıyla istenen sıcaklığı 37 ° C'de tutmak için rektal probu sıçanın anüsüne yerleştirin.
9. Şimdi, intraoperatif olarak hayati belirtileri kontrol etmek için bilgisayarlı bir sisteme bağlı sağ arka bacağa bir sensör takın.
10. Sıçanın burnunu ve ağzını bir yüz maskesi ile örtün. Uzun süreli anestezi gerekiyorsa, izofluranı başlatın (% 1.0-2.0,_O2'de etkili olmak için% 1.0-2.0 titre edilmiştir).
11. Cerrahi alanı povidon-iyot veya alternatif dezenfektanlarla dezenfekte edin ve cerrahi alanı steril bir şekilde örtün.
12. Perianestezik bakım için, gözlere steril bir oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın ve cerrahi lambanın kurumasını ve zarar görmesini önlemek için opak bir folyo maskesi ile örtün.
13. Ameliyat boyunca, yüz maskesi aracılığıyla sürekli oksijen sağlayın, vücut ısısını izleyin ve normotermiyi koruyarak bir ısıtma yastığı kullanarak ısı sağlayın.
14. Diğer hayati belirtileri sürekli izleyin (nabız ve nefes darlığı, kalp ve nefes hızı ve oksijen doygunluğu).

2. Operatif faz - hücre izleyici enjeksiyonu

NOT: Helsinki sıçan mikrocerrahi yanak anevrizması model^9'daki ayrıntılı cerrahi yaklaşım ve bobin ve stent implantasyonu teknikleri başka bir yerde açıklanmıştır 8,10,11.

1. Floresan lipofilik hücre izleyiciyi her zaman ≤ -20 ° C'de ışıktan korunarak saklayın.
2. Sıçan aortunu ve kaval venini hazırlayarak, ardından her ikisinin ayrılmasının yanı sıra aortun proksimal ve distal geçici kelepçelenmesiyle ameliyatı gerçekleştirin.
   NOT: Bu teknik daha önce⁹ olarak tanımlanmıştır.
   1. Aortun proksimal ve distal kısımlarını iki geçici titan klipsle kelepçeleyin.
3. Arterin daha iyi görselleştirilmesi için aortun proksimal ve distal kısımlarının altına her biri mor dolgulu bir mikrosürüntü koyun.
4. Şimdi, karnı ıslak gazlı bezle koruyun.
5. Operasyon gününde, hücre izleyicinin 2 μL'sini, 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde pipetleme yaparak çözün.
6. Karışımı 27-1/2 G (0,4 x 13 mm) steril kanül ile donatılmış 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın.
   NOT: Adım 2.5 ve 2.6'yı uygularken ışığa maruz kalmaktan kaçınmaya dikkat edin.
7. Ameliyathanedeki ışığı kapatın. Mikroskop altında bakarken, mikro forseps kullanarak aortun orta ventral kısmına tek noktalı enjeksiyonu gerçekleştirin ve 1 mL heparinize % 0.9 salin çözeltisini dikkatlice enjekte edin.
8. Hücre izleyiciyi dikkatlice enjekte edin (Video 1) ve hemen çalışma mikroskobunu da kapatın. Yine, karnı ıslak gazlı bezle koruyun.
9. Boyanın en az 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçka döneminden sonra mikroskop ve ameliyathane ışıklarını açın.
10. Başka bir yerde tarif edildiği gibi uzunlamasına arteriyotomi ve anevrizmanın dikişini gerçekleştirin¹¹.
    1. Arteriyotomi yapmak için mikroforseps ve mikromakas kullanın, böylece uzunluğu hasat edilen anevrizmanın çapının ortalamasını alır (adım 1.3). Doğru uzunluğu sağlamak için, arteriyotomi yapmadan önce anevrizmayı aortun yanına yerleştirin. Anevrizmayı emilemeyen 10-0 dikiş kullanarak 8-10 tek dikişle dikişin ve heparinize salin ile sürekli sulama altında distal olarak başlayan geçici kelepçeleri dikkatlice çıkarın. Yarayı katmanlı bir şekilde kapatın. Not olarak, 1 cm'lik bir bobin ambalaj yoğunluğu kullanın.
       NOT: Bobin veya stent implantasyonu tekniği başka bir yerde^{tanımlanmıştır 8,10}.

3. Postoperatif faz izleme ve analjik bakım

1. Ameliyatın sonunda, buprenorfin 0.05 mg / kg, atipamezol 0.75 mg / kg ve flumazenil 0.2 mg / kg'lık bir SC enjeksiyon karışımı ile anesteziyi tersine çevirin. Çalıştırılan her hayvanın, bir ısıtma lambası ile tamamen uyanık ve gerektiğinde ısınana kadar temiz bir kafeste iyileşmesine izin verin.
2. 3 gün boyunca, 1 mg / kg meloksikam (günde bir enjeksiyon veya oral uygulama) ve buprenorfin (günde dört kez 0.05 mg / kg) SC. Gece boyunca, içme suyunda sürekli olarak aynı dozda buprenorfin sağlayın: 6 mL buprenorfin 0.3 mg / mL, 360 mL içme suyu, 10 mL% 5 glikoz.
3. Ameliyat sonrası hemen sonrasında, her hayvanı korunmak için tek bir kafeste barındırın. Hayvanları 24 saat sonra yeniden gruplandırın.
4. SC enjeksiyonundan sonra herhangi bir sıçan sıkıntılı veya agresif davranış gösterirse, gün boyunca içme suyunda buprenorfin uygulayın.
5. Ameliyat sonrası beslenmeyi ve iyileşmeyi desteklemek için kafes tabanında yumuşak besleme sağlayın.
6. Tüm hayvanları refah ve ağrı puan tablosuna göre gözlemleyin ve bakımını yapın.
7. Gerektiğinde kurtarma analjezi SC'yi (meloksikam 1 mg / kg ve 0.05 mg / kg buprenorfin) uygulayın.

Sonuçlar

Laboratuvar ortamına toplam 31 hayvan dahil edildi: Son istatistiksel analize 27 sıçan dahil edildi; 4 sıçan erken öldü (%12.9 mortalite oranı). İntraoperatif olarak, solunum distansiyonu stent- (12.9 μm ± 0.7) stent- (12.9 μm ± 0.7) ile tedavi edilen sıçanlarda anlamlı olarak azaldı (p = 0.03). Son FU'nun sonunda her sıçan için floresan anjiyografi yapıldı. Reperfüzyon, bobinle tedavi edilen 6 hayvanın hepsinde endikeyken, stentle tedavi edilen 8 hayvanın sadece% 12.5'inde reperfüzyon ...

Tartışmalar

Bu çalışma, neointima oluşumuna anevrizma kompleksinin ana arterinden köken alan endotel hücreleri aracılığıyla aracılık edildiğini, ancak vital anevrizmalarda anevrizma duvarından türetilen hücrelerin işe alınması ile desteklendiğini göstermektedir. Bununla birlikte, dolaşımdaki progenitör hücrelerin anevrizma iyileşmesindeki rolü tartışmalı olmaya devam etmektedir^12,13. Genel olarak, 31 erkek Lewis sıçanı bu araştırmaya dahil ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary