Modelos porcinos de enfermedades aneurismáticas para formación e investigación

Resumen

Descripción de dos modelos diferentes de cerdos aneurismáticos para cursos de formación en neurorradiología y estudios de investigación. Este estudio proporciona evidencias de la viabilidad de estas creaciones de modelos porcinos de aneurismas y de los métodos reproducibles que se acercan al entorno clínico.

Resumen

Los modelos de animales grandes, específicamente los cerdos, se utilizan ampliamente para investigar enfermedades cardiovasculares y terapias, así como con fines de entrenamiento. Este artículo describe dos modelos diferentes de cerdos aneurismáticos que pueden ayudar a los investigadores a estudiar nuevas terapias para las enfermedades aneurismáticas. Estos modelos de aneurismas se crean mediante la adición quirúrgica de una bolsa de tejido a las arterias carótidas de los cerdos. Cuando el modelo se utilice para la investigación, la bolsa debe ser autóloga; Para fines de entrenamiento, una bolsa sintética es suficiente.

En primer lugar, se deben exponer quirúrgicamente la vena yugular externa derecha (EJV) y la arteria carótida común derecha (CCA). El EJV está ligado y se forma una bolsa venosa a partir de un segmento corto. A continuación, esta bolsa se sutura a una arteriotomía elíptica realizada en el CCA. Los animales deben mantenerse heparinizados durante la creación del modelo, y se pueden utilizar vasodilatadores locales para disminuir los vasoespasmos. Una vez completada la sutura, se debe inspeccionar el flujo sanguíneo correcto, verificando si hay sangrado de la línea de sutura y la permeabilidad de los vasos. Finalmente, la incisión quirúrgica se cierra por capas y se realiza una angiografía para obtener imágenes del modelo de aneurisma.

Una simplificación de este modelo de carótida aneurismática que disminuye la invasividad y el tiempo quirúrgico es el uso de una bolsa sintética, en lugar de venosa. Para ello, se adapta de antemano una bolsa con un segmento de prótesis de politetrafluoroetileno (PTFE), uno de cuyos extremos se sutura con una sutura vascular de polipropileno y se esteriliza antes de la cirugía. Este "saco" se conecta a una arteriotomía realizada en el CCA como se describe.

Aunque estos modelos no reproducen muchos de los eventos fisiopatológicos relacionados con la formación de aneurismas, son hemodinámicamente similares a la situación encontrada en el ámbito clínico. Por lo tanto, se pueden utilizar con fines de investigación o formación, lo que permite a los médicos aprender y practicar diferentes técnicas endovasculares en modelos animales cercanos al sistema humano.

Introducción

El aneurisma intracraneal (AI) es una enfermedad cerebrovascular grave asociada con una tasa de mortalidad de hasta el 50% cuando se rompe. Es una condición relativamente común y potencialmente letal, con una prevalencia reportada entre 3,6% y 6% en estudios angiográficos¹. Los vasos intracraneales están anormalmente dilatados y sufren distensión debido a factores de riesgo multifactoriales, que incluyen, entre otros, tabaquismo, hipertensión, ingesta excesiva de alcohol o aumento de la edad. Cuando no se trata, la IA puede romperse espontáneamente, dando lugar a una hemorragia subaracnoidea (HSA) que es responsable de una morbilidad significativa y de la muerte ^2,3,4. Además, un tercio de los pacientes requieren hospitalización o cuidados de enfermería, y solo el 30% de los pacientes con HSA pueden volver a la vida independiente, lo que representa una grave carga de enfermedad en humanos que justifica la necesidad de experimentos con animales⁵.

En la actualidad, los pacientes con alto riesgo de rotura y hemorragia AI son tratados con oclusión principalmente mediante espiralización endovascular, clipaje microquirúrgico o stents desviadores de flujo ^6,7. El procedimiento endovascular ha sido evaluado por el International Subarachnoid Aneurysm Trial (ISAT), demostrando que el enrollamiento es más seguro, menos invasivo y, por lo tanto, tiene efectos adversos menos significativos que la terapia microquirúrgica³. Por estas razones, los procedimientos endovasculares son las técnicas más utilizadas para el tratamiento de la AI³. Se requiere una formación especializada para que los médicos realicen correctamente estos procedimientos mínimamente invasivos⁸.

Además, el desarrollo de nuevos dispositivos o terapias para el tratamiento de la AI debe estar bien establecido y probado en estudios preclínicos antes de su traslación al entorno clínico ^6,9. Existen diferentes modelos animales experimentales de IA según el objetivo principal de la investigación o fines de formación. Estos modelos se han realizado en numerosas especies, con sus limitaciones y ventajas. Sin embargo, todas ellas conllevan inducción artificial o creación quirúrgica debido a la ausencia de IA natural en los animales 2,6,9,10,11,12.

A pesar de que ningún modelo animal reproduce perfectamente la fisiopatología humana, los animales pequeños, como los roedores, son los más utilizados en los estudios de investigación de la AI⁶. Las especies grandes suelen emplearse para el desarrollo de nuevos dispositivos endovasculares o para la formación en intervenciones terapéuticas². Entre los modelos animales grandes, es común el uso de cerdos para investigar trastornos y terapias de IA, así como para cursos de capacitación. Esto se debe a su capacidad para tolerar el procedimiento quirúrgico y a su diámetro vascular y flujo sanguíneo similares en comparación con los vasos cerebrales humanos ^2,13.

El método de elección para la creación de modelos animales de IA varía en función del objetivo principal de cada proyecto de investigación individual, por ejemplo, si se evaluarán los criterios de valoración angiográficos o histológicos. En este sentido, los modelos creados por ligadura quirúrgica o mediante la adición de una bolsa autóloga de tejido al ACC se utilizan para la investigación del crecimiento de la AI. Los modelos quirúrgicos deben combinarse con la inducción de hipertensión si el objetivo principal del estudio es la ruptura de la AI. Cuando el modelo se utiliza con fines de entrenamiento, la técnica puede simplificarse mediante el uso de una bolsa sintética suturada en el ACC sin necesidad de hipertensión⁶.

En este artículo se describen dos modelos diferentes de cerdos aneurismáticos que pueden ayudar a los investigadores a estudiar nuevas terapias o entrenamiento en intervenciones endovasculares para las enfermedades de AI. Estos modelos de aneurismas se crean mediante la adición quirúrgica de una bolsa de tejido al ACC en cerdos. Cuando el modelo se utiliza para la investigación, la bolsa es autóloga, lo que proporciona la capacidad de estudiar la curación del aneurisma después de la exclusión sin la interferencia de ningún material exógeno. Para fines de entrenamiento, una bolsa sintética que recapitula la anatomía endovascular para reproducir el procedimiento es suficiente.

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Protocolo

El experimento fue aprobado por el comité ético del Centro de Cirugía Mínimamente Invasiva Jesús Usón, y todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Real Decreto 53/2013 y la normativa europea (2010/63/CE).

1. Preparación prequirúrgica y anestesia

1. Aloje cerdos blancos grandes que pesen entre 35 y 40 kg individualmente, con libre acceso a agua y alimento una vez al día. Aclimatarse durante 2 semanas antes de la fecha de la intervención, para realizar el examen clínico y dar tiempo a detectar enfermedades silenciosas.
2. Administrar los siguientes fármacos orales para prevenir eventos trombóticos durante el estudio: Ácido acetilsalicílico (1 g/animal/24 h) y Clopidogrel (75 mg/animal/24 h) desde 7 días antes de la inducción del modelo hasta el tratamiento con IA.
3. Inyectar ketamina (10 mg/kg) por vía intramuscular después de un período de ayuno de 24 horas. Diez minutos después, inducir la anestesia con propofol al 1% por vía intravenosa (3 mg/kg).
4. Después de la intubación endotraqueal, use sevoflurano inhalado para mantener la anestesia (fracción inspiratoria al 3%-4.5%). Conecte los tubos endotraqueales a un circuito anestésico circular semicerrado conectado a un ventilador con un caudal de gas fresco de 0,5-1 L/min.
5. Para obtener normocapnia (35-45 mmHg CO₂), controlar la ventilación con un volumen corriente de 8-10 mL/kg. Asegurar una adecuada analgesia intraoperatoria mediante una dosis inicial intravenosa de combinación de ketorolaco (1 mg/kg) y tramadol (1 mg/kg) y una infusión continua de remifentanilo (15-18 μg/kg/h).
6. Confirmar el plano adecuado de la anestesia animal considerando la inconsciencia (hipnosis), la insensibilidad al dolor, la relajación muscular y la ausencia de respuestas reflejas¹⁴.
7. Para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia, use un ungüento veterinario en los ojos durante el procedimiento quirúrgico.
8. Fijar a los animales anestesiados en la mesa de operaciones en posición supina. Afeitar el cuello de los animales, frotar con povidona yodada y cubrirlos en condiciones estériles.
9. Realizar todos los procedimientos en condiciones estériles, utilizando guantes y material estériles.

2. Cirugía

1. Abordaje quirúrgico
   1. Realice una incisión cutánea longitudinal de 10 cm de largo a 2-3 cm a la derecha de la línea media del cuello.
2. Sastrería de bolsos
   1. Bolsa autóloga
      1. Para exponer el EJV, diseccionar el tejido subcutáneo y graso y realizar hemostasia.
      2. Separe el músculo esternocéfalo derecho del tejido conectivo y retírelo con un retractor Weitlaner para facilitar la exposición al EJV.
      3. Exponga e identifique el EJV, que es lateral y más profundo que el CCA (Figura 1A).
      4. Utilice dos pinzas vasculares bulldog para detener el flujo sanguíneo dentro del vaso durante la extracción del segmento venoso.
      5. Aísle un segmento de 15-20 mm del EJV para obtener la bolsa autóloga.
      6. Ligara los extremos proximal y distal de la EJV.
      7. Enjuague el segmento de la vena extraído con solución salina heparinizada (5,000 UI/L).
      8. Revise el interior del EJV extirpado y seleccione un segmento de 7-8 mm de largo donde no haya válvulas venosas.
      9. Convierta este segmento en una bolsa cerrando un extremo con una sutura corrida de polipropileno 7/0 (Figura 1B).
      10. Mantenga la bolsa sumergida en solución salina heparinizada hasta su uso.
      11. Confirme que no hay sangrado de la EJV ligada.
   2. Bolsa sintética
      1. Cortar un segmento de 1 cm de largo de una prótesis de PTFE (6-8 mm de diámetro, dependiendo del tamaño del aneurisma que se vaya a crear).
      2. Sutura un extremo cerrado con una sutura vascular de polipropileno 6/0. Selle esta parte cerrada de la prótesis con pegamento vascular para evitar el sangrado de la línea de sutura.
      3. Esterilice este injerto sintético antes de la creación del aneurisma quirúrgico.
3. Cirugía de creación de aneurismas
   1. Para exponer el CCA, diseccionar el tejido subcutáneo y graso y realizar hemostasia.
   2. Separe el músculo esternocéfalo derecho del tejido conectivo circundante y retírelo con un retractor Weitlaner para facilitar la exposición al CCA.
   3. Identifique el CCA. Coloque 2 asas de vasos de silicona en el extremo craneal y distal del CCA expuesto (Figura 2A). Diseccionar 5 cm de este vaso, retirando su adventicia con un disector (Figura 2B). Durante este acceso quirúrgico, tenga cuidado de evitar lesionar el nervio vago que puede provocar el síndrome de Horner.
   4. Administrar vasodilatadores localmente (por ejemplo, 1-2 mL de nimodipino 10 mg/50 mL) para prevenir vasoespasmos.
   5. Administrar heparina por vía intravenosa (150 UI/kg) 5 min antes de la pinzamiento cruzado de la CCA.
   6. Coloque una pinza vascular de bulldog en la parte caudal disecada del CCA y otra pinza vascular de bulldog a 4-5 cm de distancia en la parte craneal del vaso (Figura 2C).
   7. Utilice unas tijeras para realizar una arteriotomía elíptica de 8 mm en el CCA entre las dos pinzas vasculares del bulldog (Figura 2D).
   8. Utilice solución salina heparinizada (5.000 UI/L) para enjuagar el segmento del CCA por vía intraluminal.
   9. Suturar la bolsa autóloga o sintética a la arteriotomía elíptica utilizando una sutura corrida de polipropileno 6/0 (Figura 3A,B). Enjuague las pinzas distal y proximal antes de terminar la sutura de la bolsa.
   10. Proteja el vaso y las estructuras cercanas con solución salina tibia y heparinizada durante el procedimiento microquirúrgico.
   11. Una vez suturada la prótesis o bolsa autóloga al CCA, comprobar que no hay sangrado (Figura 3C,D). Primero, retire la pinza vascular del bulldog craneal y luego la caudal.
   12. Realice la hemostasia aplicando presión con hisopos húmedos si hay algo de sangrado de la línea de sutura. Si es necesario, aplique tracción a los bucles de los vasos o reemplace las pinzas vasculares bulldog y realice puntos hemostáticos en el sitio de sangrado. Si es necesario, coloque un trozo de esponja de gelatina hemostática alrededor de la prótesis.
   13. Inspeccione el pulso craneal del CCA al saco aneurismático para asegurarse de que se ha recuperado la permeabilidad carotídea correcta.
   14. Cerrar la incisión quirúrgica por capas utilizando suturas reabsorbibles 2/0 y la piel con puntos simples con 0 suturas no absorbibles.
   15. Administrar buprenorfina (10 μg/kg/12 h) por vía intramuscular durante las primeras 24 h y colocar un parche de liberación transdérmica de fentanilo (25 μg/h) después de los procedimientos quirúrgicos para conseguir la analgesia postoperatoria.
   16. Disminuya el sevoflurano inhalado y aumente el caudal de gas fresco (20 L/min) para obtener condiciones de recuperación. Retirar el tubo endotraqueal cuando los animales respiren espontáneamente y se hayan recuperado parámetros fisiológicos, como la saturación de oxígeno y la frecuencia cardíaca.
       NOTA: El gas fresco es una mezcla de O₂ puro (100%) y aire medicinal (21% de_O2). Finalmente, la fracción de oxígeno inspirado es del 50% al 45% (_FiO2 = 0,5-0,45).
   17. No deje a los animales desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
   18. Mantenga a los animales que han sido sometidos a cirugía aislados de otros animales hasta que se recuperen por completo.

3. Prueba angiográfica y fase postoperatoria

1. Esperar 24-48 h para evitar dañar la línea de sutura.
2. Anestesiar al animal de nuevo como se ha descrito anteriormente y afeitar la zona de la ingle. Prepare la zona con povidona yodada y aplique un paño estéril.
3. Acceder a una arteria femoral utilizando la técnica de Seldinger modificada con una vaina introductora de 6Fr.
4. Inserte un catéter de cazacabezas de 5Fr a través de la vaina femoral sobre una guía hidrofílica de 0,035 pulgadas. Bajo guía fluoroscópica, avance este catéter hasta el origen del CCA y retire la guía.
5. Inyecte medio de contraste (ácido amidotrizoico diluido al 50% con una solución salina) a través del catéter de cazacabezas para obtener imágenes del modelo de CCA con aneurisma.
6. Una vez que la angiografía confirme la correcta creación del modelo de aneurisma, utilice modelos animales para la investigación o para entrenar los procedimientos de tratamiento endovascular.
7. Sacrificar a los animales cuando los estudios o cursos de formación finalicen con una administración intravenosa letal de cloruro de potasio (2 mmol/kg) bajo anestesia profunda.

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Resultados

La técnica presentada se ha utilizado para diferentes propósitos, a saber, la investigación sobre la curación de aneurismas postenrollamiento y el entrenamiento en técnicas de embolización. Las bolsas venosas se han utilizado para probar la cicatrización diferencial utilizando espirales de platino y bioactivos. Las bolsas se suturaron como se ha descrito anteriormente y, 24 h después de la creación del modelo, se obtuvo una angiografía para documentar las dimensiones y el aspec...

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Discusión

Existen diferentes técnicas para crear modelos animales de aneurismas en función del objetivo del estudio. Algunos protocolos de modelos de aneurismas incluyen procedimientos quirúrgicos combinados con hipertensión o inducción de estrés hemodinámico mediante la administración de angiotensina II, nefrectomías o dieta alta en sal, entre otros, porque el objetivo principal de estos estudios es la investigación de la ruptura de aneurismas. Sin embargo, en el presente estudio, estas...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylsalicylic acid	Sanofi	700693	500 mg tablets
Amidotrizoic acid	Bayer Hispania	914614.6	Contrast medium 76%
Anesthesia Machine	Maquet Clinical Care AB	6677200	Maquet Flow-i C20
Bulldog vascular clamp	Dimeda	12.092.07	7.5 cm
Buprenorphine	Richter Pharma Ag	578816	0.3 mg/mL
Clopidogrel	Sandoz	704005	75 mg tablets
Contrast medium	Bayer Hispania	914614	Urografin 36%
Dissector	Dimeda	12.421.01	21 cm
Fentanyl Matrix	Kern Pharma	664823	Transdermic release patch 25 µg/h
Fluoroscopy equipment	Philips Medical Systems		Veradius Unity
Hemostatic gelatin sponge	Takeda Farmaceutica España, SA	324459	Absorbable hemostatic agent. Espongostan
Head hunter catheter	Boston Scientific	RF*YB15110M	5 Fr 100 cm
Heparin	Rovi	641639	Heparin 5%
Hydrophilic guidewire	Terumo	RF*GA35153M	0.035” 150 cm
Introducer sheath	Terumo	RS*B60N10MQ	6 Fr 10 cm
Ketamine	Richter Pharma Ag	580395	100 mg/mL
Ketorolac	Laboratorios Normon, S.A.	603079	30 mg/mL
Micro-forceps	S&T	JFA-5b (1:1)	Forceps for microsugery
Micro-needle holder	S&T	Curved C-14 (Art nº 00088)	Needle holder for microsurgery
Microscissors	S&T	Adventitia SAS-15 R-8 (Art nº 00102)	Straight- scissors for microsurgery
Needle holder	Dimeda	24.114.12	12 cm
Nimodipine	Bayer Hispania, S.L	641969	10 mg/50 mL
Povidone-iodine	CV Medica	193203	Povidone iodine solution (10%)
Propofol	Orion Corporation	588475	10 mg/mL
PTFE prosthesis	Maquet	M00201501086B0	Synthetic prosthesis 6mm
Remifentanil	Laboratorios Normon, S.A.	692295	2 mg
Scalpel handle	Dimeda	06.104.00	13.5 cm
Scissors (Mayo)	Dimeda	07.164.14	14.5 cm
Scissors  (Metzenbaum)	Dimeda	07.287.15	15 cm
Surgical blades	Dimeda	06.122.00	22
Sutures: absorbable suture	Medtronic	GL-123	2/0
Sutures: poplypropylene suture	Aragó	37803	6/0 and 7/0
Swabs	Texpol	1063.01	20 x 20 cm
Tissue forceps	Dimeda	10.102.11 /10.120.11	11.5 cm
Vascular glue	Histoacryl Braun	1050060	Tissue adhesive
Vessel loops	Braun	B1095218	1.5 mm diammeter
Weitlaner	Dimeda	18.670.14	14 cm