Модели аневризматических заболеваний свиней для обучения и научных исследований

Резюме

Описание двух различных моделей аневризматических свиней для учебных курсов и научных исследований в области нейрорадиологии. Это исследование предоставляет доказательства возможности создания этих моделей аневризмы свиней и воспроизводимых методов, приближенных к клиническим условиям.

Аннотация

Крупные животные модели, особенно свиньи, широко используются для исследования сердечно-сосудистых заболеваний и терапии, а также в тренировочных целях. В этой статье описываются две различные модели аневризматических свиней, которые могут помочь исследователям в изучении новых методов лечения аневризматических заболеваний. Эти модели аневризмы создаются путем хирургического добавления мешка ткани к сонным артериям у свиней. Когда модель используется для исследования, мешочек должен быть аутологичным; Для тренировочных целей достаточно синтетического подсумка.

Во-первых, необходимо хирургически обнажить правую наружную яремную вену (EJV) и правую общую сонную артерию (CCA). EJV перевязан и имеет венозный мешочек, сделанный из короткого сегмента. Затем этот мешочек пришивается к эллиптической артериотомии, выполняемой в CCA. Животные должны содержаться в гепаринизации во время создания модели, а для уменьшения вазоспазмов могут использоваться локальные вазодилататоры. После того, как наложение шва завершено, следует проверить правильный кровоток, проверяя наличие кровотечения из линии шва и проходимость сосудов. Наконец, хирургический разрез закрывается слоями и проводится ангиография для визуализации модели аневризмы.

Упрощением этой аневризматической модели сонной артерии, уменьшающей инвазивность и время операции, является использование синтетического, а не венозного мешка. Для этого заранее подгоняется мешочек с помощью сегмента протеза из политетрафторэтилена (ПТФЭ), один конец которого плотно зашивается полипропиленовым сосудистым швом и стерилизуется перед операцией. Затем этот «мешочек» прикрепляется к артериотомии, выполненной в CCA, как описано.

Хотя эти модели не воспроизводят многие физиопатологические события, связанные с формированием аневризмы, они гемодинамически схожи с ситуацией, обнаруженной в клинических условиях. Таким образом, они могут быть использованы в исследовательских или учебных целях, позволяя врачам изучать и практиковать различные эндоваскулярные методы на животных моделях, которые близки к человеческой системе.

Введение

Внутричерепная аневризма (ИА) – это тяжелое цереброваскулярное заболевание, связанное со смертностью до 50% при разрыве. Это относительно распространенное и потенциально смертельное состояние, распространенность которого в ангиографических^{исследованиях} составляет от 3,6% до 6% 1. Внутричерепные сосуды аномально расширены и распираются из-за многофакторных факторов риска, включая, помимо прочего, курение, гипертонию, чрезмерное употребление алкоголя или возраст. При отсутствии лечения ИА может спонтанно разорваться, что приводит к субарахноидальному кровоизлиянию (САК), которое является причиной значительной заболеваемости и смерти ^2,3,4. Кроме того, треть пациентов нуждаются в госпитализации или сестринском уходе, и только 30% пациентов с САК могут вернуться к самостоятельной жизни, что представляет собой серьезное бремя болезни для людей, что фактически оправдывает^{необходимость экспериментов} на животных.

В настоящее время пациенты с высоким риском разрыва IA и кровоизлияния лечатся с помощью окклюзии в основном с помощью эндоваскулярного намоткивания, микрохирургического клипирования или стентов, отклоняющих поток ^6,7. Эндоваскулярная процедура была оценена в Международном исследовании субарахноидальной аневризмы (ISAT), продемонстрировав, что койлинг безопаснее, менее инвазивн и, следовательно, имеет менее значительные побочные эффекты, чем микрохирургическая^{терапия}. По этим причинам эндоваскулярные процедуры являются наиболее распространенными методами, используемыми для лечения ИА³. Для правильного выполнения этих минимально инвазивных процедур врачам требуется специальная подготовка⁸.

Кроме того, разработка новых устройств или методов лечения ИА должна быть хорошо отлажена и проверена в доклинических исследованиях, прежде чем они будут применены в клинических условиях ^6,9. Существуют различные модели экспериментальных животных IA в зависимости от основной цели исследования или обучения. Эти модели были выполнены на многочисленных видах, со своими ограничениями и преимуществами. Однако все они влекут за собой искусственную индукцию или хирургическое создание из-за отсутствия естественного ИА у животных 2,6,9,10,11,12.

Хотя ни одна животная модель не воспроизводит в полной мере человеческую патофизиологию, мелкие животные, такие как грызуны, чаще всего используются в исследованиях^IA. Крупные виды обычно используются для разработки новых эндоваскулярных устройств или обучения терапевтическим вмешательствам². Среди крупных животных моделей свиней принято использовать для исследования расстройств ИА и терапии, а также для учебных курсов. Это связано с их способностью переносить хирургическую процедуру и их одинаковым диаметром сосудов и кровотоком по сравнению с сосудами головного мозга человека ^2,13.

Выбор метода для создания модели животных IA варьируется в зависимости от основной цели каждого отдельного исследовательского проекта, например, будут ли оцениваться ангиографические или гистологические конечные точки. В этом смысле модели, созданные путем хирургического лигирования или добавления аутологичного мешка ткани к CCA, используются для исследования роста IA. Хирургические модели должны сочетаться с индукцией артериальной гипертензии, если первичной конечной точкой исследования является разрыв IA. Когда модель используется в учебных целях, методика может быть упрощена за счет использования синтетического мешка, пришитого к ОСА без необходимости развития гипертензии⁶.

В данной статье описываются две различные модели аневризмы свиней, которые могут помочь исследователям в изучении новых методов лечения или обучении эндоваскулярным вмешательствам при заболеваниях ИА. Эти аневризматические модели создаются путем хирургического добавления мешка ткани к CCA у свиней. Когда модель используется для исследования, мешочек является аутологичным, что обеспечивает возможность изучения заживления аневризмы после исключения без вмешательства какого-либо экзогенного материала. Для тренировочных целей достаточно синтетического мешочка, который повторяет эндоваскулярную анатомию для воспроизведения процедуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперимент был одобрен этическим комитетом Центра минимально инвазивной хирургии им. Хесуса Усона, а все процедуры проводились в соответствии с Королевским указом Испании 53/2013 и Европейским регламентом (2010/63/EC).

1. Предоперационная подготовка и анестезия

1. Содержать крупных белых свиней весом 35-40 кг индивидуально, со свободным доступом к воде и корму один раз в день. Акклиматизируйтесь за 2 недели до даты вмешательства, чтобы провести клиническое обследование и дать время для выявления скрытых заболеваний.
2. Для предотвращения тромботических осложнений во время исследования применяйте следующие пероральные препараты: ацетилсалициловую кислоту (1 г/чел./24 ч) и клопидогрел (75 мг/чел./24 ч) за 7 дней до модельной индукции до терапии IA.
3. Введите кетамин (10 мг/кг) внутримышечно после 24-часового периода натощак. Через десять минут внутривенно ввести анестезию 1% пропофолом (3 мг/кг).
4. После эндотрахеальной интубации используйте ингаляционный севофлуран для поддержания анестезии (3%-4,5% инспираторной фракции). Подсоедините эндотрахеальные трубки к полузакрытому кольцевому контуру для анестезии, подключенному к аппарату искусственной вентиляции легких с расходом свежего газа 0,5-1 л/мин.
5. Для получения нормокапнии (35-45 мм рт.ст._СО2) контролируют вентиляцию дыхательным объемом 8-10 мл/кг. Обеспечить адекватную интраоперационную анальгезию путем начального внутривенного введения комбинации кеторолака (1 мг/кг) и трамадола (1 мг/кг) и непрерывной инфузии ремифентанила (15-18 мкг/кг/ч).
6. Подтвердите надлежащую животную плоскость анестезии с учетом бессознательного состояния (гипноза), нечувствительности к боли, расслабления мышц и отсутствия рефлекторных реакций¹⁴.
7. Чтобы предотвратить сухость во время анестезии, используйте ветеринарную мазь для глаз во время процедуры операции.
8. Зафиксируйте обезболенных животных на операционном столе в положении лежа на спине. Животным выбрить шею, потереть повидон-йодом и драпировать в стерильных условиях.
9. Выполняйте все процедуры в стерильных условиях, используя стерильные перчатки и материал.

2. Хирургия

1. Хирургический подход
   1. Выполните продольный разрез кожи длиной 10 см в 2-3 см справа от средней линии шеи.
2. Пошив мешочков
   1. Аутологичный мешочек
      1. Чтобы обнажить ЭПЗ, рассекают подкожную и жировую клетчатку и проводят гемостаз.
      2. Отделите правую грудинную мышцу от соединительной ткани и втяните ее с помощью ретрактора Вейтланера, чтобы облегчить воздействие EJV.
      3. Обнажите и определите EJV, которая является латеральной и более глубокой, чем CCA (рисунок 1A).
      4. Используйте два сосудистых зажима бульдога, чтобы остановить кровоток внутри сосуда во время экстракции венозного сегмента.
      5. Изолируйте сегмент EJV диаметром 15-20 мм, чтобы получить аутологичный мешочек.
      6. Перевязка проксимального и дистального концов EJV.
      7. Промойте удаленный сегмент вены гепаринизированным физиологическим раствором (5 000 МЕ/л).
      8. Проверьте внутреннюю часть иссеченной ЭС и выберите сегмент длиной 7-8 мм, на котором отсутствуют венозные клапаны.
      9. Сформируйте из этого сегмента мешочек, закрыв один конец полипропиленовым беговым швом 7/0 (Рисунок 1B).
      10. Держите мешочек погруженным в гепаринизированный физиологический раствор до использования.
      11. Подтвердите отсутствие кровотечения из перевязанной ЭЖВ.
   2. Синтетический чехол
      1. Отрежьте отрезок длиной 1 см от протеза из ПТФЭ (6-8 мм в диаметре, в зависимости от размера аневризмы, которая будет создана).
      2. Шов с одного конца закрыть с помощью полипропиленового сосудистого шва 6/0. Заклейте эту закрытую часть протеза сосудистым клеем, чтобы избежать кровотечения из линии шва.
      3. Стерилизуйте этот синтетический трансплантат перед хирургическим созданием аневризмы.
3. Хирургия создания аневризмы
   1. Чтобы обнажить ОСА, рассекают подкожную и жировую клетчатку и проводят гемостаз.
   2. Отделите правую стерноцефальную мышцу от окружающей соединительной ткани и втяните ее с помощью ретрактора Вейтланера, чтобы облегчить воздействие CCA.
   3. Определите CCA. Поместите 2 петли силиконового сосуда на краниальный и дистальный конец обнаженного ОСА (рисунок 2A). Рассеките 5 см этого сосуда, удалив его адвентицию с помощью диссектора (рисунок 2В). Во время этого хирургического доступа следите за тем, чтобы не повредить блуждающий нерв, который может привести к синдрому Горнера.
   4. Местно вводите вазодилататоры (например, 1-2 мл нимодипина 10 мг/50 мл) для предотвращения вазоспазмов.
   5. Введите гепарин внутривенно (150 МЕ/кг) за 5 минут до перекрестного зажима CCA.
   6. Поместите один сосудистый зажим бульдога на каудальную рассеченную часть ОСА, а другой сосудистый зажим бульдога на расстоянии 4-5 см друг от друга в краниальной части сосуда (рис. 2В).
   7. С помощью микроножниц выполните эллиптическую артериотомию диаметром 8 мм в ОСА между двумя бульдожьими сосудистыми зажимами (Рисунок 2D).
   8. Используйте гепаринизированный солевой раствор (5000 МЕ/л) для промывки сегмента ОСА внутрипросветно.
   9. Пришить аутологичный или синтетический мешочек к эллиптической артериотомии с помощью полипропиленового бегущего шва 6/0 (рис. 3A, B). Промойте дистальный и проксимальный зажимы перед окончанием наложения швов на мешочек.
   10. Защитите сосуд и близлежащие структуры теплым гепаринизированным физиологическим раствором во время микрохирургической процедуры.
   11. После того, как протез или аутологичный мешочек будут пришиты к CCA, убедитесь, что нет кровотечения (рисунок 3C, D). Сначала снимают сосудистый зажим краниального бульдога, а затем хвостовой.
   12. Выполняйте гемостаз с помощью надавливания влажными тампонами, если есть кровотечение из линии шва. При необходимости наложите тракцию на сосудистые петли или замените сосудистые зажимы бульдога и наложите кровоостанавливающие швы в месте кровотечения. При необходимости наложите на протез кусочек гемостатической желатиновой губки.
   13. Осмотрите пульс CCA краниально к аневризматическому мешку, чтобы убедиться, что правильная проходимость сонной артерии восстановлена.
   14. Хирургический разрез закрыть слоями с помощью рассасывающихся нитей 2/0 и кожу одиночными швами с 0 нерассасывающимися швами.
   15. Ввести бупренорфин (10 мкг/кг/12 ч) внутримышечно в течение первых 24 ч и поместить фентаниловый трансдермальный пластырь (25 мкг/ч) после хирургических процедур для достижения послеоперационной анальгезии.
   16. Уменьшите ингаляцию севофлурана и увеличьте расход свежего газа (20 л/мин) для получения восстановительных условий. Удаляйте эндотрахеальную трубку, когда животные начинают самопроизвольно дышать и восстанавливаются физиологические параметры, такие как сатурация кислорода и частота сердечных сокращений.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Свежий газ представляет собой смесь чистого_О2 (100%) и медицинского воздуха (21%_О2). Наконец, доля вдыхаемого кислорода составляет от 50% до 45% (FiO₂ = 0,5-0,45).
   17. Не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего состояния грудины.
   18. Держите животных, перенесших операцию, изолированными от других животных до полного выздоровления.

3. Ангиографическое исследование и послеоперационный этап

1. Подождите 24-48 часов, чтобы не повредить линию шва.
2. Снова обезболите животное, как описано выше, и побрейте паховую область. Подготовьте зону с помощью повидон-йода и наложите стерильную драпировку.
3. Доступ к бедренной артерии осуществляется по модифицированной методике Сельдингера с интродьюсерной оболочкой 6Fr.
4. Вставьте катетер 5Fr через бедренную оболочку через 0,035 в гидрофильном проводнике. Под рентгеноскопическим контролем переместите этот катетер к началу ОСА и удалите проводниковый провод.
5. Введите контрастное вещество (амидотризойную кислоту, разведенную до 50% физиологическим раствором) через катетер хедхантера для визуализации модели ОСА с аневризмой.
6. После того, как ангиография подтвердит правильность создания модели аневризмы, используйте животные модели для исследований или для обучения процедурам эндоваскулярного лечения.
7. Усыпляйте животных после окончания учебы или учебных курсов с помощью смертельного внутривенного введения хлорида калия (2 ммоль/кг) под глубокой анестезией.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Представленная методика была использована для различных целей, а именно для исследования заживления посткойлинговой аневризмы и обучения техникам эмболизации. Венозные мешочки использовались для тестирования дифференциального заживления с использованием как пла...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Существуют различные методы создания животных моделей аневризмы в зависимости от цели исследования. Некоторые протоколы моделирования аневризмы включают хирургические процедуры в сочетании с гипертензией или индукцией гемодинамического стресса путем введения ан...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylsalicylic acid	Sanofi	700693	500 mg tablets
Amidotrizoic acid	Bayer Hispania	914614.6	Contrast medium 76%
Anesthesia Machine	Maquet Clinical Care AB	6677200	Maquet Flow-i C20
Bulldog vascular clamp	Dimeda	12.092.07	7.5 cm
Buprenorphine	Richter Pharma Ag	578816	0.3 mg/mL
Clopidogrel	Sandoz	704005	75 mg tablets
Contrast medium	Bayer Hispania	914614	Urografin 36%
Dissector	Dimeda	12.421.01	21 cm
Fentanyl Matrix	Kern Pharma	664823	Transdermic release patch 25 µg/h
Fluoroscopy equipment	Philips Medical Systems		Veradius Unity
Hemostatic gelatin sponge	Takeda Farmaceutica España, SA	324459	Absorbable hemostatic agent. Espongostan
Head hunter catheter	Boston Scientific	RF*YB15110M	5 Fr 100 cm
Heparin	Rovi	641639	Heparin 5%
Hydrophilic guidewire	Terumo	RF*GA35153M	0.035” 150 cm
Introducer sheath	Terumo	RS*B60N10MQ	6 Fr 10 cm
Ketamine	Richter Pharma Ag	580395	100 mg/mL
Ketorolac	Laboratorios Normon, S.A.	603079	30 mg/mL
Micro-forceps	S&T	JFA-5b (1:1)	Forceps for microsugery
Micro-needle holder	S&T	Curved C-14 (Art nº 00088)	Needle holder for microsurgery
Microscissors	S&T	Adventitia SAS-15 R-8 (Art nº 00102)	Straight- scissors for microsurgery
Needle holder	Dimeda	24.114.12	12 cm
Nimodipine	Bayer Hispania, S.L	641969	10 mg/50 mL
Povidone-iodine	CV Medica	193203	Povidone iodine solution (10%)
Propofol	Orion Corporation	588475	10 mg/mL
PTFE prosthesis	Maquet	M00201501086B0	Synthetic prosthesis 6mm
Remifentanil	Laboratorios Normon, S.A.	692295	2 mg
Scalpel handle	Dimeda	06.104.00	13.5 cm
Scissors (Mayo)	Dimeda	07.164.14	14.5 cm
Scissors  (Metzenbaum)	Dimeda	07.287.15	15 cm
Surgical blades	Dimeda	06.122.00	22
Sutures: absorbable suture	Medtronic	GL-123	2/0
Sutures: poplypropylene suture	Aragó	37803	6/0 and 7/0
Swabs	Texpol	1063.01	20 x 20 cm
Tissue forceps	Dimeda	10.102.11 /10.120.11	11.5 cm
Vascular glue	Histoacryl Braun	1050060	Tissue adhesive
Vessel loops	Braun	B1095218	1.5 mm diammeter
Weitlaner	Dimeda	18.670.14	14 cm