Modelli suini di malattie aneurismatiche per la formazione e la ricerca

Riepilogo

Descrizione di due diversi modelli di suini aneurismatici per corsi di formazione in neuroradiologia e studi di ricerca. Questo studio fornisce prove della fattibilità di queste creazioni di modelli suini di aneurisma e dei metodi riproducibili che sono vicini al contesto clinico.

Abstract

I modelli animali di grandi dimensioni, in particolare i suini, sono ampiamente utilizzati per la ricerca di malattie cardiovascolari e terapie, nonché per scopi di addestramento. Questo articolo descrive due diversi modelli di suini aneurismatici che possono aiutare i ricercatori a studiare nuove terapie per le malattie aneuristiche. Questi modelli aneurismatici sono creati aggiungendo chirurgicamente una sacca di tessuto alle arterie carotidi nei suini. Quando il modello viene utilizzato per la ricerca, la busta deve essere autologa; Per l'allenamento è sufficiente una sacca sintetica.

In primo luogo, la vena giugulare esterna destra (EJV) e l'arteria carotide comune destra (CCA) devono essere esposte chirurgicamente. L'EJV è legato e una sacca venosa è formata da un segmento corto. Questa sacca viene quindi suturata a un'arteriotomia ellittica eseguita nel CCA. Gli animali devono essere mantenuti eparinizzati durante la creazione del modello e i vasodilatatori locali possono essere utilizzati per ridurre i vasospasmi. Una volta completata la sutura, è necessario ispezionare il corretto flusso sanguigno, verificando la presenza di sanguinamento dalla linea di sutura e la pervietà del vaso. Infine, l'incisione chirurgica viene chiusa da strati e viene eseguita un'angiografia per visualizzare il modello aneurismatico.

Una semplificazione di questo modello carotideo aneurismatico che diminuisce l'invasività e il tempo chirurgico è l'uso di una sacca sintetica, piuttosto che venosa. A tale scopo, una sacca viene personalizzata in anticipo con un segmento di una protesi in politetrafluoroetilene (PTFE), un'estremità della quale viene suturata vicino utilizzando una sutura vascolare in polipropilene e sterilizzata prima dell'intervento chirurgico. Questa "sacca" viene quindi collegata a un'arteriotomia eseguita nel CCA come descritto.

Sebbene questi modelli non riproducano molti degli eventi fisiopatologici correlati alla formazione di aneurisma, sono emodinamicamente simili alla situazione riscontrata in ambito clinico. Pertanto, possono essere utilizzati per scopi di ricerca o formazione, consentendo ai medici di apprendere e praticare diverse tecniche endovascolari in modelli animali vicini al sistema umano.

Introduzione

L'aneurisma intracranico (IA) è una grave malattia cerebrovascolare associata a un tasso di mortalità fino al 50% in caso di rottura. Si tratta di una condizione relativamente comune e potenzialmente letale, con una prevalenza riportata tra il 3,6% e il 6% negli studi angiografici¹. I vasi intracranici sono dilatati in modo anomalo e soffrono di distensione a causa di fattori di rischio multifattoriali, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, fumo, ipertensione, assunzione eccessiva di alcol o aumento dell'età. Se non trattata, l'IA può rompersi spontaneamente, provocando un'emorragia subaracnoidea (SAH) che è responsabile di una significativa morbilità e morte ^2,3,4. Inoltre, un terzo dei pazienti richiede il ricovero in ospedale o cure infermieristiche e solo il 30% dei pazienti con SAH può tornare a una vita indipendente, rappresentando così un grave carico di malattia nell'uomo che giustifica effettivamente la necessità di esperimenti sugli animali⁵.

Al giorno d'oggi, i pazienti ad alto rischio di rottura ed emorragia dell'IA vengono trattati con occlusione principalmente mediante avvolgimento endovascolare, clipping microchirurgico o stent deviatori di flusso ^6,7. La procedura endovascolare è stata valutata dall'International Subarachnoid Aneurysm Trial (ISAT), dimostrando che l'avvolgimento è più sicuro, meno invasivo e quindi ha effetti avversi meno significativi rispetto alla terapia microchirurgica³. Per questi motivi, le procedure endovascolari sono le tecniche più comuni utilizzate per il trattamento dell'IA³. È necessaria una formazione specializzata affinché i medici eseguano correttamente queste procedure minimamente invasive⁸.

Inoltre, lo sviluppo di nuovi dispositivi o terapie per il trattamento dell'IA deve essere ben consolidato e testato in studi preclinici prima della loro traduzione in ambito clinico ^6,9. Esistono diversi modelli animali sperimentali di IA a seconda dell'obiettivo principale della ricerca o degli scopi di formazione. Questi modelli sono stati eseguiti in numerose specie, con i loro limiti e vantaggi. Tuttavia, tutti comportano l'induzione artificiale o la creazione chirurgica a causa dell'assenza di IA naturale negli animali 2,6,9,10,11,12.

Sebbene nessun modello animale riproduca perfettamente la fisiopatologia umana, i piccoli animali, come i roditori, sono i più frequentemente utilizzati negli studi di ricerca sull'IA⁶. Le specie di grandi dimensioni sono solitamente impiegate per lo sviluppo di nuovi dispositivi endovascolari o per la formazione in interventi terapeutici². Tra i modelli animali di grandi dimensioni, è comune utilizzare i suini per la ricerca di disturbi e terapie dell'IA, nonché per corsi di formazione. Ciò è dovuto alla loro capacità di tollerare la procedura chirurgica e al loro diametro vascolare e flusso sanguigno simili rispetto ai vasi cerebrali umani ^2,13.

Il metodo di scelta per la creazione di modelli animali di IA varia a seconda dell'obiettivo principale di ogni singolo progetto di ricerca, ad esempio se verranno valutati gli endpoint angiografici o istologici. In questo senso, i modelli creati mediante legatura chirurgica o aggiungendo una sacca autologa di tessuto al CCA vengono utilizzati per la ricerca sulla crescita dell'IA. I modelli chirurgici devono essere combinati con l'induzione dell'ipertensione se l'endpoint primario dello studio è la rottura dell'IA. Quando il modello viene utilizzato per scopi di addestramento, la tecnica può essere semplificata utilizzando una sacca sintetica suturata sul CCA senza la necessità di ipertensione⁶.

Questo articolo descrive due diversi modelli di suini aneurismatici che possono aiutare i ricercatori a studiare nuove terapie o formazione in interventi endovascolari per le malattie IA. Questi modelli aneurismatici vengono creati aggiungendo chirurgicamente una sacca di tessuto al CCA nei suini. Quando il modello viene utilizzato per la ricerca, la sacca è autologa, fornendo così la possibilità di studiare la guarigione dell'aneurisma dopo l'esclusione senza l'interferenza di alcun materiale esogeno. Ai fini dell'allenamento, è sufficiente una sacca sintetica che riassuma l'anatomia endovascolare per riprodurre la procedura.

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Protocollo

L'esperimento è stato approvato dal comitato etico del Centro di Chirurgia Mininvasiva Jesús Usón e tutte le procedure sono state eseguite secondo il Regio Decreto 53/2013 e il regolamento europeo (2010/63/CE).

1. Preparazione prechirurgica e anestesia

1. Alleva grandi suini bianchi del peso di 35-40 kg singolarmente, con libero accesso all'acqua e al mangime una volta al giorno. Acclimatarsi per 2 settimane prima della data dell'intervento, per eseguire l'esame clinico e lasciare il tempo per rilevare le malattie silenti.
2. Somministrare i seguenti farmaci orali per prevenire eventi trombotici durante lo studio: acido acetilsalicilico (1 g/animale/24 ore) e Clopidogrel (75 mg/animale/24 ore) da 7 giorni prima dell'induzione del modello fino alla terapia IA.
3. Iniettare ketamina (10 mg/kg) per via intramuscolare dopo un periodo di digiuno di 24 ore. Dieci minuti dopo, indurre l'anestesia con l'1% di propofol per via endovenosa (3 mg/kg).
4. Dopo l'intubazione endotracheale, utilizzare il sevoflurano per via inalatoria per mantenere l'anestesia (frazione inspiratoria 3%-4,5%). Collegare i tubi endotracheali a un circuito anestetico circolare semichiuso collegato a un ventilatore con una portata di gas fresco di 0,5-1 L/min.
5. Per ottenere normocapnia (35-45 mmHg CO₂), controllare la ventilazione con un volume corrente di 8-10 mL/kg. Garantire un'adeguata analgesia intraoperatoria con una dose endovenosa iniziale di combinazione di ketorolac (1 mg/kg) e tramadolo (1 mg/kg) e un'infusione continua di remifentanil (15-18 μg/kg/h).
6. Confermare il corretto piano animale di anestesia considerando l'incoscienza (ipnosi), l'insensibilità al dolore, il rilassamento muscolare e l'assenza di risposte riflesse¹⁴.
7. Per prevenire la secchezza durante l'anestesia, utilizzare un unguento veterinario sugli occhi durante la procedura chirurgica.
8. Fissare gli animali anestetizzati al tavolo operatorio in posizione supina. Radere il collo degli animali, strofinare con iodio povidone e drappeggiare in condizioni sterili.
9. Eseguire tutte le procedure in condizioni sterili, utilizzando guanti e materiale sterili.

2. Chirurgia

1. Approccio chirurgico
   1. Eseguire un'incisione cutanea longitudinale lunga 10 cm a 2-3 cm a destra della linea mediana del collo.
2. Confezione di sacchetti
   1. Sacca autologa
      1. Per esporre l'EJV, sezionare il tessuto sottocutaneo e adiposo ed eseguire l'emostasi.
      2. Separare il muscolo sternocefalico destro dal tessuto connettivo e ritrarlo con un divaricatore Weitlaner per facilitare l'esposizione all'EJV.
      3. Esporre e identificare l'EJV, che è laterale e più profondo del CCA (Figura 1A).
      4. Utilizzare due pinze vascolari bulldog per fermare il flusso sanguigno all'interno del vaso durante l'estrazione del segmento venoso.
      5. Isolare un segmento di 15-20 mm dell'EJV per ottenere la sacca autologa.
      6. Legare le estremità prossimale e distale della EJV.
      7. Sciacquare il segmento venoso estratto con soluzione fisiologica eparinizzata (5.000 UI/L).
      8. Controllare l'interno dell'EJV asportato e selezionare un segmento lungo 7-8 mm in cui non siano presenti valvole venose.
      9. Modellare questo segmento in una sacca chiudendo un'estremità con una sutura in polipropilene 7/0 (Figura 1B).
      10. Tenere la busta immersa in soluzione salina eparinizzata fino al momento dell'uso.
      11. Confermare l'assenza di sanguinamento dall'EJV legata.
   2. Custodia sintetica
      1. Tagliare un segmento lungo 1 cm da una protesi in PTFE (6-8 mm di diametro, a seconda della dimensione aneurismatica che si vuole creare).
      2. Sutura un'estremità chiusa utilizzando una sutura vascolare in polipropilene 6/0. Sigillare questa parte chiusa della protesi con colla vascolare per evitare sanguinamenti dalla linea di sutura.
      3. Sterilizzare questo innesto sintetico prima della creazione chirurgica dell'aneurisma.
3. Chirurgia per creazione di aneurisma
   1. Per esporre il CCA, sezionare il tessuto sottocutaneo e adiposo ed eseguire l'emostasi.
   2. Separare il muscolo sternocefalico destro dal tessuto connettivo circostante e ritrarlo con un divaricatore Weitlaner per facilitare l'esposizione al CCA.
   3. Identificare il CCA. Posizionare 2 anse di vasi di silicio all'estremità cranica e distale del CCA esposto (Figura 2A). Sezionare 5 cm di questo vaso, rimuovendo la sua avventizia con un dissettore (Figura 2B). Durante questo accesso chirurgico, fare attenzione a evitare di ferire il nervo vago che può portare alla sindrome di Horner.
   4. Somministrare vasodilatatori localmente (come 1-2 mL di nimodipina 10 mg/50 mL) per prevenire i vasospasmi.
   5. Somministrare eparina per via endovenosa (150 UI/kg) 5 minuti prima del clampaggio incrociato del CCA.
   6. Posizionare un morsetto vascolare bulldog nella parte sezionata caudale del CCA e un altro morsetto vascolare bulldog a 4-5 cm di distanza nella parte cranica del vaso (Figura 2C).
   7. Utilizzare le microforbici per eseguire un'arteriotomia ellittica da 8 mm nel CCA tra i due morsetti vascolari bulldog (Figura 2D).
   8. Utilizzare una soluzione salina eparinizzata (5.000 UI/L) per lavare il segmento del CCA per via intraluminale.
   9. Sutura della sacca autologa o sintetica all'arteriotomia ellittica utilizzando una sutura in polipropilene 6/0 (Figura 3A, B). Lavare le pinze distale e prossimale prima di terminare la sutura della sacca.
   10. Proteggere il vaso e le strutture vicine con una soluzione salina calda ed eparinizzata durante la procedura microchirurgica.
   11. Una volta suturata la protesi o la sacca autologa al CCA, verificare che non vi siano sanguinamenti (Figura 3C, D). Per prima cosa, rimuovere il morsetto vascolare del bulldog cranico e poi quello caudale.
   12. Eseguire l'emostasi applicando pressione con tamponi bagnati se c'è del sanguinamento dalla linea di sutura. Se necessario, applicare la trazione agli anelli dei vasi o sostituire i morsetti vascolari del bulldog ed eseguire punti emostatici nel sito di sanguinamento. Se necessario, posizionare un pezzo di spugna di gelatina emostatica attorno alla protesi.
   13. Ispezionare il CCA pulse craniale fino al sacco aneurismatico per assicurarsi che sia stata recuperata la corretta pervietà carotidea.
   14. Chiudere l'incisione chirurgica a strati utilizzando suture riassorbibili 2/0 e la pelle con punti singoli con 0 punti di sutura non assorbibili.
   15. Somministrare buprenorfina (10 μg/kg/12 h) per via intramuscolare durante le prime 24 ore e posizionare un cerotto a rilascio transdermico di fentanil (25 μg/h) dopo le procedure chirurgiche per ottenere l'analgesia postoperatoria.
   16. Diminuire il sevoflurano inalato e aumentare la portata di gas fresco (20 L/min) per ottenere le condizioni di recupero. Rimuovere il tubo endotracheale quando gli animali respirano spontaneamente e sono stati recuperati parametri fisiologici, come la saturazione di ossigeno e la frequenza cardiaca.
       NOTA: Il gas fresco è una miscela di O₂ puro (100%) e aria medicale (21% O₂). Infine, la frazione di ossigeno inspirato è compresa tra il 50% e il 45% (FiO₂ = 0,5-0,45).
   17. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
   18. Tenere gli animali che hanno subito un intervento chirurgico isolati dagli altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.

3. Test angiografico e fase postoperatoria

1. Attendere 24-48 ore per evitare di danneggiare la linea di sutura.
2. Anestetizzare nuovamente l'animale come descritto sopra e radere la zona inguinale. Preparare la zona con iodio povidone e applicare un drappeggio sterile.
3. Accedi a un'arteria femorale utilizzando la tecnica di Seldinger modificata con una guaina introduttrice 6Fr.
4. Inserire un catetere da cacciatore di teste da 5 Fr attraverso la guaina femorale su un filo guida idrofilo da 0,035 pollici. Sotto guida fluoroscopica, far avanzare questo catetere fino all'origine del CCA e rimuovere il filo guida.
5. Iniettare il mezzo di contrasto (acido amidotrizoico diluito al 50% con una soluzione salina) attraverso il catetere cacciateste per visualizzare il modello CCA con aneurisma.
6. Una volta che l'angiografia conferma la corretta creazione del modello di aneurisma, utilizzare modelli animali per la ricerca o per l'addestramento delle procedure di trattamento endovascolare.
7. Sopprimere gli animali quando gli studi o i corsi di formazione si concludono con una somministrazione endovenosa letale di cloruro di potassio (2 mmol/kg) in anestesia profonda.

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Risultati

La tecnica presentata è stata utilizzata per diversi scopi, in particolare la ricerca sulla guarigione dell'aneurisma post-avvolgimento e la formazione nelle tecniche di embolizzazione. Le sacche venose sono state utilizzate per testare la guarigione differenziale utilizzando sia bobine di platino che bioattive. Le sacche sono state suturate come descritto sopra e, 24 ore dopo la creazione del modello, è stato effettuato un angiogramma per documentare le dimensioni e l'aspetto degli an...

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Discussione

Esistono diverse tecniche per creare modelli animali di aneurisma in base all'obiettivo dello studio. Alcuni protocolli modello di aneurisma includono procedure chirurgiche combinate con ipertensione o induzione di stress emodinamico mediante somministrazione di angiotensina II, nefrectomie o dieta ricca di sale, tra gli altri, perché l'obiettivo principale di questi studi è la ricerca sulla rottura dell'aneurisma. Tuttavia, nel presente studio, queste condizioni non sono indotte poich...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylsalicylic acid	Sanofi	700693	500 mg tablets
Amidotrizoic acid	Bayer Hispania	914614.6	Contrast medium 76%
Anesthesia Machine	Maquet Clinical Care AB	6677200	Maquet Flow-i C20
Bulldog vascular clamp	Dimeda	12.092.07	7.5 cm
Buprenorphine	Richter Pharma Ag	578816	0.3 mg/mL
Clopidogrel	Sandoz	704005	75 mg tablets
Contrast medium	Bayer Hispania	914614	Urografin 36%
Dissector	Dimeda	12.421.01	21 cm
Fentanyl Matrix	Kern Pharma	664823	Transdermic release patch 25 µg/h
Fluoroscopy equipment	Philips Medical Systems		Veradius Unity
Hemostatic gelatin sponge	Takeda Farmaceutica España, SA	324459	Absorbable hemostatic agent. Espongostan
Head hunter catheter	Boston Scientific	RF*YB15110M	5 Fr 100 cm
Heparin	Rovi	641639	Heparin 5%
Hydrophilic guidewire	Terumo	RF*GA35153M	0.035” 150 cm
Introducer sheath	Terumo	RS*B60N10MQ	6 Fr 10 cm
Ketamine	Richter Pharma Ag	580395	100 mg/mL
Ketorolac	Laboratorios Normon, S.A.	603079	30 mg/mL
Micro-forceps	S&T	JFA-5b (1:1)	Forceps for microsugery
Micro-needle holder	S&T	Curved C-14 (Art nº 00088)	Needle holder for microsurgery
Microscissors	S&T	Adventitia SAS-15 R-8 (Art nº 00102)	Straight- scissors for microsurgery
Needle holder	Dimeda	24.114.12	12 cm
Nimodipine	Bayer Hispania, S.L	641969	10 mg/50 mL
Povidone-iodine	CV Medica	193203	Povidone iodine solution (10%)
Propofol	Orion Corporation	588475	10 mg/mL
PTFE prosthesis	Maquet	M00201501086B0	Synthetic prosthesis 6mm
Remifentanil	Laboratorios Normon, S.A.	692295	2 mg
Scalpel handle	Dimeda	06.104.00	13.5 cm
Scissors (Mayo)	Dimeda	07.164.14	14.5 cm
Scissors  (Metzenbaum)	Dimeda	07.287.15	15 cm
Surgical blades	Dimeda	06.122.00	22
Sutures: absorbable suture	Medtronic	GL-123	2/0
Sutures: poplypropylene suture	Aragó	37803	6/0 and 7/0
Swabs	Texpol	1063.01	20 x 20 cm
Tissue forceps	Dimeda	10.102.11 /10.120.11	11.5 cm
Vascular glue	Histoacryl Braun	1050060	Tissue adhesive
Vessel loops	Braun	B1095218	1.5 mm diammeter
Weitlaner	Dimeda	18.670.14	14 cm