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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe el proceso de generación y caracterización de organoides uroteliales de ratón que albergan deleciones en genes de interés. Los métodos incluyen la recolección de células uroteliales de ratón, la transducción ex vivo con adenovirus que impulsa la expresión de Cre con un promotor de CMV y la caracterización in vitro e in vivo.

Resumen

El cáncer de vejiga es un área poco estudiada, particularmente en modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM). Los GEMM endogámicos con sitios Cre y loxP específicos de tejidos han sido los estándares de oro para la orientación génica condicional o inducible. Para proporcionar modelos experimentales más rápidos y eficientes, se desarrolla un sistema de cultivo de organoides ex vivo utilizando adenovirus Cre y células uroteliales normales que transportan múltiples alelos loxP de los supresores tumorales Trp53, Pten y Rb1. Las células uroteliales normales se disocian enzimáticamente de cuatro vejigas de ratones triple floxed (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). Las células uroteliales se transducen ex vivo con adenovirus-Cre impulsado por un promotor del CMV (Ad5CMVCre). Los organoides vesicales transducidos se cultivan, propagan y caracterizan in vitro e in vivo. La PCR se utiliza para confirmar las deleciones de genes en Trp53, Pten y Rb1. La tinción de inmunofluorescencia (IF) de organoides demuestra una expresión positiva de los marcadores de linaje urotelial (CK5 y p63). Los organoides se inyectan por vía subcutánea en ratones huésped para la expansión del tumor y los pasajes en serie. La inmunohistoquímica (IHC) de los xenoinjertos exhibe expresión positiva de CK7, CK5 y p63 y expresión negativa de CK8 y Uroplakin 3. En resumen, la deleción de genes mediada por adenovirus de células uroteliales de ratón diseñadas con sitios loxP es un método eficiente para probar rápidamente el potencial tumorígeno de alteraciones genéticas definidas.

Introducción

El cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en los hombres y afecta a más de 80,000 personas anualmente en los Estados Unidos1. La quimioterapia basada en platino ha sido el estándar de atención para los pacientes con cáncer de vejiga avanzado durante más de tres décadas. El panorama del tratamiento del cáncer de vejiga ha sido revolucionado por la reciente aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de inmunoterapia (inhibidores del punto de control inmunitario anti-PD-1 y anti-PD-L1), erdafitinib (un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) y enfortumab vedotin (un conjugado anticuerpo-fármaco)2,3,4. Sin embargo, no hay biomarcadores clínicamente aprobados disponibles para predecir las respuestas a la quimioterapia o la inmunoterapia. Existe una necesidad crítica de generar modelos preclínicos informativos que puedan mejorar la comprensión de los mecanismos que impulsan la progresión del cáncer de vejiga y desarrollar biomarcadores predictivos para diferentes modalidades de tratamiento.

Un obstáculo importante en la investigación traslacional de la vejiga es la falta de modelos preclínicos que recapitulen la patogénesis del cáncer de vejiga humana y las respuestas al tratamiento 5,6. Se han desarrollado múltiples modelos preclínicos, incluyendo modelos 2D in vitro (líneas celulares o células reprogramadas condicionalmente), modelos 3D in vitro (organoides, impresión 3D) y modelos in vivo (xenoinjerto, inducido por carcinógenos, modelos genéticamente modificados y xenoinjerto derivado del paciente)2,6. Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) son útiles para muchas aplicaciones en la biología del cáncer de vejiga, incluidos los análisis de fenotipos tumorales, las investigaciones mecanicistas de genes candidatos y / o vías de señalización, y la evaluación preclínica de respuestas terapéuticas 6,7. Los GEMM pueden utilizar recombinasas específicas del sitio (Cre-loxP) para controlar las deleciones genéticas en uno o más genes supresores de tumores. El proceso de generar GEMM deseados con múltiples deleciones de genes lleva mucho tiempo, es laborioso y costoso5. El objetivo general de este método es desarrollar un método rápido y eficiente de administración de Cre ex vivo para establecer modelos de triple knockout (TKO) de vejiga a partir de células uroteliales normales de ratón portadoras de alelos triples floxed (Trp53, Pten y Rb1)8. La principal ventaja del método ex vivo es el flujo de trabajo rápido (1-2 semanas en lugar de años de cría de ratones). Este artículo describe el protocolo para la recolección de células uroteliales normales con alelos floxados, transducción de adenovirus ex vivo, cultivos de organoides y caracterización in vitro e in vivo en ratones inmunocompetentes C57 BL/6J. Este método se puede utilizar además para generar organoides de cáncer de vejiga clínicamente relevantes en ratones inmunocompetentes que albergan cualquier combinación de alelos floxed.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 y 180502).
NOTA: Realice los pasos 1-3 el mismo día.

1. Disección de la vejiga del ratón

  1. Preparación para la disección
    1. Prepare todos los instrumentos estériles, incluyendo tijeras, fórceps, DPBS estériles en platos de cultivo de 35 mm, etanol al 70%, gasa estéril y toallas de papel limpias. Limpie todas las superficies del área de disección. Generar ratones machos triple floxed Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 ratones, 10 semanas de edad), como se describió anteriormente en el laboratorio del Dr. Goodrich 8.
  2. Eutanasia e incisión
    1. Sacrificar a los ratones mediante asfixia por CO2 utilizando un caudal de 2,0 L/min, seguido de luxación cervical. Limpie el área de disección con etanol al 70% y cúbrala con una toalla de papel limpia.
    2. Coloque el ratón sobre una gasa en el área de disección. Rocíe etanol al 70% en el abdomen del ratón y use tijeras de disección estériles para hacer una incisión abdominal en la línea media inferior que exponga la vejiga.
  3. Disección de la vejiga
    1. Use fórceps para agarrar la vejiga y tire suavemente hacia arriba para que se identifiquen las uniones ureterovesicales bilaterales. Use tijeras para extraer el fondo de la vejiga siguiendo la línea límite entre las dos aberturas del uréter.
    2. Transfiera la vejiga a un plato estéril con 2 ml de DPBS. Retire el tejido graso y conectivo y coloque la vejiga en un plato nuevo con 2 ml estériles de DPBS. En este momento, saque el adenovirus del almacenamiento de -80 ° C y manténgalo en hielo.

2. Disociación de las células uroteliales

  1. Preparación para la disociación celular
    1. Prepare todos los instrumentos estériles, incluidos fórceps, bisturíes quirúrgicos (una cuchilla de tamaño 10 con asa), DPBS estériles en platos de cultivo de 35 mm, medio de cultivo completo sin FBS despojado de carbón definido como CCM(-), mezcla de colagenasa / hialuronidasa, enzima recombinante para sustituto de tripsina, FBS 10% despojado de carbón en DPBS con 10 μM fresco Y-27632, un colador de células estériles de 100 μm y un tubo de centrífuga de 15 ml.
      NOTA: El medio de cultivo completo (CCM) comprende el medio de crecimiento de células epiteliales mamarias suplementado con los factores de crecimiento proporcionados y 5% de FBS sin carbón, sustituto de L-glutamina al 1%, primocina de 100 μg / ml y 10 μM de Y-27632 fresco.
  2. Picar y digerir la vejiga
    1. Transfiera y lave la vejiga nuevamente con 2 ml de DPBS estéril en un plato de 35 mm en un gabinete de bioseguridad.
    2. Recolecte los tejidos de la vejiga de cuatro ratones en un plato con 1 ml de CCM (-) y pica cada vejiga en cuatro piezas iguales usando una cuchilla quirúrgica. Use fórceps para desplegar la vejiga y exponer la superficie del urotelio al medio.
    3. Transfiera las piezas de la vejiga y el medio a un tubo centrífugo de 15 ml. Lave el plato con 2 ml de CCM(-) 2x y recójalo en un tubo centrífugo hasta un volumen total de 5 ml.
    4. Añadir la mezcla de colagenasa/hialuronidasa a una concentración final de 300 U/ml de colagenasa y 100 U/ml de hialuronidasa y colocar el tubo horizontalmente en un agitador de incubación orbital de 37 °C durante 30 min a 200 rpm.
    5. Después de la digestión del tejido, agregue un volumen igual (5 ml) de FBS al 10% de carbón en DPBS en el tubo y centrífuga el tubo a 200 x g durante 5 min.
    6. Retire y deseche el sobrenadante. Agregue 2 ml de sustituto de tripsina en el pellet celular y mezcle bien. Coloque el tubo en una incubadora de células a 37 °C y 5% de CO2 durante 4 min.
    7. Después de la incubación, pipetee hacia arriba y hacia abajo 10x con una punta P1000 estándar. Agregue 5 ml de FBS al 10% de carbón en DPBS.
    8. Colar las células disociadas a través de un colador de células estériles de 100 μm. Recoger la suspensión celular y la centrífuga a 200 x g durante 5 min.
  3. Contar y resuspender células
    1. Retire y deseche el sobrenadante. Resuspend el pellet celular con 1 mL de CCM.
    2. Cuente el número de células usando un hemocitómetro y solo coloque 0.5 x 106 células en un pozo de una placa de 24 pocillos con 0.5 mL de CCM fresco. En este momento, saque los extractos de matriz de células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (ver Tabla de Materiales) de almacenamiento a -20 ° C y descongele en hielo. Precaliente una placa de 6 pocillos en una incubadora de células a 37 °C.
      NOTA: Las células restantes se pueden centrifugar y congelar como gránulos celulares para el control de la transducción no viral.

3. Transducción adenoviral y organoides de recubrimiento

PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al procesar el adenovirus. El personal del laboratorio debe seguir las prácticas de nivel 2 de bioseguridad y desinfectar el adenovirus con lejía al 10%.

  1. Añadir 2 μL de adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) en la placa de 24 pocillos. Mezclar bien con las células uroteliales disociadas.
  2. Para mejorar la eficacia de la transducción, realice la espinoculación centrifugando la placa de 24 pocillos a 300 x g durante 30 min a temperatura ambiente. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora de células a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h.
  3. Transfiera las células y el medio del pozo a un tubo de 15 ml y centrífuga a 200 x g durante 5 min. Retire y deseche el sobrenadante, agregue 50 μL de CCM y mezcle bien con las células en la parte inferior.
  4. Agregue 140 μL de extracto de matriz y mezcle suavemente bien para evitar burbujas de aire. Agregue la solución rápidamente en la placa de 6 pocillos precalentada a 50 μL / cúpula para crear cúpulas para organoides.
  5. Transfiera la placa a una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 suavemente y deje que las cúpulas se solidifiquen durante 5 min. Voltee la placa de 6 pocillos al revés y continúe la solidificación durante 25 minutos adicionales.
  6. Después de la incubación, agregue 2.5 ml de MCP a cada pozo y coloque la placa en una incubadora para cultivo de organoides.

4. Cultivo de organoides y pasaje

  1. Cambie el medio cada 3-4 días. Realizar cultivo de organoides, pasaje y congelación como se informa en Lee et al.9. Realizar la incrustación de organoides utilizando gel de procesamiento de muestras como se describe en Fujii et al.10.
  2. Retire el medio y agregue 1 ml de dispase a cada pozo. Rompe suavemente la cúpula y mezcla bien con una punta de pipeta P1000.
  3. Coloque la placa en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 durante 30 min. Luego, recoja todas las células en un tubo centrífugo de 15 ml y lave el pozo con 4 ml de FBS al 10% sin carbón en DPBS. Si las células organoides aparecen como grupos grandes, realice el paso 2.2.6. y paso 2.2.7. para obtener células disociadas.
  4. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y lave las células con 1 ml de MCP.
  5. Resuspend las células en un 70% de extracto de matriz y siga los pasos 3.4.-3.6. para el cultivo. Alternativamente, criopreservar las células mediante la resuspsión en 90% de FBS despojado de carbón y 10% de DMSO suplementado con 10 μM fresco Y-27632.

5. Implantación de células organoides en ratones C57BL/6J por vía subcutánea

  1. Preparación para la implantación
    1. Prepare 25G 1.5 en agujas, una jeringa de 1 ml, 1 mg / ml de dispasa, extracto de matriz, FBS al 10% despojado de carbón en DPBS con 10 μM fresco Y-27632 y un tubo de centrífuga de 15 ml.
  2. Colección de células organoides
    1. Después de lograr un cultivo estable durante al menos 5 pasajes, recoja las células organoides expandidas para la inyección in vivo . Siga los pasos 4.2.-4.4. y células resuspend en 1 ml de MCC.
  3. Conteo de células e inyección subcutánea
    1. Cuente el número de células usando un hemocitómetro. Después de la centrifugación a 200 x g durante 5 min, resuspenda 2 x 106 celdas en 100 μL de extracto de matriz al 50% en DPBS. Coloque la suspensión sobre hielo y llévela a un gabinete de bioseguridad en una sala de procedimientos para animales.
    2. Anestesiar dos ratones machos C57BL/6J (10 semanas de edad) con 4% de isoflurano y 1 L/min O2 de flujo durante aproximadamente 4 min en una cámara. Una vez que los ratones han perdido su reflejo de enderezamiento y su patrón de respiración se ha vuelto más profundo y lento, transfiera los ratones a un circuito sin re-re-refreathing con 2% de isoflurano y 1 L / min O2 de flujo. Aplique ungüento veterinario para proteger los ojos de los animales de lesiones traumáticas.
    3. Afeitarse un área alrededor del sitio de inyección en el flanco derecho del ratón y usar etanol al 70% para limpiar, y luego usar una aguja de 25 G para inyectar directamente la suspensión celular de 100 μL en el flanco derecho bajo anestesia.
    4. Después de la inyección, retire la anestesia inhalatoria y coloque a los ratones en una jaula bajo una lámpara de calor hasta que se recuperen y se movilicen por completo. Devuelva los ratones para alojarlos y monitoree la formación de tumores.

6. Recolección de tumores y propagación in vivo

  1. Siga el paso de preparación 2.1.1. Sacrificar ratones por asfixia de CO2 utilizando una tasa de flujo de 2.0 L / min seguida de dislocación cervical después de que se forma un tumor de ~ 2.0 cm de diámetro (casi 2-3 semanas). Transfiera los ratones a un área de disección limpia, rocíe etanol al 70% en el área del tumor del flanco del ratón y use tijeras y fórceps de disección estériles para hacer una incisión para separar el tumor.
  2. Lave el tumor en un plato de 60 mm con 5 ml de DPBS y use tijeras para extirpar el tejido conectivo. Cortar una pieza del tumor fresco y hundirlo con paraformaldehído al 4% en DPBS durante 48 h y enviarlo para incrustación y seccionamiento de parafina para análisis histológico.
  3. Procese la otra mitad del tumor fresco para la disociación celular. Brevemente, picar el tumor fresco en 1 mm3 piezas para la disociación en un plato de 60 mm con 5 ml de CCM(-). Luego, después de seguir los pasos 2.2.4.-2.2.8., inyecte las células disociadas en nuevos ratones C57BL / 6J para pasar in vivo después del paso 5.3. o mantener como cultivo organoide in vitro siguiendo los Pasos 3.4.-3.6., o congelar directamente en nitrógeno líquido utilizando 90% de FBS despojado de carbón y 10% de DMSO con 10 μM de Y-27632 fresco.
  4. Si es necesario, recupere las células congeladas descongelándolas rápidamente en un baño de agua a 37 °C y lavándolas con CCM(-). Después de esto, resuspenderlos en 100 μL de extracto de matriz al 50% en DPBS para inyección directa en ratones para la formación de tumores in vivo . Use al menos 2 x 106 células descongeladas para una inyección in vivo .

Resultados

El flujo de trabajo de las deleciones de genes mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón se muestra en la Figura 1A. El video que lo acompaña demuestra cómo las células uroteliales se disocian del fondo de ojo de la vejiga y cómo las células triples floxadas se transducen ex vivo con Ad5CMVCre. La Figura 1A mostró que la submucosa mínima y las células musculares se disociaron después de la digestión enzimática. Para confir...

Discusión

Los GEMM han sido los estándares de oro para el modelado del cáncer iniciado a partir de células normales, lo que permite probar rigurosamente las consecuencias de posibles perturbaciones oncogénicas (activación del oncogén y / o pérdida de supresores de tumores). Aquí, se proporciona un protocolo rápido y eficiente para generar organoides de cáncer de vejiga a través de la edición de genes ex vivo de células uroteliales normales de ratón que transportan alelos floxados en genes de interés. La tin...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo de investigación fue apoyado en parte por NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 y R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation y Friends of Urology Foundation. Agradecemos a Marisa Blask y Mila Pakhomova por revisar el manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100 μm sterile cell strainerCorning431752
1 mL syringeBD309659
25G 1.5 inches needleEXELINT International26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)UI Viral Vector CoreVVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6JJackson Lab000664
Charcoal-stripped FBSGibcoA3382101
Collagenase/hyaluronidaseStemcell Technologies07912
DispaseStemcell Technologies07913
DPBS, 1xCorning21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)Gibco35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth mediumLonzaCC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)CorningCB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20DAKOM7019IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7Santa Cruz BiotechnologySC-23876IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63Abcamab735IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3Fitzgerald10R-U103AIHC 1:50
Monoclonal mouse anti-VimentinSanta Cruz BiotechnologySC-6260IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-I-sIF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubatorThermo Fisher51033557
Polyclonal chicken anti-CK5Biolegend905901IF 1:500
PrimocinInvivoGenant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)Thermo Fisher12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575VWR35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)Thermo FisherHG-4000-012
Surgical blade size 10Integra Miltex4-110
Sorvall Legend RTThermo Fisher75004377
Sorvall T1 centrifugeThermo Fisher75002383
Y-27632SelleckchemS1049

Referencias

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