Ex Vivo Modèle organoïde de délétions de gènes médiés par l’adénovirus-Cre dans des cellules urothéliales de souris

Résumé

Ce protocole décrit le processus de génération et de caractérisation des organoïdes urothéliaux de souris hébergeant des délétions dans les gènes d’intérêt. Les méthodes comprennent la récolte de cellules urothéliales de souris, la transduction ex vivo avec adénovirus conduisant l’expression de Cre avec un promoteur CMV, et la caractérisation in vitro et in vivo .

Résumé

Le cancer de la vessie est un domaine peu étudié, en particulier dans les modèles murins génétiquement modifiés (GEMM). Les GEMM consanguins avec des sites Cre et loxP spécifiques aux tissus ont été les étalons-or pour le ciblage génétique conditionnel ou inductible. Pour fournir des modèles expérimentaux plus rapides et plus efficaces, un système de culture organoïde ex vivo est développé en utilisant l’adénovirus Cre et des cellules urothéliales normales portant plusieurs allèles loxP des suppresseurs de tumeurs Trp53, Pten et Rb1. Les cellules urothéliales normales sont dissociées enzymatiquement de quatre vessies de souris triple floxées (Trp53^f/f: Pten^f/f: Rb1^f/f). Les cellules urothéliales sont transduites ex vivo avec l’adénovirus-Cre entraîné par un promoteur CMV (Ad5CMVCre). Les organoïdes de la vessie transductés sont cultivés, multipliés et caractérisés in vitro et in vivo. La PCR est utilisée pour confirmer les délétions de gènes dans Trp53, Pten et Rb1. La coloration par immunofluorescence (FI) des organoïdes démontre une expression positive des marqueurs de lignée urothéliale (CK5 et p63). Les organoïdes sont injectés par voie sous-cutanée dans des souris hôtes pour l’expansion tumorale et les passages en série. L’immunohistochimie (IHC) des xénogreffes présente une expression positive de CK7, CK5 et p63 et une expression négative de CK8 et Uroplakin 3. En résumé, la délétion génique médiée par l’adénovirus à partir de cellules urothéliales de souris conçues avec des sites loxP est une méthode efficace pour tester rapidement le potentiel tumorigène d’altérations génétiques définies.

Introduction

Le cancer de la vessie est le quatrième cancer le plus fréquent chez les hommes et touche plus de 80 000 personnes chaque année aux États-Unis¹. La chimiothérapie à base de platine est la norme de soins pour les patients atteints d’un cancer de la vessie avancé depuis plus de trois décennies. Le paysage du traitement du cancer de la vessie a été révolutionné par l’approbation récente par la Food and Drug Administration (FDA) de l’immunothérapie (inhibiteurs du point de contrôle immunitaire anti--1 et anti--L1), de l’erdafitinib (un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance des fibroblastes) et de l’enfortumab vedotin (un conjugué anticorps-médicament)^2,3,4. Cependant, aucun biomarqueur cliniquement approuvé n’est disponible pour prédire les réponses à la chimiothérapie ou à l’immunothérapie. Il est essentiel de générer des modèles précliniques informatifs qui peuvent améliorer la compréhension des mécanismes à l’origine de la progression du cancer de la vessie et développer des biomarqueurs prédictifs pour différentes modalités de traitement.

Un obstacle majeur dans la recherche translationnelle sur la vessie est le manque de modèles précliniques qui récapitulent la pathogenèse du cancer de la vessie humaine et les réponses au traitement ^5,6. Plusieurs modèles précliniques ont été développés, y compris des modèles 2D in vitro (lignées cellulaires ou cellules conditionnellement reprogrammées), des modèles 3D in vitro (organoïdes, impression 3D) et des modèles in vivo (xénogreffe, modèles induits par cancérogène, génétiquement modifiés et xénogreffes dérivées de patients)^2,6. Les modèles murins génétiquement modifiés (GEMM) sont utiles pour de nombreuses applications en biologie du cancer de la vessie, y compris les analyses des phénotypes tumoraux, les investigations mécanistes des gènes candidats et / ou des voies de signalisation, et l’évaluation préclinique des réponses thérapeutiques ^6,7. Les GEMM peuvent utiliser des recombinases spécifiques au site (Cre-loxP) pour contrôler les délétions génétiques dans un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs. Le processus de génération des GEMM souhaités avec de multiples délétions de gènes est long, laborieux et coûteux⁵. L’objectif global de cette méthode est de développer une méthode rapide et efficace d’administration ex vivo de Cre pour établir des modèles de triple knockout de la vessie (TKO) à partir de cellules urothéliales normales de souris porteuses d’allèles triples floxés (Trp53, Pten et Rb1)⁸. Le principal avantage de la méthode ex vivo est le flux de travail rapide (1-2 semaines au lieu d’années d’élevage de souris). Cet article décrit le protocole de prélèvement de cellules urothéliales normales avec des allèles floxés, la transduction ex vivo de l’adénovirus, les cultures organoïdes et la caractérisation in vitro et in vivo chez des souris immunocompétentes C57 BL/6J. Cette méthode peut également être utilisée pour générer des organoïdes du cancer de la vessie cliniquement pertinents chez les souris immunocompétentes hébergeant n’importe quelle combinaison d’allèles floxés.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) au Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 et 180502).
REMARQUE : Effectuez les étapes 1 à 3 le même jour.

1. Dissection de la vessie de la souris

1. Préparation à la dissection
   1. Préparez tous les instruments stériles, y compris les ciseaux, les pinces, le DPBS stérile dans des boîtes de culture de 35 mm, l’éthanol à 70%, la gaze stérile et les serviettes en papier propres. Nettoyez toutes les surfaces de la zone de dissection. Générer des souris mâles triple floxées Trp53^f/f: Pten^f/f: Rb1^f/f (4 souris, âgées de 10 semaines), comme décrit précédemment dans le laboratoire ⁸ du Dr Goodrich.
2. Euthanasie et incision
   1. Euthanasier les souris par asphyxie au CO₂ en utilisant un débit de 2,0 L/min, suivi d’une luxation cervicale. Nettoyez la zone de dissection avec 70% d’éthanol et couvrez avec une serviette en papier propre.
   2. Placez la souris sur de la gaze dans la zone de dissection. Vaporisez de l’éthanol à 70% sur l’abdomen de la souris et utilisez des ciseaux de dissection stériles pour faire une incision abdominale médiane inférieure exposant la vessie.
3. Disséquer la vessie
   1. Utilisez des pinces pour saisir la vessie et tirez doucement vers le haut afin que les jonctions urétéroscopiques bilatérales soient identifiées. Utilisez des ciseaux pour enlever le fond d’œil de la vessie en suivant la ligne de démarcation entre les deux ouvertures de l’uretère.
   2. Transférer la vessie dans un plat stérile avec 2 mL de DPBS. Retirez le tissu adipeux et conjonctif et mettez la vessie dans un nouveau plat avec 2 mL stériles de DPBS. À ce moment-là, retirez l’adénovirus de l’entreposage de -80 °C et conservez-le sur la glace.

2. Dissociation des cellules urothéliales

1. Préparation à la dissociation cellulaire
   1. Préparer tous les instruments stériles, y compris les pinces, les scalpels chirurgicaux (une lame de taille 10 avec poignée), le DPBS stérile dans des boîtes de culture de 35 mm, le milieu de culture complet sans FBS dépouillé de charbon de bois défini comme CCM(-), mélange de collagénase /hyaluronidase, enzyme recombinante pour substitut de trypsine, FBS dépouillé à 10% de charbon de bois dans DPBS avec 10 μM de Y-27632 frais, une passoire cellulaire stérile de 100 μm et un tube de centrifugeuse de 15 mL.
      REMARQUE: Le milieu de culture complet (CCM) comprend le milieu de croissance des cellules épithéliales mammaires complété par les facteurs de croissance fournis et 5% de FBS dépouillé de charbon de bois, 1% de substitut de L-glutamine, 100 μg / mL de primocine et 10 μM de Y-27632 frais.
2. Mincing et digestion de la vessie
   1. Transférer et laver à nouveau la vessie avec 2 mL de DPBS stérile dans un plat de 35 mm dans une armoire de biosécurité.
   2. Recueillir les tissus vésicaux de quatre souris dans un plat avec 1 mL de CCM(-) et hacher chaque vessie en quatre morceaux égaux à l’aide d’une lame chirurgicale. Utilisez une pince pour déplier la vessie afin d’exposer la surface de l’urothélium au milieu.
   3. Transférer les morceaux de vessie et le milieu dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Lavez le plat avec 2 mL de CCM(-) 2x et collectez-le dans un tube de centrifugeuse jusqu’à un volume total de 5 mL.
   4. Ajouter le mélange collagénase/hyaluronidase à une concentration finale de 300 U/mL de collagénase et de 100 U/mL de hyaluronidase et placer le tube horizontalement dans un agitateur d’incubation orbitale à 37 °C pendant 30 min à 200 tr/min.
   5. Après la digestion des tissus, ajouter un volume égal (5 mL) de FBS dépouillé de charbon de bois à 10% dans le DPBS dans le tube et centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min.
   6. Retirez et jetez le surnageant. Ajouter 2 mL de substitut de trypsine dans la pastille cellulaire et bien mélanger. Mettez le tube dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 4 min.
   7. Après l’incubation, pipette de haut en bas 10x avec une pointe P1000 standard. Ajouter 5 mL de FBS dépouillé à 10 % de charbon de bois dans le DPBS.
   8. Filtrer les cellules dissociées à l’aide d’une passoire cellulaire stérile de 100 μm. Prélever la suspension de la cellule et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
3. Comptage et réutilisation des cellules
   1. Retirez et jetez le surnageant. Remettre en suspension la pastille de cellule avec 1 mL de CCM.
   2. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ne plaquez que 0,5 x 10⁶ cellules dans un puits d’une plaque de 24 puits avec 0,5 mL de CCM frais. À ce moment-là, retirez les extraits matriciels de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (voir Tableau des matériaux) du stockage à -20 °C et décongérez sur la glace. Préchauffez une plaque de 6 puits dans un incubateur cellulaire à 37 °C.
      REMARQUE: Les cellules restantes peuvent être centrifugées et congelées sous forme de pastilles cellulaires pour le contrôle de la transduction non virale.

3. Organoïdes de transduction adénovirale et de placage

ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous traitez l’adénovirus. Le personnel de laboratoire doit suivre les pratiques de niveau de biosécurité 2 et désinfecter l’adénovirus avec 10 % d’eau de Javel.

1. Ajouter 2 μL d’adénovirus (Ad5CMVCre; 1 x 10⁷ PFU/μL) dans la plaque de 24 puits. Bien mélanger avec les cellules urothéliales dissociées.
2. Pour améliorer l’efficacité de la transduction, effectuez la spinoculation en centrifugant la plaque de 24 puits à 300 x g pendant 30 min à température ambiante. Placer la plaque de 24 puits dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 h.
3. Transférer les cellules et le milieu du puits dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Retirer et jeter le surnageant, ajouter 50 μL de CCM et bien mélanger avec les cellules au fond.
4. Ajouter 140 μL d’extrait de matrice et bien mélanger doucement pour éviter les bulles d’air. Ajouter la solution rapidement dans la plaque préchauffée à 6 puits à 50 μL/dôme pour créer des dômes pour les organoïdes.
5. Transférer doucement la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ et laisser les dômes se solidifier pendant 5 min. Retournez la plaque de 6 puits à l’envers et poursuivez la solidification pendant 25 minutes supplémentaires.
6. Après l’incubation, ajouter 2,5 mL de CCM à chaque puits et placer la plaque dans un incubateur pour la culture organoïde.

4. Culture et passage d’organoïdes

1. Changez le support tous les 3-4 jours. Effectuer la culture d’organoïdes, le passage et la congélation comme indiqué dans Lee et ^al.9. Effectuer l’incorporation d’organoïdes à l’aide d’un gel de traitement d’échantillons tel que décrit dans Fujii et ^al.10.
2. Retirer le milieu et ajouter 1 mL de dispase à chaque puits. Cassez doucement le dôme et mélangez bien avec une pointe de pipette P1000.
3. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 30 min. Ensuite, collectez toutes les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 mL et lavez le puits avec 4 mL de FBS dépouillé de charbon de bois à 10% dans du DPBS. Si les cellules organoïdes apparaissent sous forme de grands amas, effectuez l’étape 2.2.6. et l’étape 2.2.7. pour obtenir des cellules dissociées.
4. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et lavez les cellules avec 1 mL de CCM.
5. Remettez les cellules en suspension dans un extrait matriciel à 70% et suivez les étapes 3.4.-3.6. pour la culture. Alternativement, cryoconservez les cellules en les réutilisant dans 90% de FBS dépouillés de charbon de bois et 10% de DMSO complété par 10 μM de Y-27632 frais.

5. Implantation de cellules organoïdes dans la souris C57BL/6J par voie sous-cutanée

1. Préparation à l’implantation
   1. Préparer 25G 1,5 dans des aiguilles, une seringue de 1 mL, 1 mg/mL de dispase, un extrait de matrice, un FBS dépouillé à 10 % de charbon de bois dans du DPBS avec 10 μM de Y-27632 frais et un tube de centrifugeuse de 15 mL.
2. Collecte de cellules organoïdes
   1. Après avoir obtenu une culture stable pendant au moins 5 passages, prélever les cellules organoïdes expansées pour une injection in vivo . Suivez les étapes 4.2.-4.4. et remettre en suspension des cellules dans 1 mL de CCM.
3. Comptage des cellules et injection sous-cutanée
   1. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Après centrifugation à 200 x g pendant 5 min, remettre en suspension 2 x 10⁶ cellules dans 100 μL d’extrait de matrice à 50% dans DPBS. Placez la suspension sur de la glace et apportez-la dans une armoire de biosécurité dans une salle d’intervention pour animaux.
   2. Anesthésier deux souris mâles C57BL/6J (âgées de 10 semaines) avec 4% d’isoflurane et 1 L/min O₂ de débit pendant environ 4 min dans une chambre. Une fois que les souris ont perdu leur réflexe de redressement et que leur rythme respiratoire est devenu plus profond et plus lent, transférez les souris dans un circuit sans réinspiration avec 2% d’isoflurane et 1 L / min O₂ de débit. Appliquez une pommade vétérinaire pour protéger les yeux des animaux contre les blessures traumatiques.
   3. Rasez une zone autour du site d’injection sur le flanc droit de la souris et utilisez 70% d’éthanol pour nettoyer, puis utilisez une aiguille de 25 G pour injecter directement la suspension cellulaire de 100 μL dans le flanc droit sous anesthésie.
   4. Après l’injection, retirez l’anesthésie par inhalation et placez les souris dans une cage sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’elles soient récupérées et se mobilisent complètement. Retournez les souris pour le logement et surveillez la formation de tumeurs.

6. Collecte tumorale et propagation in vivo

1. Suivez l’étape de préparation 2.1.1. Euthanasier les souris par asphyxie au CO₂ en utilisant un débit de 2,0 L / min suivi d’une luxation cervicale après la formation d’une tumeur d’environ 2,0 cm de diamètre (près de 2-3 semaines). Transférez les souris dans une zone de dissection propre, vaporisez de l’éthanol à 70% sur la zone tumorale du flanc de la souris et utilisez des ciseaux de dissection stériles et des pinces pour faire une incision afin de séparer la tumeur.
2. Lavez la tumeur dans un plat de 60 mm avec 5 mL de DPBS et utilisez des ciseaux pour enlever le tissu conjonctif. Coupez un morceau de la tumeur fraîche et enfoncez-le avec 4% de paraformaldéhyde dans du DPBS pendant 48 h et envoyez-le pour l’incorporation et la section de paraffine pour l’analyse histologique.
3. Traiter l’autre moitié de la tumeur fraîche pour la dissociation cellulaire. En bref, hachez la tumeur fraîche en 1 mm³ morceaux pour la dissociation dans un plat de 60 mm avec 5 mL de CCM (-). Ensuite, après avoir suivi les étapes 2.2.4.-2.2.8., injecter les cellules dissociées dans de nouvelles souris C57BL/6J pour un passage in vivo après l’étape 5.3. ou conserver en culture organoïde in vitro conformément aux étapes 3.4.-3.6., ou congeler directement dans de l’azote liquide à l’aide de FBS dépouillé à 90 % de charbon de bois et de 10 % de DMSO avec 10 μM de Y-27632 frais.
4. Si nécessaire, récupérez les cellules congelées en les décongelant rapidement dans un bain-marie à 37 °C et en les lavant avec CCM(-). Après cela, remettez-les en suspension dans 100 μL d’extrait de matrice à 50% dans DPBS pour injection directe dans des souris pour la formation de tumeurs in vivo . Utilisez au moins 2 x 10⁶ cellules décongelées pour une injection in vivo .

Résultats

Le flux de travail des délétions de gènes médiées par l’adénovirus-Cre dans les cellules urothéliales de souris est illustré à la figure 1A. La vidéo d’accompagnement montre comment les cellules urothéliales sont dissociées du fond d’œil de la vessie et comment les cellules triples floxées sont transduites ex vivo avec Ad5CMVCre. La figure 1A a montré que les cellules submucosauses et musculaires minimales étaient dissociées aprè...

Discussion

Les GEMM ont été la référence en matière de modélisation du cancer initiée à partir de cellules normales, permettant de tester rigoureusement les conséquences de perturbations oncogènes potentielles (activation de l’oncogène et / ou perte de suppresseurs de tumeurs). Ici, un protocole rapide et efficace est fourni pour générer des organoïdes du cancer de la vessie via l’édition génique ex vivo de cellules urothéliales normales de souris portant des allèles floxés dans des gènes d’intér...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm sterile cell strainer	Corning	431752
1 mL syringe	BD	309659
25G 1.5 inches needle	EXELINT International	26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)	UI Viral Vector Core	VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J	Jackson Lab	000664
Charcoal-stripped FBS	Gibco	A3382101
Collagenase/hyaluronidase	Stemcell Technologies	07912
Dispase	Stemcell Technologies	07913
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)	Gibco	35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium	Lonza	CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)	Corning	CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20	DAKO	M7019	IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7	Santa Cruz Biotechnology	SC-23876	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63	Abcam	ab735	IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3	Fitzgerald	10R-U103A	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin	Santa Cruz Biotechnology	SC-6260	IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I-s	IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator	Thermo Fisher	51033557
Polyclonal chicken anti-CK5	Biolegend	905901	IF 1:500
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher	12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575	VWR	35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)	Thermo Fisher	HG-4000-012
Surgical blade size 10	Integra Miltex	4-110
Sorvall T1 centrifuge	Thermo Fisher	75002383
Y-27632	Selleckchem	S1049