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要約

このプロトコルは、目的の遺伝子に欠失を保有するマウス尿路上皮オルガノイドの生成および特徴付けのプロセスを記載する。この方法には、マウス尿路上皮細胞の採取、CMVプロモーターによるCre発現を駆動するアデノウイルスによるエキソビボ形質導入、およびインビトロおよびインビボ特性評価が含まれる。

要約

膀胱がんは、特に遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)において、研究が不十分な領域である。組織特異的なCreおよびloxP部位を有する近交系GEMMは、条件付きまたは誘導性遺伝子標的化のゴールドスタンダードとなっています。より迅速で効率的な実験モデルを提供するために、アデノウイルスCreおよび腫瘍抑制因子Trp53、Pten、およびRb1の複数のloxP対立遺伝子を有する正常な尿路上皮細胞を用いたエクスビボオルガノイド培養系が開発されている。正常な尿路上皮細胞は、トリプルフロックスマウスの4つの膀胱から酵素的に切断される(Trp53 f/f:Pten f/f:Rb1 f/f)。尿路上皮細胞は、CMVプロモーター(Ad5CMVCre)によって駆動されるアデノウイルス-Creを用いてエクスビボで形質導入される。形質導入された膀胱オルガノイドは、培養され、増殖され、インビトロおよびインビボで特徴付けられる。PCRは、Trp53、Pten、およびRb1における遺伝子欠失を確認するために使用されます。オルガノイドの免疫蛍光(IF)染色は、尿路上皮系譜マーカー(CK5およびp63)の陽性発現を実証する。オルガノイドは、腫瘍拡大および連続継代のために宿主マウスに皮下注射される。異種移植片の免疫組織化学(IHC)は、CK7、CK5、およびp63の陽性発現およびCK8およびウロプラキン3の陰性発現を示す。要約すると、loxP部位で操作されたマウス尿路上皮細胞からのアデノウイルス媒介遺伝子欠失は、定義された遺伝子改変の腫瘍形成能を迅速に試験するための効率的な方法である。

概要

膀胱がんは男性で4番目に多いがんであり、米国では毎年8万人以上が罹患しています1。プラチナベースの化学療法は、30年以上にわたり進行膀胱がん患者の標準的な治療となってきました。膀胱がん治療の展望は、免疫療法(抗PD-1および抗PD-L1免疫チェックポイント阻害剤)、エルダフィチニブ(線維芽細胞増殖因子受容体阻害剤)、およびエンフォルツマブベドチン(抗体薬物複合体)の最近の食品医薬品局(FDA)の承認によって革命をもたらしました2,3,4。しかし、化学療法または免疫療法に対する応答を予測するために臨床的に承認されたバイオマーカーは利用できない。膀胱がんの進行を駆動するメカニズムの理解を改善し、さまざまな治療モダリティの予測バイオマーカーを開発できる有益な前臨床モデルを生成することが非常に重要です。

膀胱トランスレーショナル研究における大きな障害は、ヒト膀胱癌の病因と治療応答を再現する前臨床モデルの欠如である5,6。インビトロ2Dモデル(細胞株または条件付きリプログラム細胞)、インビトロ3Dモデル(オルガノイド、3Dプリンティング)、インビボモデル(異種移植片、発がん性物質誘導モデル、遺伝子操作モデル、および患者由来異種移植片)を含む複数の前臨床モデルが開発されている2,6。遺伝子操作マウスモデル(GEMM)は、腫瘍表現型の解析、候補遺伝子および/またはシグナル伝達経路の機構的調査、および治療応答の前臨床評価など、膀胱癌生物学における多くの用途に有用である6,7。GEMMは、部位特異的リコンビナーゼ(Cre-loxP)を利用して、1つ以上の腫瘍抑制遺伝子における遺伝子欠失を制御することができる。複数の遺伝子欠失を伴う所望のGEMMを生成するプロセスは、時間がかかり、面倒で、高価である5。この方法の全体的な目標は、トリプルフロックス対立遺伝子(Trp53、Pten、およびRb1)を有する正常マウス尿路上皮細胞から膀胱トリプルノックアウト(TKO)モデルを確立するためのエクスビボCre送達の迅速かつ効率的な方法を開発することである8。エクスビボ法の主な利点は、迅速なワークフロー(マウスの繁殖の年の代わりに1〜2週間)です。この記事では、免疫適格C57 BL/6Jマウスにおいて、フロックス化対立遺伝子、エキソビボアデノウイルス形質導入、オルガノイド培養、およびインビトロおよびインビボ特性評価を有する正常な尿路上皮細胞を採取するためのプロトコルについて説明します。この方法はさらに、フロックス対立遺伝子の任意の組み合わせを保有する免疫適格マウスにおいて臨床的に関連する膀胱癌オルガノイドを生成するために使用することができる。

プロトコル

すべての動物処置は、ニューヨーク州バッファローのロズウェルパーク総合がんセンター(1395M、バイオセーフティ180501および180502)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。
メモ: 手順 1 ~ 3 を同じ日に実行します。

1. マウス膀胱の解剖

  1. 解剖の準備
    1. はさみ、鉗子、滅菌DPBSを含むすべての滅菌器具を35 mm培養皿、70%エタノール、滅菌ガーゼ、清潔なペーパータオルに準備します。解剖領域のすべての表面を清掃します。雄のトリプルフロックスマウスTrp53f/f:Pten f/f:Rb1f/f(4匹のマウス、10週齢)を、グッドリッチ博士の研究室8で以前に説明したように生成する。
  2. 安楽死と切開
    1. 2.0 L/分の流速を用いてCO2 窒息によりマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。解剖領域を70%エタノールで清掃し、清潔なペーパータオルで覆います。
    2. 解剖領域のガーゼの上にマウスを置きます。マウス腹部に70%エタノールを噴霧し、滅菌解剖ハサミを使用して、膀胱を露出させる下正中線腹部切開を行う。
  3. 膀胱の解剖
    1. 鉗子を使用して膀胱をつかみ、両側尿管接合部が特定されるように静かに引き上げます。はさみを使用して、2つの尿管開口部の間の境界線に沿って膀胱眼底を除去します。
    2. 膀胱を2mLのDPBSを含む滅菌皿に移す。脂肪組織および結合組織を除去し、滅菌2mLのDPBSを含む新しい皿に膀胱を入れる。このとき、-80°Cの貯蔵庫からアデノウイルスを取り出し、氷上に保管してください。

2. 尿路上皮細胞の解離

  1. 細胞解離の準備
    1. 鉗子、手術用メス(ハンドル付きサイズ10ブレード)、35 mm培養皿の滅菌DPBS、CCM(-)として定義された木炭剥離FBSを含まない完全な培養液、コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ混合物、トリプシン代替用の組換え酵素、10 μMの新鮮なY-27632を含むDPBS中の10%木炭剥離FBS、100 μmの滅菌セルストレーナー、および15 mLの遠心チューブを含むすべての滅菌器具を準備します。
      注:完全培養培地(CCM)は、提供された成長因子を添加した乳腺上皮細胞増殖培地と、5%の木炭剥離FBS、1%L-グルタミン代替物、100μg/mLプリモシン、および10μMの新鮮なY-27632を含む。
  2. 膀胱を細かく刻んで消化する
    1. バイオセーフティキャビネット内の35mm皿に2mLの滅菌DPBSを移して再度膀胱を洗浄する。
    2. 4匹のマウスから膀胱組織を1mLのCCM(-)を入れた皿に集め、外科用ブレードを使用して各膀胱を4つの等しい部分に細かく刻む。鉗子を使用して膀胱を広げ、尿路皮表面を媒体に露出させます。
    3. 膀胱片および培地を15mL遠沈管に移す。2 mL の CCM(-) 2x でディッシュを洗浄し、遠心分離管に集めて総容量 5 mL にします。
    4. コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ混合物を終濃度300U/mLコラゲナーゼおよび100U/mLヒアルロニダーゼに加え、チューブを37°Cの眼窩インキュベーカーに水平に置き、200rpmで30分間インキュベーターする。
    5. 組織消化後、DPBS中の等量(5mL)の10%木炭剥離FBSをチューブに加え、チューブを200 x g で5分間遠心分離する。
    6. 上清を取り除いて捨てる。2mLのトリプシン代替物を細胞ペレットに加え、よく混合する。チューブを37°Cおよび5%CO2 の細胞インキュベーターに4分間入れる。
    7. インキュベーション後、標準のP1000チップで10倍にピペットを上下させます。DPBSに5mLの10%木炭剥離FBSを加える。
    8. 切断された細胞を100μmの滅菌細胞ストレーナーを通してこすります。細胞懸濁液を収集し、200 x g で5分間遠心分離する。
  3. セルのカウントと再懸濁
    1. 上清を取り除いて捨てる。細胞ペレットを1mLのCCMで再懸濁する。
    2. 血球計数器を用いて細胞数をカウントし、0.5 mLの新鮮なCCMを有する24ウェルプレートのウェルに0.5 x106 個の細胞のみをプレートに入れた。このとき、-20°C保存からエンゲルブレス・ホルム・スウォームマウス肉腫細胞のマトリックス抽出物( 原料表参照)を取り出し、氷上で解凍した。6ウェルプレートを37°Cの細胞インキュベーター内で予め加温する。
      注:残りの細胞は、非ウイルス形質導入制御のために細胞ペレットとして遠心分離および凍結することができる。

3. アデノウイルス形質導入およびメッキオルガノイド

注意:アデノウイルスを処理するときは注意してください。検査室の職員は、バイオセーフティレベル2の実践に従い、アデノウイルスを10%の漂白剤で消毒する必要があります。

  1. 2 μL のアデノウイルス (Ad5CMVCre; 1 x107 PFU/μL) を 24 ウェルプレートに加えます。分離した尿路上皮細胞とよく混ぜる。
  2. 形質導入効率を高めるには、24ウェルプレートを300 x g で室温で30分間遠心分離することにより、スピノキュレーションを行います。24ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2 で1時間細胞インキュベーターに入れた。
  3. 細胞および培地をウェルから15mLチューブに移し、200 x g で5分間遠心分離する。上清を取り出して廃棄し、50μLのCCMを加え、底部の細胞とよく混ぜる。
  4. マトリックス抽出物140μLを加え、気泡を避けるためによく混ぜる。この溶液を50 μL/ドームで予め加温した6ウェルプレートに素早く加え、オルガノイドのドームを作成します。
  5. プレートを5%CO2 で37°Cのインキュベーターに穏やかに移し、ドームを5分間固化させます。6ウェルプレートを逆さまにして、さらに25分間固化を続けます。
  6. インキュベーション後、各ウェルに2.5 mLのCCMを加え、プレートをオルガノイド培養用のインキュベーターに入れます。

4. オルガノイドの培養と継代

  1. 3〜4日ごとに培地を交換してください。Leeら9で報告されているようにオルガノイドの培養、継代、凍結を行う。藤井ら10に記載されているように検体処理ゲルを用いてオルガノイドの包埋を行う。
  2. 培地を除去し、各ウェルに1mLのディスパーゼを加える。ドームを静かに壊し、P1000ピペットチップでよく混ぜます。
  3. プレートを5%CO2 を有する37°Cのインキュベーターに30分間置く。その後、すべての細胞を15mL遠沈管に集め、DPBS中の4mLの10%木炭剥離FBSでウェルを洗浄した。オルガノイド細胞が大きなクラスターとして表示される場合は、手順 2.2.6 を実行します。およびステップ 2.2.7.をクリックして、関連付けが解除されたセルを取得します。
  4. チューブを200 x g で5分間遠心分離する。上清を除去し、1mLのCCMで細胞を洗浄する。
  5. 細胞を70%マトリックス抽出物に再懸濁し、ステップ3.4.〜3.6に従う。培養用。あるいは、90%の木炭ストリップFBSおよび10μMの新鮮なY−27632を添加した10%DMSOに再懸濁することによって細胞を凍結保存する。

5. C57BL/6Jマウス皮下へのオルガノイド細胞移植

  1. 移植の準備
    1. 25G 1.5 インチの針、1 mL シリンジ、1 mg/mL ディスパーゼ、マトリックス抽出物、DPBS 中の 10% 木炭ストリッピング FBS と 10 μM の新鮮な Y-27632、および 15 mL 遠沈管を準備します。
  2. オルガノイド細胞コレクション
    1. 少なくとも5継代のための安定した培養を達成した後、 インビボ 注射のために拡張されたオルガノイド細胞を集める。手順 4.2.-4.4 に従います。細胞を1mLのCCMに再懸濁する。
  3. 細胞の計数と皮下注射
    1. 血球計数器を用いて細胞数をカウントする。200 x g で5分間遠心分離した後、DPBS中の100 μLの50%マトリックス抽出物に2 x106 個の細胞を再懸濁する。懸濁液を氷の上に置き、動物処置室のバイオセーフティキャビネットに入れます。
    2. 2匹の雄C57BL/6Jマウス(10週齢)を4%イソフルランおよび1L/分のO2 流でチャンバー内で約4分間麻酔する。マウスが右反射を失い、呼吸パターンが深くなり、遅くなったら、マウスを2%イソフルランと1 L/分のO2 流量で非再呼吸回路に移します。外傷性傷害から動物の目を保護するために獣医軟膏を適用します。
    3. マウスの右脇腹の注射部位の周りの1つの領域を剃り、70%エタノールを使用してクレンジングした後、25G針を使用して麻酔下で100μLの細胞懸濁液を右脇腹に直接注入する。
    4. 注射後、吸入麻酔を取り外し、マウスをヒートランプの下のケージに入れ、完全に動員するまで置く。マウスを収容のために戻し、腫瘍形成を監視する。

6. 腫瘍採取と 生体内 伝播

  1. 準備ステップ2.1.1に従ってください。2.0 L/分の流速を用いてCO2窒息によりマウスを安楽死させ、続いて直径約2.0cmの腫瘍(ほぼ2〜3週間)が形成された後に子宮頸部転位を行う。マウスを清潔な郭清領域に移し、マウス脇腹腫瘍領域に70%エタノールを噴霧し、滅菌解剖ハサミおよび鉗子を使用して切開を行い、腫瘍を分離する。
  2. 5mLのDPBSで腫瘍を60mm皿に洗い流し、はさみを使用して結合組織を除去する。新鮮な腫瘍の1枚を切断し、DPBS中の4%パラホルムアルデヒドで48時間沈め、組織学分析のためにパラフィンの埋め込みと切片化のために送る。
  3. 細胞解離のために新鮮な腫瘍の残りの半分を処理する。簡単に言えば、新鮮な腫瘍を1 mm3 個に細かく刻み、5 mLのCCM(-)を含む60 mmディッシュで解離させます。次いで、ステップ2.2.4.-2.2.8に従って、切断された細胞を新しいC57BL/6Jマウスに注入し、ステップ5.3に続く in vivo 継代を行う。または、ステップ3.4.〜3.6に従って インビトロ オルガノイド培養として保持するか、または90%木炭剥離FBSおよび10μMの新鮮なY−27632を含む10%DMSOを使用して液体窒素中で直接凍結する。
  4. 必要に応じて、凍結細胞を37°Cの水浴中で急速に解凍し、CCM(-)で洗浄して回収します。この後、DPBS中の50%マトリックス抽出物100 μLに再懸濁し、in vivo腫瘍形成のためにマウスに直接注射する。1回のin vivo注射に少なくとも2 x106の融解細胞を使用する。

結果

マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のワークフローを 図1Aに示す。添付のビデオは、尿路上皮細胞が膀胱の眼底からどのように切り離されるか、および三重フロックス細胞がAd5CMVCreを用いて エクスビボ でどのように形質導入されるかを示す。 図1Aは 、最小限の粘膜下および筋肉細胞が酵素消化後に切断されたこ...

ディスカッション

GEMMは、正常細胞から開始されたがんモデリングのゴールドスタンダードであり、潜在的な発癌性摂動(がん遺伝子の活性化および/または腫瘍抑制因子の喪失)の結果を厳密に試験することを可能にする。ここでは、目的の遺伝子にフロックス化対立遺伝子を担持する正常マウス尿路上皮細胞のエクスビボ遺伝子編集を介して膀胱癌オルガノイドを生成するための迅速かつ効率的なプロト...

開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この研究研究は、NIH Grants、K08CA252161(Q.L.)、R01CA234162、およびR01 CA207757(D.W.G.)、P30CA016056(NCI Cancer Center Core Support Grant)、Roswell Park Alliance Foundation、Friends of Urology Foundationによって部分的に支援されました。原稿の校正をしてくれたMarisa BlaskとMila Pakhomovaに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
100 μm sterile cell strainerCorning431752
1 mL syringeBD309659
25G 1.5 inches needleEXELINT International26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)UI Viral Vector CoreVVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6JJackson Lab000664
Charcoal-stripped FBSGibcoA3382101
Collagenase/hyaluronidaseStemcell Technologies07912
DispaseStemcell Technologies07913
DPBS, 1xCorning21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)Gibco35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth mediumLonzaCC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)CorningCB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20DAKOM7019IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7Santa Cruz BiotechnologySC-23876IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63Abcamab735IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3Fitzgerald10R-U103AIHC 1:50
Monoclonal mouse anti-VimentinSanta Cruz BiotechnologySC-6260IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-I-sIF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubatorThermo Fisher51033557
Polyclonal chicken anti-CK5Biolegend905901IF 1:500
PrimocinInvivoGenant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)Thermo Fisher12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575VWR35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)Thermo FisherHG-4000-012
Surgical blade size 10Integra Miltex4-110
Sorvall T1 centrifugeThermo Fisher75002383
Y-27632SelleckchemS1049

参考文献

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