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Resumo

Este protocolo descreve o processo de geração e caracterização de organoides uroteliais de camundongos que abrigam exclusões em genes de interesse. Os métodos incluem a colheita de células uroteliais de camundongos, transdução ex vivo com expressão de Adenovírus conduzindo Cre com um promotor de CMV, e caracterização in vitro , bem como caracterização in vivo .

Resumo

O câncer de bexiga é uma área pouco estudada, particularmente em modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Gemm inbred com locais cre e loxP específicos de tecido têm sido os padrões de ouro para direcionamento genético condicional ou indutível. Para fornecer modelos experimentais mais rápidos e eficientes, um sistema de cultura organoide ex vivo é desenvolvido usando adenovírus Cre e células uroteliais normais carregando múltiplos alelos loxP dos supressores tumorais Trp53, Pten e Rb1. As células uroteliais normais são enzimáticamente dissociadas de quatro bexigas de camundongos floxados triplos (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). As células urotelial são transduzidas ex vivo com adenovírus-Cre impulsionado por um promotor do CMV (Ad5CMVCre). Os organoides da bexiga transduzidas são cultivados, propagados e caracterizados in vitro e in vivo. O PCR é usado para confirmar exclusões genéticas em Trp53, Pten e Rb1. A coloração de imunofluorescência (IF) de organoides demonstra expressão positiva dos marcadores de linhagem urotelial (CK5 e p63). Os organoides são injetados subcutâneamente em camundongos hospedeiros para expansão tumoral e passagens seriais. A imunohistoquímica (IHC) de xenoenxertos exibe expressão positiva de CK7, CK5 e p63 e expressão negativa de CK8 e Uroplakin 3. Em resumo, a exclusão genética mediada por adenovírus de células uroteliais de camundongos projetadas com locais loxP é um método eficiente para testar rapidamente o potencial tumorigênico de alterações genéticas definidas.

Introdução

O câncer de bexiga é o quarto câncer mais comum em homens e afeta mais de 80.000 pessoas anualmente nos Estados Unidos1. A quimioterapia à base de platina tem sido o padrão de cuidado para pacientes com câncer avançado de bexiga há mais de três décadas. A paisagem do tratamento do câncer de bexiga foi revolucionada pela recente aprovação da Food and Drug Administration (FDA) da imunoterapia (anti-PD-1 e inibidores de ponto de verificação imunológica anti-PD-L1), erdafitinib (um inibidor receptor de fator de crescimento do fibroblasto) e enfortumab vedotin (um conjugado de anticorpos)2,3,4. No entanto, não há biomarcadores clinicamente aprovados para prever as respostas à quimioterapia ou à imunoterapia. Há uma necessidade crítica de gerar modelos pré-clínicos informativos que possam melhorar a compreensão dos mecanismos que impulsionam a progressão do câncer de bexiga e desenvolver biomarcadores preditivos para diferentes modalidades de tratamento.

Um grande obstáculo na pesquisa translacional da bexiga é a falta de modelos preclínicos que recapitulem a patogênese do câncer de bexiga humano e as respostasao tratamento 5,6. Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos, incluindo modelos in vitro 2D (linhas celulares ou células reprogramadas condicionalmente), modelos in vitro 3D (organoides, impressão 3D) e modelos in vivo (xenoenxerto, modelos induzidos pelo carcinogênio, geneticamente modificados e xenot de enxerto derivado do paciente)2,6. Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) são úteis para muitas aplicações na biologia do câncer de bexiga, incluindo análises de fenótipos tumorais, investigações mecanicistas de genes candidatos e/ou caminhos de sinalização, e a avaliação pré-clínica das respostas terapêuticas 6,7. Os GEMMs podem utilizar recombinases específicas do local (Cre-loxP) para controlar exclusões genéticas em um ou mais genes supressores de tumores. O processo de geração de GEMMs desejados com múltiplas exclusões genéticas é demorado, trabalhoso e caro5. O objetivo geral deste método é desenvolver um método rápido e eficiente de entrega ex vivo Cre para estabelecer modelos de nocaute triplo de bexiga (TKO) a partir de células uroteliais normais do rato carregando alelos floxados triplos (Trp53, Pten e Rb1)8. A maior vantagem do método ex vivo é o fluxo de trabalho rápido (1-2 semanas em vez de anos de criação de camundongos). Este artigo descreve o protocolo de colheita de células uroteliais normais com alelos floxados, transdução ex vivo adenovírus, culturas organoides e caracterização in vitro e in vivo em camundongos imunocompetuntes C57 BL/6J. Este método pode ser usado para gerar organoides clinicamente relevantes para o câncer de bexiga em camundongos imunocompetuntes que abrigam qualquer combinação de alelos floxados.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 e 180502).
NOTA: Realize as etapas 1-3 no mesmo dia.

1. Dissecção da bexiga do rato

  1. Preparação para dissecção
    1. Prepare todos os instrumentos estéreis, incluindo tesouras, fórceps, DPBS estéreis em pratos de cultura de 35 mm, 70% de etanol, gaze estéril e toalhas de papel limpas. Limpe todas as superfícies da área de dissecção. Gerar camundongos machos triplos floxed Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 ratos, 10 semanas de idade), como descrito anteriormente no laboratório do Dr. Goodrich 8.
  2. Eutanásia e incisão
    1. Eutanize os camundongos por asfixia de CO2 utilizando uma taxa de fluxo de 2,0 L/min, seguida de luxação cervical. Limpe a área de dissecção com 70% de etanol e cubra com uma toalha de papel limpa.
    2. Coloque o mouse sobre gaze na área de dissecção. Pulverize 70% de etanol no abdômen do rato e use uma tesoura de dissecção estéril para fazer uma incisão abdominal inferior que expondo a bexiga.
  3. Dissecando a bexiga
    1. Use fórceps para agarrar a bexiga e puxar suavemente para cima para que sejam identificadas junções ureterovesical bilaterais. Use uma tesoura para remover o fundo da bexiga seguindo a linha de fronteira entre as duas aberturas de ureter.
    2. Transfira a bexiga para um prato estéril com 2 mL de DPBS. Remova o tecido gorduroso e conjuntivo e coloque a bexiga em um novo prato com estéril 2 mL de DPBS. Neste momento, retire o adenovírus do armazenamento de -80 °C e mantenha-o no gelo.

2. Dissociação de células urotelial

  1. Preparação para dissociação celular
    1. Prepare todos os instrumentos estéreis, incluindo fórceps, bisturis cirúrgicos (uma lâmina tamanho 10 com alça), DPBS estéreis em pratos de cultura de 35 mm, média cultura completa sem FBS descascados por carvão definido como ccm(-), mistura de colagenase/hialuronidase, enzima recombinante para substituto de trippsina, FBS 10% de carvão em DPBS com 10 μM fresco Y-27632, um coador de células estéreis de 100 μm e um tubo de centríse de 15 mL.
      NOTA: O meio de cultura completa (CCM) compreende o meio de crescimento celular epitelial mamário complementado com os fatores de crescimento fornecidos e 5% de FBS descascados por carvão, 1% substituto de L-glutamina, 100 μg/mL primocina e 10 μM fresco Y-27632.
  2. Picar e digerir a bexiga
    1. Transfira e lave a bexiga novamente com 2 mL de DPBS estéreis em um prato de 35 mm em um armário de biossegurança.
    2. Colete tecidos da bexiga de quatro camundongos em um prato com 1 mL de CCM(-) e pique cada bexiga em quatro pedaços iguais usando uma lâmina cirúrgica. Use fórceps para desdobrar a bexiga para expor a superfície do urotélio ao meio.
    3. Transfira as peças da bexiga e o meio em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave o prato com 2 mL de CCM(-) 2x e colete-o em um tubo de centrífuga a um volume total de 5 mL.
    4. Adicione a mistura de colagenase/hialuronidase a uma concentração final de 300 colagenase U/mL e 100 U/mL hyaluronidase e coloque o tubo horizontalmente em um agitador de incubação orbital de 37 °C por 30 min a 200 rpm.
    5. Após a digestão do tecido, adicione um volume igual (5 mL) de FBS descascado de carvão de 10% em DPBS no tubo e centrifugar o tubo a 200 x g por 5 min.
    6. Remova e descarte o supernatante. Adicione 2 mL de trippsina na pelota celular e misture bem. Coloque o tubo em uma incubadora celular a 37 °C e 5% de CO2 por 4 min.
    7. Após a incubação, pipeta para cima e para baixo 10x com uma ponta P1000 padrão. Adicione 5 mL de FBS 10% de carvão em DPBS.
    8. Coe as células dissociadas através de um coador de células estéreis de 100 μm. Colete a suspensão celular e a centrífuga a 200 x g por 5 min.
  3. Contando e reutilizando células
    1. Remova e descarte o supernatante. Resuspende a pelota celular com 1 mL de CCM.
    2. Conte o número de células usando um hemótmetro e apenas placa 0,5 x 106 células em um poço de uma placa de 24 poços com 0,5 mL de CCM fresco. Neste momento, retire os extratos de matriz das células de sarcoma do rato Engelbreth-Holm-Swarm (ver Tabela de Materiais) a partir de -20 °C de armazenamento e descongelar no gelo. Pré-aqueça uma placa de 6 poços em uma incubadora celular de 37 °C.
      NOTA: As células restantes podem ser centrifugadas e congeladas como pelotas celulares para controle de transdução não-vírus.

3. Transdução adenoviral e organoides de revestimento

ATENÇÃO: Tenha cuidado ao processar o adenovírus. O pessoal do laboratório deve seguir as práticas de biossegurança nível 2 e desinfetar o adenovírus com 10% de alvejante.

  1. Adicione 2 μL de adenovírus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) na placa de 24 poços. Misture bem com as células uroteliais desassociadas.
  2. Para melhorar a eficácia da transdução, realize a spinoculação centrifugando a placa de 24 poços a 300 x g por 30 min à temperatura ambiente. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora celular a 37 °C e 5% de CO2 por 1h.
  3. Transfira células e meio do poço para um tubo de 15 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min. Retire e descarte o supernasce, adicione 50 μL de CCM e misture bem com as células na parte inferior.
  4. Adicione 140 μL de extrato de matriz e misture bem suavemente para evitar bolhas de ar. Adicione a solução rapidamente na placa pré-aquecida de 6 poços a 50 μL/cúpula para criar cúpulas para organoides.
  5. Transfira a placa para uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 suavemente e deixe que as cúpulas se solidifiquem por 5 minutos. Vire a placa de 6 poços de cabeça para baixo e continue a solidificação por mais 25 minutos.
  6. Após a incubação, adicione 2,5 mL de CCM a cada poço e coloque a placa em uma incubadora para cultura organoide.

4. Cultivo organoide e passagem

  1. Troque o meio a cada 3-4 dias. Realizar a cultura organoide, a passagem e o congelamento, conforme relatado em Lee et al.9. Realize a incorporação de organoides usando gel de processamento de amostras como descrito em Fujii et al.10.
  2. Retire o meio e adicione 1 mL de desapata a cada poço. Quebre suavemente a cúpula e misture bem com uma ponta de pipeta P1000.
  3. Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 por 30 min. Em seguida, colete todas as células em um tubo centrífuga de 15 mL e lave o poço com 4 mL de FBS 10% de carvão em DPBS. Se as células organoides aparecerem como grandes aglomerados, realize o Passo 2.2.6. e Passo 2.2.7. para obter células dissociadas.
  4. Centrifugar o tubo a 200 x g por 5 min. Remova o supernatante e lave as células com 1 mL de CCM.
  5. Resuspensar as células em extrato matricial de 70% e seguir as Etapas 3.4.-3.6. para a cultura. Alternativamente, criopreserve as células ressundo em 90% de FBS descascados a carvão e 10% DMSO suplementado com 10 μM fresco Y-27632.

5. Implantação de células organoides em camundongos C57BL/6J subcutâneamente

  1. Preparação para implantação
    1. Prepare 25G 1,5 em agulhas, uma seringa de 1 mL, 1 mg/mL despasma, extrato de matriz, FBS 10% de carvão em DPBS com 10 μM fresco Y-27632, e um tubo de centrífuga de 15 mL.
  2. Coleta de células organoides
    1. Após atingir uma cultura estável por pelo menos 5 passagens, colete as células organoides expandidas para injeção in vivo . Siga os passos 4.2.-4.4. e células resuspendas em 1 mL de CCM.
  3. Contando células e injeção subcutânea
    1. Conte o número de células usando um hemócito. Após centrifugação a 200 x g por 5 min, resuspend 2 x 106 células em 100 μL de extrato de matriz de 50% em DPBS. Coloque a suspensão no gelo e leve-a para um armário de biossegurança em uma sala de procedimento animal.
    2. Anestesiar dois camundongos C57BL/6J masculinos (10 semanas de idade) com isoflurane de 4% e 1 L/min O2 por aproximadamente 4 minutos em uma câmara. Uma vez que os ratos perderam seu reflexo de retardo e seu padrão de respiração se tornou mais profundo e lento, transfira os ratos para um circuito não-rebreathing com 2% de isoflurane e 1 L/min O2 fluxo. Aplique pomada veterinária para proteger os olhos dos animais de lesões traumáticas.
    3. Raspe uma área ao redor do local de injeção no flanco direito do mouse e use 70% de etanol para limpar, e então use uma agulha de 25 G para injetar diretamente a suspensão de células de 100 μL no flanco direito sob anestesia.
    4. Após a injeção, remova a anestesia inalatória e coloque os ratos em uma gaiola sob uma lâmpada de calor até que se recupere e se mobilize totalmente. Devolva os camundongos para habitação e monitore a formação de tumores.

6. Coleta de tumores e propagação in vivo

  1. Acompanhe a preparação Passo 2.1.1. Eutanize camundongos por asfixia de CO2 usando uma taxa de fluxo de 2,0 L/min seguida de luxação cervical após um tumor de ~2,0 cm de diâmetro (quase 2-3 semanas) é formado. Transfira os camundongos para uma área de dissecção limpa, pulverize 70% de etanol na área do tumor flanco do rato e use uma tesoura de dissecção estéril e fórceps para fazer uma incisão para separar o tumor.
  2. Lave o tumor em uma folha de 60 mm com 5 mL de DPBS e use uma tesoura para remover o tecido conjuntivo. Corte um pedaço do tumor fresco e afunde-o com 4% de paraformaldeído em DPBS por 48 h e envie para parafina incorporação e secção para análise histologia.
  3. Processe a outra metade do tumor fresco para dissociação celular. Resumidamente, pique o tumor fresco em 1 mm3 peças para dissociação em um prato de 60 mm com 5 mL de CCM(-). Em seguida, depois de seguir as etapas 2.2.4.-2.2.8., injete as células desassociadas em novos camundongos C57BL/6J para a passagem in vivo após o Passo 5.3. ou manter-se como cultura organoide in vitro seguindo as etapas 3.4.-3.6., ou congelar diretamente em nitrogênio líquido usando 90% de FBS descascados por carvão e 10% DMSO com 10 μM fresco Y-27632.
  4. Se necessário, recupere as células congeladas descongelando-as rapidamente em um banho de água de 37 °C e lavando com CCM(-). Depois disso, resuspensá-los em 100 μL de extrato matricial de 50% em DPBS para injeção direta em camundongos para formação de tumor in vivo . Use pelo menos 2 x 106 células descongeladas para uma injeção in vivo .

Resultados

O fluxo de trabalho de deleções genéticas mediadas por adenovírus-Cre em células urteliais do camundongo é mostrado na Figura 1A. O vídeo que acompanha demonstra como as células uroteliais são dissociadas do fundus da bexiga e como as células floxadas triplas são transduzidas ex vivo com Ad5CMVCre. A Figura 1A mostrou que as células mínimas de submucosa e muscular foram dissociadas após a digestão enzimática. Para confirmar a eficiência...

Discussão

Gemms têm sido os padrões de ouro para a modelagem do câncer iniciada a partir de células normais, permitindo que as consequências de potenciais perturbações oncogênicas (ativação oncogênica e/ou perda de supressores tumorais) sejam testadas rigorosamente. Aqui, um protocolo rápido e eficiente é fornecido para gerar organoides de câncer de bexiga através da edição de genes ex vivo de células uroteliais normais do camundongo carregando alelos floxados em genes de interesse. As manchas de H&E e I...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho de pesquisa foi apoiado em parte por NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 e R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), a Roswell Park Alliance Foundation e a Friends of Urology Foundation. Agradecemos a Marisa Blask e Mila Pakhomova pela revisão do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 μm sterile cell strainerCorning431752
1 mL syringeBD309659
25G 1.5 inches needleEXELINT International26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)UI Viral Vector CoreVVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6JJackson Lab000664
Charcoal-stripped FBSGibcoA3382101
Collagenase/hyaluronidaseStemcell Technologies07912
DispaseStemcell Technologies07913
DPBS, 1xCorning21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)Gibco35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth mediumLonzaCC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)CorningCB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20DAKOM7019IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7Santa Cruz BiotechnologySC-23876IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63Abcamab735IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3Fitzgerald10R-U103AIHC 1:50
Monoclonal mouse anti-VimentinSanta Cruz BiotechnologySC-6260IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-I-sIF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubatorThermo Fisher51033557
Polyclonal chicken anti-CK5Biolegend905901IF 1:500
PrimocinInvivoGenant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)Thermo Fisher12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575VWR35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)Thermo FisherHG-4000-012
Surgical blade size 10Integra Miltex4-110
Sorvall T1 centrifugeThermo Fisher75002383
Y-27632SelleckchemS1049

Referências

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