Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo

Riepilogo

Questo protocollo descrive il processo di generazione e caratterizzazione di organoidi uroteliali di topo che ospitano delezioni in geni di interesse. I metodi includono la raccolta di cellule uroteliali di topo, la trasduzione ex vivo con adenovirus che guida l'espressione di Cre con un promotore CMV e la caratterizzazione in vitro e in vivo .

Abstract

Il cancro della vescica è un'area poco studiata, in particolare nei modelli murini geneticamente modificati (GEMM). I GEMM inbred con siti Cre e loxP specifici per i tessuti sono stati i gold standard per il targeting genico condizionale o inducibile. Per fornire modelli sperimentali più rapidi ed efficienti, viene sviluppato un sistema di coltura organoide ex vivo utilizzando adenovirus Cre e cellule uroteliali normali che trasportano più alleli loxP dei soppressori tumorali Trp53, Pten e Rb1. Le cellule uroteliali normali sono enzimaticamente dissociate da quattro vesciche di topi a triplo flosso (Trp53^f/f: Pten^f/f: Rb1^f/f). Le cellule uroteliali sono trasdotte ex vivo con adenovirus-Cre guidato da un promotore CMV (Ad5CMVCre). Gli organoidi vescicali trasdotti vengono coltivati, propagati e caratterizzati in vitro e in vivo. La PCR viene utilizzata per confermare le delezioni geniche in Trp53, Pten e Rb1. La colorazione a immunofluorescenza (IF) degli organoidi dimostra un'espressione positiva dei marcatori di lignaggio uroteliale (CK5 e p63). Gli organoidi vengono iniettati per via sottocutanea nei topi ospiti per l'espansione del tumore e i passaggi seriali. L'immunoistochimica (IHC) degli xenotrapianti mostra un'espressione positiva di CK7, CK5 e p63 e un'espressione negativa di CK8 e Uroplakin 3. In sintesi, la delezione genica mediata da adenovirus da cellule uroteliali di topo ingegnerizzate con siti loxP è un metodo efficace per testare rapidamente il potenziale tumorigenico di alterazioni genetiche definite.

Introduzione

Il cancro della vescica è il quarto tumore più comune negli uomini e colpisce più di 80.000 persone ogni anno negli Stati Uniti¹. La chemioterapia a base di platino è stata lo standard di cura per i pazienti con carcinoma della vescica avanzato per più di tre decenni. Il panorama del trattamento del cancro alla vescica è stato rivoluzionato dalla recente approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) dell'immunoterapia (inibitori del checkpoint immunitario anti-PD-1 e anti-PD-L1), erdafitinib (un inibitore del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti) e enfortumab vedotin (un coniugato anticorpo-farmaco)^2,3,4. Tuttavia, non sono disponibili biomarcatori clinicamente approvati per prevedere le risposte alla chemioterapia o all'immunoterapia. C'è un bisogno critico di generare modelli preclinici informativi che possano migliorare la comprensione dei meccanismi che guidano la progressione del cancro alla vescica e sviluppare biomarcatori predittivi per diverse modalità di trattamento.

Uno dei principali ostacoli nella ricerca traslazionale della vescica è la mancanza di modelli preclinici che ricapitolano la patogenesi del cancro della vescica umana e le risposte al trattamento ^5,6. Sono stati sviluppati più modelli preclinici, tra cui modelli 2D in vitro (linee cellulari o cellule riprogrammate condizionatamente), modelli 3D in vitro (organoidi, stampa 3D) e modelli in vivo (xenotrapianto, modelli indotti da agenti cancerogeni, geneticamente modificati e xenotrapianti derivati dal paziente)^2,6. I modelli murini geneticamente modificati (GEMM) sono utili per molte applicazioni nella biologia del cancro della vescica, tra cui analisi dei fenotipi tumorali, indagini meccanicistiche di geni candidati e /o vie di segnalazione e la valutazione preclinica delle risposte terapeutiche ^6,7. I GEMM possono utilizzare ricombinasi sito-specifiche (Cre-loxP) per controllare le delezioni genetiche in uno o più geni oncosoppressori. Il processo di generazione dei GEMM desiderati con delezioni geniche multiple è dispendioso in termini di tempo, laborioso e costoso⁵. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare un metodo rapido ed efficiente di consegna cre ex vivo per stabilire modelli di triplo knockout (TKO) della vescica da cellule uroteliali di topo normali portatrici di alleli a triplo flosso (Trp53, Pten e Rb1)⁸. Il principale vantaggio del metodo ex vivo è il flusso di lavoro veloce (1-2 settimane invece di anni di allevamento di topi). Questo articolo descrive il protocollo per la raccolta di cellule uroteliali normali con alleli floxed, trasduzione di adenovirus ex vivo, colture organoidi e caratterizzazione in vitro e in vivo in topi immunocompetenti C57 BL/6J. Questo metodo può essere ulteriormente utilizzato per generare organoidi clinicamente rilevanti per il cancro della vescica in topi immunocompetenti che ospitano qualsiasi combinazione di alleli floxed.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 e 180502).
NOTA: eseguire i passaggi da 1 a 3 nello stesso giorno.

1. Dissezione della vescica del topo

1. Preparazione per la dissezione
   1. Preparare tutti gli strumenti sterili tra cui forbici, pinze, DPBS sterili in piatti di coltura da 35 mm, etanolo al 70%, garza sterile e asciugamani di carta pulita. Pulire tutte le superfici dell'area di dissezione. Generare topi maschi a triplo floxed Trp53^{f / f}: Pten^{f / f}: Rb1^{f / f} (4 topi, 10 settimane di età), come precedentemente descritto nel laboratorio del Dr. Goodrich ⁸.
2. Eutanasia e incisione
   1. Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO₂ utilizzando una portata di 2,0 L/min, seguita da lussazione cervicale. Pulire l'area di dissezione con etanolo al 70% e coprire con un tovagliolo di carta pulito.
   2. Posizionare il mouse su una garza nell'area di dissezione. Spruzzare il 70% di etanolo sull'addome del topo e utilizzare forbici di dissezione sterili per fare un'incisione addominale della linea mediana inferiore esponendo la vescica.
3. Sezionare la vescica
   1. Utilizzare una pinza per afferrare la vescica e tirare delicatamente verso l'alto in modo che vengano identificate le giunzioni ureterovesiche bilaterali. Utilizzare le forbici per rimuovere il fondo della vescica seguendo la linea di confine tra le due aperture dell'uretere.
   2. Trasferire la vescica in un piatto sterile con 2 ml di DPBS. Rimuovere il tessuto adiposo e connettivo e mettere la vescica in un nuovo piatto con 2 ml sterili di DPBS. In questo momento, togliere l'adenovirus dallo stoccaggio di -80 °C e tenerlo sul ghiaccio.

2. Dissociazione delle cellule uroteliali

1. Preparazione per la dissociazione cellulare
   1. Preparare tutti gli strumenti sterili, tra cui pinze, bisturi chirurgici (una lama di taglia 10 con manico), DPBS sterile in piatti di coltura da 35 mm, terreno di coltura completo senza FBS spogliato di carbone definito come CCM(-), miscela di collagenasi/ialuronidasi, enzima ricombinante per sostituto della tripsina, FBS spogliato di carbone al 10% in DPBS con 10 μM di Y-27632 fresco, un filtro a cellule sterili da 100 μm e un tubo centrifugo da 15 mL.
      NOTA: Il terreno di coltura completo (CCM) comprende il mezzo di crescita delle cellule epiteliali mammarie integrato con i fattori di crescita forniti e il 5% di FBS privo di carbone, l'1% di sostituto della L-glutammina, 100 μg / mL di primocina e 10 μM di Y-27632 fresco.
2. Tritare e digerire la vescica
   1. Trasferire e lavare nuovamente la vescica con 2 ml di DPBS sterile in un piatto da 35 mm in un armadio di biosicurezza.
   2. Raccogliere i tessuti della vescica da quattro topi in un piatto con 1 ml di CCM (-) e tritare ogni vescica in quattro pezzi uguali usando una lama chirurgica. Utilizzare una pinza per aprire la vescica per esporre la superficie dell'urotelio al mezzo.
   3. Trasferire i pezzi della vescica e il mezzo in un tubo di centrifuga da 15 ml. Lavare il piatto con 2 ml di CCM(-) 2x e raccoglierlo in un tubo centrifugo per un volume totale di 5 ml.
   4. Aggiungere la miscela di collagenasi/ialuronidasi ad una concentrazione finale di 300 U/mL collagenasi e 100 U/mL di ialuronidasi e posizionare il tubo orizzontalmente in uno shaker orbitale di incubazione a 37 °C per 30 minuti a 200 giri/min.
   5. Dopo la digestione dei tessuti, aggiungere un volume uguale (5 ml) di FBS al 10% di carbone in DPBS nel tubo e centrifugare il tubo a 200 x g per 5 minuti.
   6. Rimuovere ed eliminare il surnatante. Aggiungere 2 ml di sostituto della tripsina nel pellet cellulare e mescolare bene. Mettere il tubo in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% CO₂ per 4 min.
   7. Dopo l'incubazione, pipetta su e giù 10x con una punta P1000 standard. Aggiungere 5 ml di FBS al 10% di carbone di legna in DPBS.
   8. Filtrare le cellule dissociate attraverso un filtro a cellule sterili da 100 μm. Raccogliere la sospensione cellulare e la centrifuga a 200 x g per 5 min.
3. Conteggio e riuso delle celle
   1. Rimuovere ed eliminare il surnatante. Risospendare il pellet cellulare con 1 mL di CCM.
   2. Contare il numero di cellule usando un emocitometro e solo piastra 0,5 x 10⁶ cellule in un pozzo di una piastra a 24 pozzetti con 0,5 ml di CCM fresco. In questo momento, estrarre gli estratti di matrice delle cellule di sarcoma del topo Engelbreth-Holm-Swarm (vedi Tabella dei materiali) da -20 °C di stoccaggio e scongelamento sul ghiaccio. Preriscaldare una piastra a 6 pozzetti in un incubatore cellulare a 37 °C.
      NOTA: Le cellule rimanenti possono essere centrifugate e congelate come pellet cellulari per il controllo della trasduzione non virale.

3. Organoidi di trasduzione e placcatura adenovirale

ATTENZIONE: Si prega di essere cauti durante l'elaborazione dell'adenovirus. Il personale di laboratorio deve seguire le pratiche di livello di biosicurezza 2 e disinfettare l'adenovirus con il 10% di candeggina.

1. Aggiungere 2 μL di adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 10⁷ PFU/μL) nella piastra a 24 pozzetti. Mescolare bene con le cellule uroteliali dissociate.
2. Per migliorare l'efficacia della trasduzione, eseguire la spinoculazione centrifugando la piastra a 24 pozzetti a 300 x g per 30 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore cellulare a 37 °C e al 5% di CO₂ per 1 ora.
3. Trasferire le cellule e il mezzo dal pozzo in un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti. Rimuovere e scartare il surnatante, aggiungere 50 μL di CCM e mescolare bene con le cellule sul fondo.
4. Aggiungere 140 μL di estratto di matrice e mescolare delicatamente bene per evitare bolle d'aria. Aggiungere rapidamente la soluzione nella piastra a 6 pozzetti preriscaldata a 50 μL/cupola per creare cupole per organoidi.
5. Trasferire delicatamente la piastra in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ e lasciare solidificare le cupole per 5 minuti. Capovolgere la piastra a 6 pozzetti e continuare la solidificazione per altri 25 minuti.
6. Dopo l'incubazione, aggiungere 2,5 ml di CCM a ciascun pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore per la coltura organoide.

4. Coltivazione e passamento di organoidi

1. Cambia il mezzo ogni 3-4 giorni. Eseguire la coltivazione di organoidi, il passaggio e il congelamento come riportato in Lee et ^al.9. Eseguire l'incorporamento di organoidi utilizzando il gel di lavorazione del campione come descritto in Fujii et ^al.10.
2. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di dispase a ciascun pozzetto. Rompere delicatamente la cupola e mescolare bene con una punta della pipetta P1000.
3. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per 30 minuti. Quindi, raccogliere tutte le cellule in un tubo centrifugo da 15 ml e lavare il pozzo con 4 mL di FBS al 10% di carbone in DPBS. Se le cellule organoidi appaiono come cluster di grandi dimensioni, eseguire il passaggio 2.2.6. e passo 2.2.7. per ottenere cellule dissociate.
4. Centrifugare il tubo a 200 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule con 1 mL di CCM.
5. Risospesci le cellule in estratto di matrice al 70% e segui i passaggi 3.4.-3.6. per la coltivazione. In alternativa, crioconservare le cellule riesuscendole nel 90% di FBS spogliato di carbone e nel 10% di DMSO integrato con 10 μM di Y-27632 fresco.

5. Impianto di cellule organoidi in topi C57BL/6J per via sottocutanea

1. Preparazione per l'impianto
   1. Preparare 25G 1,5 in aghi, una siringa da 1 mL, 1 mg/mL dispasi, estratto di matrice, FBS al 10% a carbone in DPBS con 10 μM di Y-27632 fresco e un tubo centrifugo da 15 mL.
2. Raccolta di cellule organoidi
   1. Dopo aver ottenuto una coltura stabile per almeno 5 passaggi, raccogliere le cellule organoidi espanse per l'iniezione in vivo . Seguire i passaggi 4.2.-4.4. e risospese le cellule in 1 mL di CCM.
3. Conteggio delle cellule e iniezione sottocutanea
   1. Contare il numero di cellule usando un emocitometro. Dopo centrifugazione a 200 x g per 5 min, risospesare 2 x 10⁶ celle in 100 μL di estratto di matrice al 50% in DPBS. Posizionare la sospensione sul ghiaccio e portarla in un armadietto di biosicurezza in una sala procedure per animali.
   2. Anestetizzare due topi maschi C57BL/6J (10 settimane) con il 4% di isoflurano e 1 L/min di flusso di O₂ per circa 4 minuti in una camera. Una volta che i topi hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento e il loro modello di respirazione è diventato più profondo e più lento, trasferire i topi in un circuito non rispirante con il 2% di isoflurano e 1 L / min di flusso O₂ . Applicare un unguento veterinario per proteggere gli occhi degli animali da lesioni traumatiche.
   3. Radere un'area intorno al sito di iniezione sul fianco destro del topo e utilizzare il 70% di etanolo per pulire, quindi utilizzare un ago da 25 G per iniettare direttamente la sospensione cellulare da 100 μL nel fianco destro in anestesia.
   4. Dopo l'iniezione, rimuovere l'anestesia inalatoria e mettere i topi in una gabbia sotto una lampada di calore fino a quando non vengono recuperati e mobilitati completamente. Restituire i topi per l'alloggiamento e monitorare la formazione del tumore.

6. Raccolta del tumore e propagazione in vivo

1. Seguire la fase di preparazione 2.1.1. Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO₂ utilizzando una portata di 2,0 L / min seguita da lussazione cervicale dopo la formazione di un tumore di ~ 2,0 cm di diametro (quasi 2-3 settimane). Trasferire i topi in un'area di dissezione pulita, spruzzare il 70% di etanolo sull'area del tumore del fianco del topo e utilizzare forbici e pinze di dissezione sterili per fare un'incisione per separare il tumore.
2. Lavare il tumore in un piatto da 60 mm con 5 ml di DPBS e utilizzare le forbici per rimuovere il tessuto connettivo. Tagliare un pezzo del tumore fresco e affondarlo con il 4% di paraformaldeide in DPBS per 48 ore e inviare per l'incorporamento e il sezionamento della paraffina per l'analisi istologica.
3. Elaborare l'altra metà del tumore fresco per la dissociazione cellulare. In breve, tritare il tumore fresco in 1 mm³ pezzi per la dissociazione in un piatto da 60 mm con 5 ml di CCM (-). Quindi, dopo aver seguito i passaggi 2.2.4.-2.2.8., iniettare le cellule dissociate in nuovi topi C57BL / 6J per il passaggio in vivo dopo il passaggio 5.3. o conservare come coltura organoide in vitro seguendo le fasi 3.4.-3.6., o congelare direttamente in azoto liquido utilizzando il 90% di FBS a carbone e il 10% di DMSO con 10 μM di Y-27632 fresco.
4. Se necessario, recuperare le cellule congelate scongelandole rapidamente a bagnomaria a 37 °C e lavandole con CCM(-). Dopo questo, risospenderli in 100 μL di estratto di matrice al 50% in DPBS per iniezione diretta nei topi per la formazione di tumori in vivo . Utilizzare almeno 2 x 10⁶ cellule scongelate per un'iniezione in vivo .

Risultati

Il flusso di lavoro delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre nelle cellule uroteliali di topo è mostrato nella Figura 1A. Il video di accompagnamento mostra come le cellule uroteliali sono dissociate dal fondo della vescica e come le cellule a triplo floscio vengono trasdotte ex vivo con Ad5CMVCre. La Figura 1A ha mostrato che la sottomucosa minima e le cellule muscolari sono state dissociate dopo la digestione enzimatica. Per confermare l'eff...

Discussione

I GEMM sono stati i gold standard per la modellazione del cancro avviata da cellule normali, consentendo di testare rigorosamente le conseguenze di potenziali perturbazioni oncogeniche (attivazione di oncogeni e / o perdita di soppressori tumorali). Qui, viene fornito un protocollo rapido ed efficiente per generare organoidi del cancro della vescica tramite editing genetico ex vivo di normali cellule uroteliali di topo che trasportano alleli flosci in geni di interesse. La colorazione H&E e IHC dimostra che gli ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm sterile cell strainer	Corning	431752
1 mL syringe	BD	309659
25G 1.5 inches needle	EXELINT International	26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)	UI Viral Vector Core	VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J	Jackson Lab	000664
Charcoal-stripped FBS	Gibco	A3382101
Collagenase/hyaluronidase	Stemcell Technologies	07912
Dispase	Stemcell Technologies	07913
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)	Gibco	35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium	Lonza	CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)	Corning	CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20	DAKO	M7019	IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7	Santa Cruz Biotechnology	SC-23876	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63	Abcam	ab735	IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3	Fitzgerald	10R-U103A	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin	Santa Cruz Biotechnology	SC-6260	IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I-s	IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator	Thermo Fisher	51033557
Polyclonal chicken anti-CK5	Biolegend	905901	IF 1:500
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher	12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575	VWR	35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)	Thermo Fisher	HG-4000-012
Surgical blade size 10	Integra Miltex	4-110
Sorvall Legend RT	Thermo Fisher	75004377
Sorvall T1 centrifuge	Thermo Fisher	75002383
Y-27632	Selleckchem	S1049