Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Özet

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Özet

Mesane kanseri, özellikle genetiği değiştirilmiş fare modellerinde (GEMM'ler) az çalışılmış bir alandır. Dokuya özgü Cre ve loxP bölgelerine sahip inbred GEMM'ler, koşullu veya indüklenebilir gen hedeflemesi için altın standartlar olmuştur. Daha hızlı ve daha verimli deneysel modeller sağlamak için, adenovirüs Cre ve tümör baskılayıcıları Trp53, Pten ve Rb1'in çoklu loxP alellerini taşıyan normal ürotelyal hücreler kullanılarak bir ex vivo organoid kültür sistemi geliştirilmiştir. Normal ürotelyal hücreler, üçlü flokslu farelerin dört mesanesinden enzimatik olarak ayrılır (Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f ^{/ f}). Ürotelyal hücreler, bir CMV promotörü (Ad5CMVCre) tarafından tahrik edilen adenovirüs-Cre ile ex vivo olarak dönüştürülür. Transdüke mesane organoidleri kültürlenir, yayılır ve in vitro ve in vivo olarak karakterize edilir. PCR, Trp53, Pten ve Rb1'deki gen delesyonlarını doğrulamak için kullanılır. Organoidlerin immünofloresan (IF) boyanması, ürotelyal soy belirteçlerinin (CK5 ve p63) pozitif ekspresyonunu gösterir. Organoidler, tümör genişlemesi ve seri pasajlar için konakçı farelere deri altından enjekte edilir. Ksenogreftlerin immünohistokimyası (IHC), CK7, CK5 ve p63'ün pozitif ekspresyonunu ve CK8 ve Uroplakin 3'ün negatif ekspresyonunu sergiler. Özetle, loxP bölgeleri ile tasarlanmış fare ürotelyal hücrelerinden adenovirüs aracılı gen delesyonu, tanımlanmış genetik değişikliklerin tümörojenik potansiyelini hızlı bir şekilde test etmek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Mesane kanseri erkeklerde dördüncü en sık görülen kanserdir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 80.000'den fazla insanı etkilemektedir¹. Platin bazlı kemoterapi, otuz yıldan fazla bir süredir ilerlemiş mesane kanseri olan hastalar için standart bakım olmuştur. Mesane kanseri tedavisinin manzarası, immünoterapi (anti-PD-1 ve anti-PD-L1 immün kontrol noktası inhibitörleri), erdafitinib (bir fibroblast büyüme faktörü reseptör inhibitörü) ve enfortumab vedotin (bir antikor-ilaç konjugat) ^2,3,4'ün son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onayı ile devrim yaratmı....

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, NY'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (1395M, Biyogüvenlik 180501 ve 180502).
NOT: Adım 1-3'ü aynı gün gerçekleştirin.

1. Fare mesanesinin diseksiyonu

1. Diseksiyon için hazırlık
   1. Makas, forseps, steril DPBS dahil olmak üzere tüm steril aletleri 35 mm kültür tabaklarda, %70 etanol, steril gazlı bez ve temiz kağıt havlularda hazırlayın. Diseksiyon alanının tüm yüzeylerini temizleyin. Erkek üçlü flokslu fareler üretin Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f ^{/ f}

Sonuçlar

Fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonlarının iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Eşlik eden video, ürotelyal hücrelerin mesanenin fundusundan nasıl ayrıldığını ve üçlü floksed hücrelerin Ad5CMVCre ile ex vivo olarak nasıl dönüştürüldüğünü göstermektedir. Şekil 1A , minimal submukoza ve kas hücrelerinin enzim sindiriminden sonra ilişkisinin kesildiğini göstermiştir. Adenovirüs-Cre da.......

Tartışmalar

GEMM'ler, normal hücrelerden başlatılan kanser modellemesi için altın standartlar olmuştur ve potansiyel onkojenik pertürbasyonların (onkogen aktivasyonu ve / veya tümör baskılayıcıların kaybı) sonuçlarının titizlikle test edilmesini sağlar. Burada, ilgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidlerinin üretilmesi için hızlı ve etkili bir protokol sağlanmaktadır. H&E ve IHC boyaması, TKO organoi.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm sterile cell strainer	Corning	431752
1 mL syringe	BD	309659
25G 1.5 inches needle	EXELINT International	26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)	UI Viral Vector Core	VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J	Jackson Lab	000664
Charcoal-stripped FBS	Gibco	A3382101
Collagenase/hyaluronidase	Stemcell Technologies	07912
Dispase	Stemcell Technologies	07913
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)	Gibco	35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium	Lonza	CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)	Corning	CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20	DAKO	M7019	IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7	Santa Cruz Biotechnology	SC-23876	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63	Abcam	ab735	IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3	Fitzgerald	10R-U103A	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin	Santa Cruz Biotechnology	SC-6260	IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I-s	IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator	Thermo Fisher	51033557
Polyclonal chicken anti-CK5	Biolegend	905901	IF 1:500
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher	12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575	VWR	35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)	Thermo Fisher	HG-4000-012
Surgical blade size 10	Integra Miltex	4-110
Sorvall T1 centrifuge	Thermo Fisher	75002383
Y-27632	Selleckchem	S1049