Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.
Mesane kanseri, özellikle genetiği değiştirilmiş fare modellerinde (GEMM'ler) az çalışılmış bir alandır. Dokuya özgü Cre ve loxP bölgelerine sahip inbred GEMM'ler, koşullu veya indüklenebilir gen hedeflemesi için altın standartlar olmuştur. Daha hızlı ve daha verimli deneysel modeller sağlamak için, adenovirüs Cre ve tümör baskılayıcıları Trp53, Pten ve Rb1'in çoklu loxP alellerini taşıyan normal ürotelyal hücreler kullanılarak bir ex vivo organoid kültür sistemi geliştirilmiştir. Normal ürotelyal hücreler, üçlü flokslu farelerin dört mesanesinden enzimatik olarak ayrılır (Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f / f). Ürotelyal hücreler, bir CMV promotörü (Ad5CMVCre) tarafından tahrik edilen adenovirüs-Cre ile ex vivo olarak dönüştürülür. Transdüke mesane organoidleri kültürlenir, yayılır ve in vitro ve in vivo olarak karakterize edilir. PCR, Trp53, Pten ve Rb1'deki gen delesyonlarını doğrulamak için kullanılır. Organoidlerin immünofloresan (IF) boyanması, ürotelyal soy belirteçlerinin (CK5 ve p63) pozitif ekspresyonunu gösterir. Organoidler, tümör genişlemesi ve seri pasajlar için konakçı farelere deri altından enjekte edilir. Ksenogreftlerin immünohistokimyası (IHC), CK7, CK5 ve p63'ün pozitif ekspresyonunu ve CK8 ve Uroplakin 3'ün negatif ekspresyonunu sergiler. Özetle, loxP bölgeleri ile tasarlanmış fare ürotelyal hücrelerinden adenovirüs aracılı gen delesyonu, tanımlanmış genetik değişikliklerin tümörojenik potansiyelini hızlı bir şekilde test etmek için etkili bir yöntemdir.
Mesane kanseri erkeklerde dördüncü en sık görülen kanserdir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 80.000'den fazla insanı etkilemektedir1. Platin bazlı kemoterapi, otuz yıldan fazla bir süredir ilerlemiş mesane kanseri olan hastalar için standart bakım olmuştur. Mesane kanseri tedavisinin manzarası, immünoterapi (anti-PD-1 ve anti-PD-L1 immün kontrol noktası inhibitörleri), erdafitinib (bir fibroblast büyüme faktörü reseptör inhibitörü) ve enfortumab vedotin (bir antikor-ilaç konjugat) 2,3,4'ün son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onayı ile devrim yaratmı....
Tüm hayvan prosedürleri, Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, NY'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (1395M, Biyogüvenlik 180501 ve 180502).
NOT: Adım 1-3'ü aynı gün gerçekleştirin.
1. Fare mesanesinin diseksiyonu
Fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonlarının iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Eşlik eden video, ürotelyal hücrelerin mesanenin fundusundan nasıl ayrıldığını ve üçlü floksed hücrelerin Ad5CMVCre ile ex vivo olarak nasıl dönüştürüldüğünü göstermektedir. Şekil 1A , minimal submukoza ve kas hücrelerinin enzim sindiriminden sonra ilişkisinin kesildiğini göstermiştir. Adenovirüs-Cre da.......
GEMM'ler, normal hücrelerden başlatılan kanser modellemesi için altın standartlar olmuştur ve potansiyel onkojenik pertürbasyonların (onkogen aktivasyonu ve / veya tümör baskılayıcıların kaybı) sonuçlarının titizlikle test edilmesini sağlar. Burada, ilgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidlerinin üretilmesi için hızlı ve etkili bir protokol sağlanmaktadır. H&E ve IHC boyaması, TKO organoi.......
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Bu araştırma çalışması kısmen NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ve R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibesi), Roswell Park Alliance Vakfı ve Üroloji Dostları Vakfı tarafından desteklenmiştir. Marisa Blask ve Mila Pakhomova'ya makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
1 mL syringe | BD | 309659 | |
25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiDaha Fazla Makale Keşfet
This article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır