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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.

Zusammenfassung

Blasenkrebs ist ein wenig untersuchter Bereich, insbesondere in gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs). Inzucht-GEMMs mit gewebespezifischen Cre- und loxP-Stellen waren die Goldstandards für bedingtes oder induzierbares Gen-Targeting. Um schnellere und effizientere experimentelle Modelle zu liefern, wird ein Ex-vivo-Organoid-Kultursystem entwickelt, das das Adenovirus Cre und normale Urothelzellen verwendet, die mehrere loxP-Allele der Tumorsuppressoren Trp53, Pten und Rb1 tragen. Normale Urothelzellen sind enzymatisch von vier Blasen dreifach floxierter Mäuse getrennt (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). Die Urothelzellen werden ex vivo mit Adenovirus-Cre transduziert, das von einem CMV-Promotor (Ad5CMVCre) angetrieben wird. Die transduzierten Blasenorganoide werden in vitro und in vivo kultiviert, vermehrt und charakterisiert. Die PCR wird verwendet, um Gendeletionen in Trp53, Pten und Rb1 zu bestätigen. Die Immunfluoreszenz-Färbung (IF) von Organoiden zeigt eine positive Expression von Urothellinienmarkern (CK5 und p63). Die Organoide werden subkutan in Wirtsmäuse injiziert, um Tumorexpansion und serielle Passagen zu erhalten. Die Immunhistochemie (IHC) von Xenotransplantaten zeigt eine positive Expression von CK7, CK5 und p63 und eine negative Expression von CK8 und Uroplakin 3. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Adenovirus-vermittelte Gendeletion aus Urothelzellen der Maus, die mit loxP-Stellen manipuliert wurden, eine effiziente Methode ist, um das tumorigene Potenzial definierter genetischer Veränderungen schnell zu testen.

Einleitung

Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart bei Männern und betrifft jährlich mehr als 80.000 Menschen in den Vereinigten Staaten1. Die platinbasierte Chemotherapie ist seit mehr als drei Jahrzehnten der Standard für Patienten mit fortgeschrittenem Blasenkrebs. Die Landschaft der Blasenkrebsbehandlung wurde durch die jüngste Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) für Immuntherapie (Anti-PD-1- und Anti-PD-L1-Immun-Checkpoint-Inhibitoren), Erdafitinib (ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) und Enfortumab-Vedotin (ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat) revolutioniert2,3,4. Es stehen jedoch keine klinisch zugelassenen Biomarker zur Verfügung, um das Ansprechen auf eine Chemotherapie oder Immuntherapie vorherzusagen. Es besteht ein dringender Bedarf, informative präklinische Modelle zu erstellen, die das Verständnis der Mechanismen verbessern können, die das Fortschreiten von Blasenkrebs vorantreiben, und prädiktive Biomarker für verschiedene Behandlungsmodalitäten entwickeln können.

Ein großes Hindernis in der blasentranslationalen Forschung ist das Fehlen präklinischer Modelle, die die Pathogenese und das Behandlungsansprechen von menschlichem Blasenkrebs rekapitulieren 5,6. Es wurden mehrere präklinische Modelle entwickelt, darunter In-vitro-2D-Modelle (Zelllinien oder bedingt umprogrammierte Zellen), In-vitro-3D-Modelle (Organoide, 3D-Druck) und In-vivo-Modelle (Xenotransplantat, karzinogeninduzierte, gentechnisch veränderte Modelle und von Patienten abgeleitete Xenotransplantate)2,6. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind für viele Anwendungen in der Blasenkrebsbiologie nützlich, einschließlich Analysen von Tumorphänotypen, mechanistischen Untersuchungen von Kandidatengenen und/oder Signalwegen und der präklinischen Bewertung therapeutischer Reaktionen 6,7. GEMMs können standortspezifische Rekombinasen (Cre-loxP) verwenden, um genetische Deletionen in einem oder mehreren Tumorsuppressorgenen zu kontrollieren. Der Prozess der Erzeugung gewünschter GEMMs mit mehreren Gendeletionen ist zeitaufwendig, mühsam und teuer5. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung einer schnellen und effizienten Methode der Ex-vivo-Cre-Abgabe zur Etablierung von Blasen-Triple-Knockout-Modellen (TKO) aus normalen Maus-Urothelzellen, die dreifach floxierte Allele (Trp53, Pten und Rb1) tragen8. Der große Vorteil der Ex-vivo-Methode ist der schnelle Workflow (1-2 Wochen statt jahrelanger Mauszucht). Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Ernte normaler Urothelzellen mit floxierten Allelen, ex vivo Adenovirus-Transduktion, Organoidkulturen und in vitro und in vivo Charakterisierung bei immunkompetenten C57 BL/6J Mäusen. Diese Methode kann weiter verwendet werden, um klinisch relevante Blasenkrebs-Organoide in immunkompetenten Mäusen zu erzeugen, die eine beliebige Kombination von floxierten Allelen beherbergen.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, genehmigt (1395M, Biosafety 180501 und 180502).
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1 bis 3 am selben Tag aus.

1. Sezierung der Mausblase

  1. Vorbereitung für die Dissektion
    1. Bereiten Sie alle sterilen Instrumente einschließlich Schere, Pinzette, sterile DPBS in 35-mm-Kulturgeschirr, 70% Ethanol, sterile Gaze und saubere Papiertücher vor. Reinigen Sie alle Oberflächen des Sezierbereichs. Erzeugen Sie männliche dreifach floxierte Mäuse Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f (4 Mäuse, 10 Wochen alt), wie zuvor in Dr. Goodrichs Labor 8 beschrieben.
  2. Euthanasie und Schnitt
    1. Euthanasie die Mäuse durch CO 2 -Erstickung mit einer Durchflussrate von2,0 l / min, gefolgt von zervikaler Dislokation. Reinigen Sie den Sezierbereich mit 70% Ethanol und bedecken Sie ihn mit einem sauberen Papiertuch.
    2. Legen Sie die Maus auf Gaze im Dissektionsbereich. Sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch der Maus und verwenden Sie eine sterile Dissektionsschere, um einen Bauchschnitt in der unteren Mittellinie zu machen, der die Blase freilegt.
  3. Sezieren der Blase
    1. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Blase zu greifen und ziehen Sie sie vorsichtig hoch, so dass bilaterale ureterovesische Verbindungen identifiziert werden. Verwenden Sie eine Schere, um den Blasenfundus entlang der Grenzlinie zwischen den beiden Harnleiteröffnungen zu entfernen.
    2. Geben Sie die Blase in eine sterile Schale mit 2 ml DPBS. Entfernen Sie Fett- und Bindegewebe und geben Sie die Blase in eine neue Schale mit sterilen 2 ml DPBS. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt das Adenovirus aus der Lagerung von -80 ° C heraus und halten Sie es auf Eis.

2. Dissoziation von Urothelzellen

  1. Vorbereitung für die Zelldissoziation
    1. Bereiten Sie alle sterilen Instrumente vor, einschließlich Pinzetten, chirurgische Skalpelle (eine Klinge der Größe 10 mit Griff), sterile DPBS in 35-mm-Kulturschalen, vollständiges Kulturmedium ohne kohleentripptes FBS, definiert als CCM (-), Kollagenase/Hyaluronidase-Gemisch, rekombinantes Enzym für Trypsinersatz, 10% kohleentkleidetes FBS in DPBS mit 10 μM frischem Y-27632, ein 100 μm steriles Zellsieb und ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Das komplette Kulturmedium (CCM) umfasst das Wachstumsmedium der Brustepithelzellen, ergänzt mit den bereitgestellten Wachstumsfaktoren und 5% holzkohle-gestreiftes FBS, 1% L-Glutaminersatz, 100 μg/ml Primocin und 10 μM frisches Y-27632.
  2. Hacken und Verdauen der Blase
    1. Übertragen und waschen Sie die Blase erneut mit 2 ml sterilem DPBS in einer 35-mm-Schale in einer Biosicherheitswerkbank.
    2. Sammeln Sie Blasengewebe von vier Mäusen in einer Schale mit 1 ml CCM (-) und zerkleinern Sie jede Blase mit einer chirurgischen Klinge in vier gleiche Stücke. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Blase zu entfalten, um die Urotheloberfläche dem Medium auszusetzen.
    3. Die Blasenstücke und das Medium in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen geben. Waschen Sie die Schale mit 2 mL CCM(-) 2x und sammeln Sie sie in einem Zentrifugenröhrchen auf ein Gesamtvolumen von 5 ml.
    4. Kollagenase/Hyaluronidase-Gemisch zu einer Endkonzentration von 300 U/ml Kollagenase und 100 U/ml Hyaluronidase hinzufügen und das Rohr horizontal in einen 37 °C Orbital-Inkubationsschüttler für 30 min bei 200 U/min geben.
    5. Nach der Gewebeverdauung ein gleiches Volumen (5 ml) von 10% Holzkohle-gestreiftem FBS in DPBS in das Röhrchen geben und das Röhrchen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren.
    6. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. 2 ml Trypsinersatz in das Zellpellet geben und gut mischen. Legen Sie das Rohr in einen Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 4 min.
    7. Nach der Inkubation 10x mit einer Standard-P1000-Spitze auf und ab pipettieren. Fügen Sie 5 ml 10% kohleentripptes FBS in DPBS hinzu.
    8. Belasten Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 μm steriles Zellsieb. Zellsuspension und Zentrifuge bei 200 x g für 5 min sammeln.
  3. Zählen und Resuspendieren von Zellen
    1. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendiert das Zellpellet mit 1 ml CCM.
    2. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und nur die Platte 0,5 x 106 Zellen in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 0,5 ml frischem CCM. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt die Matrixextrakte der Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen (siehe Materialtabelle) aus -20 °C Lagerung heraus und tauen Sie auf Eis auf. Vorwärmen Sie eine 6-Well-Platte in einem 37 °C Zellinkubator.
      HINWEIS: Die verbleibenden Zellen können zentrifugiert und als Zellpellets für die Nicht-Virus-Transduktionskontrolle eingefroren werden.

3. Adenovirale Transduktions- und Beschichtungsorganoide

ACHTUNG: Bitte seien Sie vorsichtig bei der Verarbeitung von Adenovirus. Das Laborpersonal sollte die Praktiken der Biosicherheitsstufe 2 befolgen und das Adenovirus mit 10% Bleichmittel desinfizieren.

  1. 2 μL Adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) in die 24-Well-Platte geben. Mischen Sie sich gut mit den dissoziierten Urothelzellen.
  2. Um die Transduktionseffizienz zu erhöhen, führen Sie die Spinokulation durch, indem Sie die 24-Well-Platte bei 300 x g für 30 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Legen Sie die 24-Well-Platte in einen Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 1 h.
  3. Überführen Sie Zellen und Medium aus dem Bohrloch in ein 15-ml-Röhrchen und eine Zentrifuge bei 200 x g für 5 min. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 50 μL CCM hinzu und mischen Sie gut mit den Zellen am Boden.
  4. Fügen Sie 140 μL Matrixextrakt hinzu und mischen Sie vorsichtig gut, um Luftblasen zu vermeiden. Fügen Sie die Lösung schnell in die vorgewärmte 6-Well-Platte bei 50 μL / Dome hinzu, um Kuppeln für Organoide zu erstellen.
  5. Die Platte vorsichtig in einen 37 °C Inkubator mit 5% CO 2 geben und dieKuppeln 5 min erstarren lassen. Drehen Sie die 6-Well-Platte auf den Kopf und setzen Sie die Erstarrung für weitere 25 Minuten fort.
  6. Nach der Inkubation fügen Sie 2,5 ml CCM zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die Platte in einen Inkubator für Organoidkulturen.

4. Organoidkultivierung und -passage

  1. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage. Führen Sie Organoidkultivierung, Passaging und Einfrieren durch, wie in Lee et al.9 beschrieben. Einbettung von Organoiden unter Verwendung von Probenverarbeitungsgel, wie in Fujii et al.10 beschrieben.
  2. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml Dispase zu jeder Vertiefung hinzu. Brechen Sie die Kuppel vorsichtig und mischen Sie gut mit einer P1000 Pipettenspitze.
  3. Legen Sie die Platte in einen 37 °C Inkubator mit 5% CO2 für 30 min. Sammeln Sie dann alle Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie das Bohrloch mit 4 ml 10% holzkohleabgestreiftem FBS in DPBS. Wenn die Organoidzellen als große Cluster angezeigt werden, führen Sie Schritt 2.2.6 aus. und Schritt 2.2.7. , um getrennte Zellen zu erhalten.
  4. Zentrieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 1 ml CCM.
  5. Suspendieren Sie die Zellen in 70% Matrixextrakt und folgen Sie den Schritten 3.4.-3.6. für den Anbau. Alternativ können die Zellen kryokonserviert werden, indem sie in 90% mit Holzkohle abgestreiftes FBS und 10% DMSO resuspendiert werden, ergänzt mit 10 μM frischem Y-27632.

5. Organoide Zellen Implantation in C57BL/6J Maus subkutan

  1. Vorbereitung für die Implantation
    1. Bereiten Sie 25G 1,5 in Nadeln, eine 1 ml Spritze, 1 mg / ml Dispase, Matrixextrakt, 10% holzkohleentripptes FBS in DPBS mit 10 μM frischem Y-27632 und ein 15 ml Zentrifugenröhrchen vor.
  2. Organoide Zellsammlung
    1. Nachdem Sie eine stabile Kultur für mindestens 5 Passagen erreicht haben, sammeln Sie die expandierten Organoidzellen für die In-vivo-Injektion . Befolgen Sie die Schritte 4.2.-4.4. und resuspendieren Zellen in 1 ml CCM.
  3. Zählen von Zellen und subkutane Injektion
    1. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer. Nach der Zentrifugation bei 200 x g für 5 min 2 x10 6 Zellen in 100 μL 50% Matrixextrakt in DPBS resuspendiert. Stellen Sie die Aufhängung auf Eis und bringen Sie sie in eine Biosicherheitskabine in einem Tierbehandlungsraum.
    2. Anästhesieren Sie zwei männliche C57BL/6J-Mäuse (10 Wochen alt) mit 4% Isofluran und 1 L/minO2-Fluss für ca. 4 min in einer Kammer. Sobald die Mäuse ihren Aufrichtenden Reflex verloren haben und ihr Atemmuster tiefer und langsamer geworden ist, übertragen Sie die Mäuse in einen nicht atmungsaktiven Kreislauf mit 2% Isofluran und 1 l / min O2-Fluss . Tragen Sie Tierarztsalbe auf, um die Augen der Tiere vor traumatischen Verletzungen zu schützen.
    3. Rasieren Sie einen Bereich um die Injektionsstelle an der rechten Flanke der Maus und verwenden Sie 70% Ethanol zur Reinigung, und verwenden Sie dann eine 25-G-Nadel, um die 100-μL-Zellsuspension unter Narkose direkt in die rechte Flanke zu injizieren.
    4. Entfernen Sie nach der Injektion die Inhalationsanästhesie und legen Sie die Mäuse in einen Käfig unter einer Wärmelampe, bis sie sich erholt und vollständig mobilisiert haben. Geben Sie die Mäuse zur Unterbringung zurück und überwachen Sie die Tumorbildung.

6. Tumorentnahme und In-vivo-Vermehrung

  1. Befolgen Sie den Vorbereitungsschritt 2.1.1. Euthanasthanisieren Sie Mäuse durch CO 2-Asphyxie mit einer Durchflussrate von 2,0 l / min, gefolgt von zervikaler Dislokation, nachdem ein Tumor von ~ 2,0 cm Durchmesser (fast2-3 Wochen) gebildet wurde. Übertragen Sie die Mäuse in einen sauberen Dissektionsbereich, sprühen Sie 70% Ethanol auf den Tumorbereich der Mausflanke und verwenden Sie sterile Dissektionsscheren und Pinzetten, um einen Schnitt zu machen, um den Tumor zu trennen.
  2. Waschen Sie den Tumor in einer 60-mm-Schale mit 5 ml DPBS und entfernen Sie mit einer Schere das Bindegewebe. Schneiden Sie ein Stück des frischen Tumors und senken Sie es mit 4% Paraformaldehyd in DPBS für 48 h und senden Sie es zur Paraffineinbettung und -sektion für die histologische Analyse.
  3. Verarbeiten Sie die andere Hälfte des frischen Tumors zur Zelldissoziation. Kurz den frischen Tumor in 1 mm3 Stück zur Dissoziation in einer 60 mm Schale mit 5 ml CCM (-) zerkleinern. Injizieren Sie dann, nachdem Sie die Schritte 2.2.4.-2.2.8. ausgeführt haben, die dissoziierten Zellen in neue C57BL/6J-Mäuse für die In-vivo-Übertragung gemäß Schritt 5.3. oder als In-vitro-Organoidkultur gemäß den Schritten 3.4.-3.6. aufbewahren oder direkt in flüssigem Stickstoff mit 90% mit Holzkohle-entkleidetem FBS und 10% DMSO mit 10 μM frischem Y-27632 einfrieren.
  4. Bei Bedarf die gefrorenen Zellen wiederherstellen, indem Sie sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad schnell auftauen und mit CCM(-) waschen. Danach resuspendieren Sie sie in 100 μL 50% Matrixextrakt in DPBS zur direkten Injektion in Mäuse zur In-vivo-Tumorbildung. Verwenden Sie mindestens 2 x 10 6 aufgetaute Zellen für eine In-vivo-Injektion.

Ergebnisse

Der Arbeitsablauf von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus ist in Abbildung 1A dargestellt. Das dazugehörige Video zeigt, wie die Urothelzellen vom Fundus der Blase getrennt werden und wie die dreifach floxierten Zellen ex vivo mit Ad5CMVCre transduziert werden. Abbildung 1A zeigte, dass minimale Submukosen und Muskelzellen nach der Enzymverdauung dissoziiert wurden. Um die Effizienz der Adenovirus-Cre-Abgabe zu bestätig...

Diskussion

GEMMs waren die Goldstandards für die Krebsmodellierung, die von normalen Zellen initiiert wurde, so dass die Folgen potenzieller onkogener Störungen (Onkogenaktivierung und / oder Verlust von Tumorsuppressoren) rigoros getestet werden konnten. Hier wird ein schnelles und effizientes Protokoll bereitgestellt, um Blasenkrebs-Organoide durch Ex-vivo-Gen-Editing von normalen Maus-Urothelzellen, die floxierte Allele in interessanten Genen tragen, zu erzeugen. H&E- und IHC-Färbungen zeigen, dass TKO-Organoide eine...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschungsarbeit wurde zum Teil von NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 und R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), der Roswell Park Alliance Foundation und der Friends of Urology Foundation unterstützt. Wir danken Marisa Blask und Mila Pakhomova für das Korrekturlesen des Manuskripts.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
100 μm sterile cell strainerCorning431752
1 mL syringeBD309659
25G 1.5 inches needleEXELINT International26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)UI Viral Vector CoreVVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6JJackson Lab000664
Charcoal-stripped FBSGibcoA3382101
Collagenase/hyaluronidaseStemcell Technologies07912
DispaseStemcell Technologies07913
DPBS, 1xCorning21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)Gibco35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth mediumLonzaCC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)CorningCB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20DAKOM7019IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7Santa Cruz BiotechnologySC-23876IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63Abcamab735IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3Fitzgerald10R-U103AIHC 1:50
Monoclonal mouse anti-VimentinSanta Cruz BiotechnologySC-6260IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-I-sIF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubatorThermo Fisher51033557
Polyclonal chicken anti-CK5Biolegend905901IF 1:500
PrimocinInvivoGenant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)Thermo Fisher12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575VWR35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)Thermo FisherHG-4000-012
Surgical blade size 10Integra Miltex4-110
Sorvall T1 centrifugeThermo Fisher75002383
Y-27632SelleckchemS1049

Referenzen

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