Establecimiento y evaluación de un modelo de enfermedad por injerto de vena porcina

Resumen

En este protocolo, el nuevo injerto de derivación de la vena porcina se realizó a través de una pequeña incisión en la pared torácica izquierda sin bypass cardiopulmonar. Se realizó un estudio patológico postoperatorio, que mostró engrosamiento de la íntima.

Resumen

La enfermedad del injerto venoso (VGD) es la principal causa de insuficiencia del injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG). Se necesitan modelos animales grandes de CABG-VGD para la investigación de los mecanismos de la enfermedad y el desarrollo de estrategias terapéuticas.

Para realizar la cirugía, entramos en la cámara cardíaca a través del tercer espacio intercostal y diseccionamos cuidadosamente la vena mamaria interna y la sumergimos en solución salina normal. La arteria coronaria principal derecha se trata entonces para la isquemia. Se incide el vaso objetivo, se coloca un tapón de derivación y se anastomosa el extremo distal de la vena del injerto. La aorta ascendente está parcialmente bloqueada y el extremo proximal de la vena del injerto se anastomosa después de la perforación. Se revisa la vena del injerto para detectar permeabilidad y se liga la arteria coronaria derecha proximal.

La cirugía de CABG se realiza en minicerdos para cosechar la vena mamaria interna izquierda para su uso como injerto vascular. Las pruebas bioquímicas séricas se utilizan para evaluar el estado fisiológico de los animales después de la cirugía. El examen de ultrasonido muestra que el extremo proximal, medio y distal del vaso del injerto no están obstruidos. En el modelo quirúrgico, se observa un flujo sanguíneo turbulento en el injerto tras el examen histológico después de la cirugía de CABG, y se observa estenosis del injerto venoso asociada con hiperplasia de la íntima en el injerto. El estudio aquí proporciona procedimientos quirúrgicos detallados para el establecimiento de un modelo repetible de VGD inducido por CABG.

Introducción

Aunque la mortalidad por enfermedad coronaria ha disminuido significativamente en los últimos años, la mitad de los adultos de mediana edad en los Estados Unidos desarrollan síntomas isquémicos relacionados con el corazón cada año, y un tercio de los adultos mayores mueren de enfermedad coronaria¹. El injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) es una modalidad quirúrgica eficaz para mejorar la isquemia miocárdica y, lo que es más importante, es una modalidad quirúrgica insustituible para el tratamiento de la enfermedad arterial coronaria multivaso². Con el tiempo, sin embargo, los injertos vasculares desarrollan inflamación, hiperplasia de la íntima y aterosclerosis progresiva, que se sabe que conduce a la insuficiencia del injerto venoso o enfermedad del injerto venoso (VGD)³. En pacientes después de la CABG, si ocurre reestenosis, solo el vaso sanguíneo enfermo puede ser reemplazado en algunos casos². Los pacientes mayores y las comorbilidades añadidas hacen que rehacer el injerto de derivación de la arteria coronaria sea bastante difícil. Retrasar o controlar los problemas patológicos asociados con los vasos sanguíneos injertados es un problema urgente a resolver. Se necesitan modelos animales grandes de CABG-VGD para la investigación de los mecanismos de la enfermedad y el desarrollo de estrategias terapéuticas. Los investigadores han establecido con éxito modelos animales de VGD en animales pequeños y grandes como ratones⁴, ratas⁵, conejos⁶ y cerdos⁷. En comparación con los animales pequeños, los animales grandes, como los cerdos, tienen estructuras anatómicas y características fisiológicas similares a las de los humanos y tienen una vida útil más larga ^8,9. Por lo tanto, los animales grandes son más adecuados para explorar cambios patológicos a largo plazo en la enfermedad del injerto venoso y para pruebas preclínicas de medicamentos o dispositivos. Nosotros y nuestro equipo colaborador hemos aplicado con éxito técnicas quirúrgicas para establecer un modelo de insuficiencia cardíaca porcina y hemos descrito los cambios patológicos cardíacos en este modelo¹⁰.

La cirugía de CABG se ha estandarizado en la práctica clínica, pero cuando se aplica al establecimiento de modelos animales VGD, las diferencias entre especies, la adquisición de equipos e instalaciones para animales, las operaciones quirúrgicas con animales y la alimentación y enfermería de animales son enormes desafíos para los investigadores. Al igual que en la práctica clínica, los enfoques para la cirugía de CABG utilizados para establecer modelos animales de VGD incluyen la esternotomía de la línea media¹¹ y la toracotomía lateral izquierda¹². La esternotomía de la línea media se usa más comúnmente^13,14. Sin embargo, este enfoque tiene altos riesgos tanto para los seres humanos como para los animales. En el estudio relatado por Thankam et al., dos de los seis cerdos utilizados para modelar murieron durante la cirugía¹⁵. La mortalidad alta del modelo aumenta los costos del estudio y afecta la precisión de los resultados. Un estudio mostró anteriormente que una incisión en la pared torácica izquierda era factible para establecer VGD inducida por CABG en cerdos¹¹. Aquí, este estudio tiene como objetivo describir un protocolo paso a paso para establecer una cirugía reproducible para un modelo VGD inducido por CABG en minicerdos y evaluar el fenotipo de este modelo. El protocolo experimental fue diseñado conjuntamente por los equipos de cirugía cardíaca y anestesia. El abordaje quirúrgico para el tercer espacio intercostal izquierdo fue determinado de acuerdo con los cadáveres de otros minipigs en el laboratorio antes de la cirugía, y el método de anestesia fue realizado de acuerdo con el método utilizado en el centro¹⁶. Se realizaron pruebas bioquímicas de sangre, examen ultrasónico y examen histológico para evaluar modelos animales.

Protocolo

Los procedimientos para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Monitoreo de Animales de Laboratorio de Guangdong. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (8th Ed., 2011, National Research Council, EE. El procedimiento quirúrgico se muestra en la Figura 1.

1. Preparación preoperatoria de los animales

1. Divida aleatoriamente 10 minicerdos machos de 3 meses de edad que pesen entre 30 y 35 kg en el grupo simulado (n = 5) y el grupo VGD (n = 5).
2. Evaluar las condiciones de salud preoperatorias y postoperatorias de los cerdos utilizando el índice de masa corporal (IMC). Calcule el IMC de la siguiente manera:
   IMC = peso corporal (kg)/(longitud corporal [cm] × longitud corporal [cm])
   NOTA: La longitud del cuerpo se mide desde la nariz del cerdo hasta la base de la cola.
3. Ayunar a los animales durante 12 h antes de la cirugía para evitar la aspiración después de la anestesia. Preparar aparatos de anestesia e instrumentos quirúrgicos, incluyendo una máquina de anestesia, gas, medicamentos anestésicos, un tubo de anestesia, un laringoscopio especial e instrumentos quirúrgicos, un retenedor de costillas, suturas, un retractor tiroideo, fórceps quirúrgicos, etc. Esterilizar todos los instrumentos que se utilizarán en la cirugía.

2. Preparación de los animales para la cirugía

1. Pesar los animales y calcular la dosis anestésica. Administrar por vía intramuscular la mezcla anestésica compuesta por 2 mg/kg de Tiletamina y Zolazepam 1:1, 0,2 mg/kg de diazepam y 0,02 mg/kg de atropina¹⁷. Use fentanilo (50 mg/kg) para aliviar el dolor intraoperatorio³⁰.
2. Asegúrese de que se logre un plano anestésico adecuado e inserte un catéter venoso permanente (20 G) en la vena marginal del oído para establecer el acceso al oído. Transfiera el cerdo a la mesa de operaciones y colóquelo en posición supina. Inmovilice las extremidades con vendajes y eleve la cabeza con una cortina estéril.
   NOTA: El estado de anestesia fue monitoreado por fijación central del globo ocular, miosis, pérdida del reflejo pupilar y pérdida del reflejo del dolor.  La frecuencia cardíaca y la presión arterial se mantuvieron en un nivel más bajo que la línea de base. El cirujano debe controlar la FC, la PA y otros parámetros bajo parálisis y aumentar la dosis anestésica si la FC aumenta > 20% por encima de la línea de base.
3. Exponga la epiglotis y la glotis con un laringoscopio veterinario. Realice la intubación traqueal con un tubo de 7.0-7.5Fr y conéctelo al circuito de respiración de anestesia.
   NOTA: El respirador se utiliza para ventilación continua con presión positiva con volumen corriente de 280 ml, relación inspiratoria/espiratoria 1:2, frecuencia respiratoria 20 veces/min y presión positiva al final de la espiración (5 cm H₂O).
4. Inyecte por vía intravenosa bromuro de vecuronio (0,1 mg / kg) para relajar los músculos durante los procedimientos quirúrgicos y use isoflurano al 2% para mantener la anestesia a una frecuencia respiratoria de 16-20 lpm y un volumen corriente de 10 ml / kg.
   NOTA: Vecuronio se administra para asegurar una profundidad adecuada de anestesia en animales paralizados, especialmente porque la dosis de fármaco de inducción e isoflurano está en el extremo inferior de lo recomendado.
5. Use ungüento veterinario en los ojos del cerdo para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Utilice mantas eléctricas para mantener la temperatura corporal del cerdo a 38 °C ± 5 °C.
6. Use un electrocardiograma para controlar la frecuencia cardíaca, los niveles de oxígeno en la sangre y la temperatura corporal.

3. Procedimientos quirúrgicos

1. Afeitar la pared torácica izquierda y aplicar tres rondas alternas de yodo al 0,7% y alcohol al 75% para preparar asépticamente el área quirúrgica hasta el ángulo mandibular izquierdo, hasta el cordón umbilical, izquierda hasta la línea axilar posterior y derecha hasta el frente axilar. Coloque una cortina quirúrgica estéril alrededor del área quirúrgica.
2. Hacer una incisión transversal de 7-10 cm con un cuchillo eléctrico en el tercer espacio intercostal izquierdo y separar los tejidos subcutáneos capa por capa (Figura 2A). Retire un segmento de 5-6 cm de la tercera costilla con tijeras de hueso y exponga la vena mamaria interna con un retractor después de exponer la tercera articulación costilla-esternón (Figura 2B).
3. Localice la vena mamaria interna junto con la arteria mamaria interna izquierda en el lado izquierdo del esternón. Realizar una disección contundente de la vena mamaria interna con fórceps vasculares.
4. Realizar hemostasia por electrocoagulación de las ramas de la vena mamaria interna izquierda con un cuchillo eléctrico. Si la hemostasia es incompleta, use ligadura de hilo de algodón para la hemostasia. Ligate y marca los dos extremos de la vena mientras se cosecha (Figura 2C).
5. Prepare la solución salina normal de heparina agregando 2 ml de solución de heparina sódica y 98 ml de solución salina normal. Después de retirar la vena, inyecte heparina solución salina normal en la vena para el tratamiento previo (Figura 2D). Luego, coloque la vena en solución salina normal y guárdela como respaldo.
6. Haga una incisión similar a la descrita anteriormente y retire la vena mamaria interna en el grupo simulado. Abra el pericardio, luego cierre la pared torácica en el grupo simulado. Use la vena mamaria interna del grupo simulado para el control patológico sin injerto de derivación de la arteria coronaria.
7. Haga una incisión de ~ 7 cm con un cuchillo eléctrico en el pericardio para exponer el tronco de la arteria coronaria derecha. Suspender el pericardio y coser sobre la piel del lado ipsilateral con las suturas quirúrgicas 1-0 (Figura 2E). Separe el tronco de la arteria coronaria derecha de los tejidos circundantes (Figura 2E).
8. Omitir la banda de bloqueo debajo del extremo proximal de la arteria coronaria derecha aislada cerca de la aorta con un gancho de alambre y tratar el miocardio con tres ciclos de isquemia de 2 min y reperfusión de 5 min apretando y relajando la banda de bloqueo (Figura 2F). Controle la actividad eléctrica del corazón con el monitor de electrocardiograma durante el preacondicionamiento de isquemia/reperfusión (Figura 2G).
   NOTA: Cuando la arteria coronaria derecha está bloqueada, el electrocardiograma muestra un aumento de la frecuencia cardíaca y la elevación del segmento ST.
9. Apriete la banda para bloquear el flujo sanguíneo coronario derecho. Cortar el epicardio que cubre los vasos sanguíneos. Exponga la pared de la arteria coronaria y corte longitudinalmente con la punta de una cuchilla quirúrgica contra el centro de la pared anterior de los vasos sanguíneos.
10. Después de cortar la luz, agrande la incisión con tijeras y coloca una derivación coronaria. Inserte un extremo de la derivación con una bobina en la arteria coronaria distal a través del desgarro. Desvíe la sangre de las arterias coronarias hacia la derivación coronaria hueca para asegurar un campo operativo claro (Figura 2H).
11. Realizar una sutura continua de extremo a lado entre la vena mamaria interna y el tronco coronario derecho con la sutura de polipropileno 7-0 (Figura 2I). En el centro de la aorta ascendente, ocluya la pared anterolateral izquierda de la aorta ascendente con una pinza de semioclusión.
12. Use una cuchilla quirúrgica para hacer una pequeña incisión en la pared aórtica donde se ha cortado la adventicia, inserte el extremo de la cabeza del eje deslizante en el extremo de la cabeza del punzón en la cavidad aórtica a través de esta incisión, contraiga el eje deslizante hacia afuera y el cuchillo circular sobre él corta un pedazo de la pared arterial. El bloque de tejido cortado por el punzón tiene aproximadamente 3 mm de diámetro (Figura 2J).
13. Saque la derivación. Realizar una sutura continua de extremo a lado entre la vena mamaria interna y la pared aórtica con la sutura de polipropileno 6-0 (Figura 2K). Abra la pinza de semioclusión.
14. Registrar el flujo de derivación del tronco de la arteria coronaria derecha proximal al sitio de la anastomosis mediante ultrasonido. Controle la actividad eléctrica del corazón mediante el electrocardiograma (Figura 2L).
15. Coloque un tubo de drenaje temporal (Fr: 16) en la cavidad torácica para permitir que la sangre y los líquidos drenen. Cose la incisión del pericardio con un hilo de algodón 1-0 y cierre el pecho capa por capa (de adentro hacia afuera: capa de pleura, capa muscular, capa de tejido subcutáneo, capa de piel) mientras coloca polvo de penicilina (aproximadamente 0,5 g) en cada capa. Retire el tubo de drenaje después de coser la incisión de la piel con un hilo de algodón 1-0.

4. Cuidados postoperatorios

1. Retire el tubo endotraqueal después de que los animales hayan vuelto a la respiración espontánea. El anestesiólogo debe evaluar los signos vitales del animal (por ejemplo, frecuencia respiratoria, frecuencia cardíaca, saturación de oxígeno, etc.) y retirar el ECG después de que los animales se despierten y vuelvan a la actividad espontánea. Envíe a los animales de regreso a la sala de alimentación y coloque a los animales simulados en otro corral en la sala de cría. Mantenga a los animales calientes con una manta eléctrica. Observe a los animales cada hora después de la cirugía (al menos 4 veces).
2. Alimente al animal el día después de la cirugía. Agregue aspirina (200 mg) 2 veces al día durante 7 días a la alimentación animal para prevenir la trombosis postoperatoria y reducir el dolor de la herida.
   NOTA: Evite alimentar a los animales el día de la cirugía para evitar la aspiración.
3. Administrar al animal una inyección intramuscular de penicilina 1 veces al día durante 7 días consecutivos para prevenir la infección postoperatoria (14.000 unidades por kg).

5. Examen ultrasónico

1. Después de la cirugía de CABG, use un manguito de sonda ultrasónica estéril para envolver la sonda de matriz lineal de alta frecuencia. Coloque la sonda en la superficie del injerto venoso.
2. Muestre el contorno del injerto en el modo de ultrasonido bidimensional, luego cambie al modo Doppler color para detectar el flujo sanguíneo en el injerto.

6. Recolección de tejido del injerto venoso

1. Recoja 10 ml de muestra de sangre del circuito venoso de la vena del oído para pruebas bioquímicas. (Tabla 1). Centrifugar la muestra de sangre a 1.000 x g durante 5 min y realizar pruebas bioquímicas con un analizador bioquímico automático.
2. Anestesiar al animal como se describió anteriormente. Tras la confirmación de la profundidad de la anestesia, inyecte cloruro de potasio al 10% 0.5 ml / kg de peso corporal de la vena marginal del oído o la vena de la extremidad anterior. Luego, haga una incisión esternal mediana de 10 cm con un cuchillo eléctrico para cosechar el injerto de vena 30 días después de la cirugía. Fije la posición del cuerpo como en el paso 2.2., y después de la esterilización y colocación de un paño, haga una incisión mediana en el esternón para dividir el esternón. Durante la separación, evite los vasos sanguíneos principales y el corazón, y separe los vasos sanguíneos injertados capa por capa.
3. Corte rápidamente los vasos sanguíneos grandes que se conectan al corazón, coloque el corazón y la aorta ascendente en trozos de hielo y retire el puente vascular del injerto, la aorta conectada y la arteria coronaria derecha. Enjuagar todas las muestras con solución salina normal a 4 °C.
4. Tome todo el vaso del injerto de aproximadamente 3-4 cm de tamaño, divídalo en 4-5 partes iguales y transfiéralo a tubos de criopreservación. Coloque rápidamente los tubos en nitrógeno líquido para congelarlos rápidamente y muévalos a un congelador de temperatura ultrabaja de -80 °C para su almacenamiento.
5. Para el análisis, enjuague el injerto con solución salina helada al 0,9% y fíjelo en una solución de paraformaldehído al 4%. Mantenga una proporción de tamaño de bloque de tejido a solución fijadora de 1:10 y fije el tejido durante más de 12 h.
6. Colorear las secciones en 50 ml de solución acuosa de hematoxilina durante 3 min. Separar las secciones lavando con 50 mL de etanol de ácido clorhídrico al 0,5% y 50 mL de agua de amoníaco al 0,2% durante 10 s cada una.
7. Enjuagar con agua corriente durante 1 h y luego limpiar en agua destilada remojando durante 3 min. Deshidratar en etanol al 70% y 90% durante 10 min cada uno. Colocar en 50 ml de solución de tinción de eosina alcohólica al 0,5% durante 2-3 min.
8. Deshidratar las secciones teñidas con etanol puro durante 10 min y luego remojar en xileno puro durante 10 min para que las muestras sean transparentes. Gotea las secciones transparentes con pegamento neutro y cúbrelas con un cubreobjetos. Observe secciones patológicas bajo un microscopio óptico con un aumento de 40x.

Resultados

IMC e índices bioquímicos séricos
El IMC entre los grupos simulado y VGD no fue significativamente diferente (simulado vs. VGD, 22,05 kg/cm 2 ± 0,46 kg/cm 2 vs. 21,14 kg/cm 2 ± 0,39 kg/cm ², p = 0,46). Los resultados bioquímicos séricos se enumeran en la Tabla 1. Se encontraron cambios estadísticamente significativos entre los grupos en cuatro índices bioquímicos, incluyendo aspartato aminotransferasa (AST, simulada vs. VG...

Discusión

En este estudio, describimos en detalle el protocolo para la selección de animales, la preparación de instrumentos, los procedimientos quirúrgicos y la evaluación postoperatoria al desarrollar un modelo de VGD inducido por CABG. Se realizó un examen ultrasónico del injerto venoso antes y después de la cirugía de CABG y un examen histológico del injerto 30 días después de la cirugía. El flujo sanguíneo en la vena mamaria interna era normal antes de la cirugía de CABG, mientras que el flujo retrógrado se obs...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aortic Punch	Medtronic Inc. , America	3.0mm, 3.5mm, 4.0mm	Used for proximal coronary bridge anastomosis
Automatic biochemical analyzer	IDEXX Laboratories, Inc. America	Catalyst One
Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit	LANDANGER, France
Cardiogram monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd	MEC-1000
Coronary Shunt	AXIUS	OF-1500, OF-2500, OF-3000	The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis.  The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis.
Defibrillator	MEDIANA	Mediana D500
Diazepam	Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China	H37023039	Narcotic inducer
Disposable manual electric knife	Covidien, America	E2516H
Electric negative pressure suction machine	Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd	YX932D
Esmolol	Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD	H20055990	Emergency drugs
Ice machine	Local suppliers, Guangzhou, China
Lidocaine	Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD	H51021662	Emergency drugs
Luxtec headlight system	Luxtec, America	AX-1375-BIF	Used for lighting fine parts during operation
Medical operation magnifier (glasses)	Germany Lista co, LTD	SuperVu Galilean 3.5×	Used for fine site operation during operation
Multi-function high-frequency electrotome	Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd	GD350-B
Nitrogen canister	Local suppliers, Guangzhou, China
Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture)	Johnson & Johnson, America	6-0, 7-0	Used to suture blood vessels.
Nonabsorbable suture (cotton thread)	Covidien, America	1-0	Used for skin and muscle tissue tugging
Open heart surgery instrument kit	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD
Propofol injection	Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD	H19990282	Anesthetic sedative
Refrigerator	Local suppliers, Guangzhou, China
Respiratory anesthesia machine for animal	Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China	R620-S1
Semi-occlusion clamp	Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd.	ZL1701RB	Temporarily cut off the aortic flow
vecuronium bromide	Richter, Hungary	JX20090127	Muscle relaxant
Veterinary ultrasound system	Royal Philips, Netherlands	CX50
Zoletil	Virbac, France	Zoletil 50	Animal narcotic