Estabelecimento e Avaliação de um Modelo de Enxerto de Veia Suína

Resumo

Neste protocolo, a nova cirurgia de revascularização do miocárdio foi realizada através de uma pequena incisão na parede torácica esquerda, sem circulação extracorpórea. Foi realizado um estudo anatomopatológico pós-operatório, que mostrou espessamento intimal.

Resumo

A doença do enxerto venoso (DPV) é a principal causa de insuficiência da revascularização miocárdica (CRM). Grandes modelos animais de CRM-VGD são necessários para a investigação dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.

Para realizar a cirurgia, entramos na câmara cardíaca através do terceiro espaço intercostal e dissecamos cuidadosamente a veia mamária interna e a mergulhamos em solução salina normal. A artéria coronária principal direita é então tratada para isquemia. O vaso-alvo é incisado, um tampão de derivação é colocado e a extremidade distal da veia do enxerto é anastomosada. A aorta ascendente é parcialmente bloqueada e a extremidade proximal da veia do enxerto é anastomosada após a perfuração. A veia do enxerto é verificada quanto à perviedade e a artéria coronária direita proximal é ligada.

A cirurgia de revascularização miocárdica é realizada em minipigas para colher a veia mamária interna esquerda para seu uso como enxerto vascular. Testes bioquímicos séricos são utilizados para avaliar o estado fisiológico dos animais após a cirurgia. O exame ultrassonográfico mostra que a extremidade proximal, média e distal do vaso do enxerto está desobstruída. No modelo cirúrgico, observa-se fluxo sanguíneo turbulento no enxerto ao exame histológico após a cirurgia de revascularização miocárdica, e estenose do enxerto venoso associada à hiperplasia intimal no enxerto. O estudo aqui fornece procedimentos cirúrgicos detalhados para o estabelecimento de um modelo de DVG induzida por CRM repetível.

Introdução

Embora a mortalidade por doença coronariana tenha diminuído significativamente nos últimos anos, metade dos adultos de meia-idade nos Estados Unidos desenvolve sintomas isquêmicos relacionados ao coração a cada ano, e um terço dos idosos morre de doença coronariana¹. A revascularização miocárdica (CRM) é uma modalidade cirúrgica eficaz para melhorar a isquemia miocárdica e, mais importante, é uma modalidade cirúrgica insubstituível para o tratamento da doença arterial coronariana multiarterial². Com o tempo, no entanto, os enxertos vasculares desenvolvem inflamação, hiperplasia intimal e aterosclerose progressiva, que é conhecida por levar à falência do enxerto venoso ou doença do enxerto venoso (VGD)³. Em pacientes após revascularização miocárdica, se ocorrer reestenose, apenas o vaso sanguíneo doente pode ser substituído em alguns casos². Pacientes mais velhos e comorbidades adicionais tornam o refazer a revascularização do miocárdio bastante desafiador. Atrasar ou controlar os problemas patológicos associados aos vasos sanguíneos enxertados é um problema urgente a ser resolvido. Grandes modelos animais de CRM-VGD são necessários para a investigação dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. Pesquisadores estabeleceram com sucesso modelos animais de VGD em animais pequenos e grandes, como camundongos⁴, ratos⁵, coelhos⁶ e porcos⁷. Em comparação com os pequenos animais, os animais de grande porte, como os suínos, apresentam estruturas anatômicas e características fisiológicas semelhantes aos humanos e maior expectativa de vida ^8,9. Assim, animais de grande porte são mais adequados para explorar alterações patológicas de longo prazo na doença do enxerto venoso e para testes pré-clínicos de medicamentos ou dispositivos. Nós e nossa equipe colaboradora aplicamos com sucesso técnicas cirúrgicas para estabelecer um modelo de insuficiência cardíaca suína e descrevemos as alterações patológicas cardíacas nesse modelo¹⁰.

A cirurgia de revascularização miocárdica tem sido padronizada na prática clínica, mas quando aplicada ao estabelecimento de modelos animais VGD, as diferenças entre espécies, a aquisição de equipamentos e instalações animais, operações cirúrgicas em animais e alimentação e enfermagem animal são enormes desafios para os pesquisadores. Assim como na prática clínica, as abordagens para a cirurgia de revascularização miocárdica utilizadas para estabelecer modelos animais de DVG incluem esternotomia de linha média¹¹ e toracotomia lateral esquerda¹². A esternotomia da linha média é mais comumente utilizada^13,14. No entanto, essa abordagem tem altos riscos para humanos e animais. No estudo relatado por Thankam et al., dois dos seis porcos utilizados para modelagem morreram durante a cirurgia¹⁵. A alta mortalidade do modelo aumenta os custos do estudo e afeta a precisão dos resultados. Um estudo mostrou anteriormente que uma incisão na parede torácica esquerda era viável para estabelecer a DVG induzida por CRM em suínos¹¹. Aqui, este estudo tem como objetivo descrever um protocolo passo-a-passo para estabelecer uma cirurgia reprodutível para um modelo de DVG induzida por CRM em minipigs e avaliar o fenótipo desse modelo. O protocolo experimental foi elaborado em conjunto pelas equipes de cirurgia cardíaca e anestesia. A abordagem cirúrgica para o terceiro espaço intercostal esquerdo foi determinada de acordo com os cadáveres de outros minipigs no laboratório antes da cirurgia, e o método anestésico foi realizado de acordo com o método utilizado no centro¹⁶. Exames bioquímicos sanguíneos, exames ultrassônicos e histológicos foram realizados para avaliar modelos animais.

Protocolo

Os procedimentos para o cuidado e uso de animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Monitoramento de Animais de Laboratório de Guangdong. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, National Research Council, EUA). O procedimento cirúrgico é apresentado na Figura 1.

1. Preparação pré-operatória dos animais

1. Divida aleatoriamente 10 miniporcos machos de 3 meses de idade, pesando 30-35 kg, no grupo simulado (n = 5) e no grupo VGD (n = 5).
2. Avaliar as condições de saúde pré e pós-operatórias dos suínos utilizando o índice de massa corporal (IMC). Calcule o IMC da seguinte forma:
   IMC = peso corporal (kg)/(comprimento do corpo [cm] × comprimento do corpo [cm])
   NOTA: O comprimento do corpo é medido do nariz do porco até a base da cauda.
3. Jejuar os animais por 12 h antes da cirurgia para evitar a aspiração após a anestesia. Prepare aparelhos de anestesia e instrumentos cirúrgicos, incluindo uma máquina de anestesia, gás, drogas anestésicas, uma tubulação de anestesia, um laringoscópio especial e instrumentos cirúrgicos, um retentor de costelas, suturas, um afastador da tireoide, pinça cirúrgica, etc. Esterilizar todos os instrumentos a serem utilizados na cirurgia.

2. Preparação dos animais para a cirurgia

1. Pesar os animais e calcular a dose anestésica. Administrar por via intramuscular a mistura anestésica composta por 2 mg/kg de Tiletamina e Zolazepam 1:1, 0,2 mg/kg de diazepam e 0,02 mg/kg de atropina¹⁷. Utilizar fentanil (50 mg/kg) para alívio da dor intraoperatória³⁰.
2. Certifique-se de que um plano anestésico adequado seja alcançado e insira um cateter venoso de demora (20G) na veia marginal da orelha para estabelecer o acesso da orelha. Transfira o porco para a mesa de operação e coloque-o na posição supina. Imobilize os membros com ataduras e eleve a cabeça com uma cortina estéril.
   NOTA: O estado da anestesia foi monitorado pela fixação central do globo ocular, miose, perda do reflexo pupilar e perda do reflexo da dor.  A frequência cardíaca e a pressão arterial foram mantidas em um nível mais baixo do que a linha de base. O cirurgião deve monitorar a FC, a PA e outros parâmetros sob paralisia e aumentar a dose anestésica se a FC aumentar > 20% acima da linha de base.
3. Expor a epiglote e a glote usando um laringoscópio veterinário. Realize a intubação traqueal com um tubo de 7,0-7,5Fr e conecte-o ao circuito respiratório da anestesia.
   NOTA: O ventilador é utilizado para ventilação por pressão positiva contínua com volume corrente de 280 mL, relação inspiratória/expiratória 1:2, frequência respiratória 20 vezes/min e pressão expiratória final positiva (5 cm H₂O).
4. Injetar por via intravenosa brometo de vecurônio (0,1 mg/kg) para relaxar os músculos durante os procedimentos cirúrgicos e usar isoflurano a 2% para manter a anestesia a uma frequência respiratória de 16-20 bpm e um volume corrente de 10 mL/kg.
   NOTA: O vecurônio é administrado para garantir a profundidade adequada da anestesia em animais paralisados, especialmente porque a dose do medicamento de indução e do isoflurano está na extremidade inferior do recomendado.
5. Use pomada veterinária nos olhos do porco para evitar a secura durante a anestesia. Use cobertores elétricos para manter a temperatura corporal do porco em 38 °C ± 5 °C.
6. Use um eletrocardiograma para monitorar a frequência cardíaca, os níveis de oxigênio no sangue e a temperatura corporal.

3. Procedimentos cirúrgicos

1. Raspar a parede torácica esquerda e aplicar três rodadas alternadas de iodo a 0,7% e álcool a 75% para preparar assepticamente a área cirúrgica até o ângulo mandibular esquerdo, até o cordão umbilical, esquerda até a linha axilar posterior e direita até a frente axilar. Coloque uma cortina cirúrgica estéril ao redor da área cirúrgica.
2. Fazer uma incisão transversal de 7-10 cm com uma faca elétrica no terceiro espaço intercostal esquerdo e separar os tecidos subcutâneos camada por camada (Figura 2A). Retirar um segmento de 5-6 cm da terceira costela com tesoura óssea e expor a veia mamária interna por um afastador após exposição da terceira articulação costela-esternal (Figura 2B).
3. Localize a veia mamária interna junto com a artéria mamária interna esquerda no lado esquerdo do esterno. Realizar uma dissecção contundente da veia mamária interna com pinça vascular.
4. Realizar hemostasia por eletrocoagulação dos ramos da veia mamária interna esquerda com uma faca elétrica. Se a hemostasia estiver incompleta, use ligadura de fio de algodão para hemostasia. Ligue e marque as duas extremidades da veia enquanto ela está sendo colhida (Figura 2C).
5. Preparar solução salina normal de heparina adicionando 2 mL de solução de heparina sódica e 98 mL de solução salina normal. Após a remoção da veia, injete solução salina normal de heparina na veia para pré-tratamento (Figura 2D). Em seguida, coloque a veia em solução salina normal e mantenha-a para backup.
6. Faça uma incisão semelhante à descrita acima e remova a veia mamária interna no grupo simulado. Abra o pericárdio e, em seguida, feche a parede torácica no grupo simulado. Use a veia mamária interna do grupo simulado para controle patológico sem revascularização do miocárdio.
7. Faça uma incisão de ~ 7 cm com uma faca elétrica no pericárdio para expor o tronco da artéria coronária direita. Suspender o pericárdio e costurar na pele do lado ipsilateral com as suturas cirúrgicas 1-0 (Figura 2E). Separe o tronco da artéria coronária direita dos tecidos circundantes (Figura 2E).
8. Contornar a banda de bloqueio sob a extremidade proximal da artéria coronária direita isolada próxima à aorta com um gancho de arame e tratar o miocárdio com três ciclos de isquemia de 2 min e reperfusão de 5 min, apertando e relaxando a banda de bloqueio (Figura 2F). Monitorar a atividade elétrica do coração com o monitor de eletrocardiograma durante o pré-condicionamento de isquemia/reperfusão (Figura 2G).
   NOTA: Quando a artéria coronária direita está bloqueada, o eletrocardiograma mostra aumento da frequência cardíaca e elevação do segmento ST.
9. Aperte a banda para bloquear o fluxo sanguíneo coronário direito. Corte o epicárdio que cobre os vasos sanguíneos. Exponha a parede da artéria coronária e corte longitudinalmente com a ponta de uma lâmina cirúrgica contra o centro da parede anterior dos vasos sanguíneos.
10. Depois de cortar o lúmen, aumente a incisão com uma tesoura e coloque um shunt coronário. Insira uma extremidade do shunt com uma bobina na artéria coronária distal através da lágrima. Desviar o sangue nas artérias coronárias para o shunt coronário oco para garantir um campo operatório claro (Figura 2H).
11. Realizar uma sutura contínua end-to-side entre a veia mamária interna e o tronco coronariano direito com a sutura de polipropileno 7-0 (Figura 2I). No meio da aorta ascendente, ocluir a parede anterolateral esquerda da aorta ascendente com uma braçadeira de semi-oclusão.
12. Use uma lâmina cirúrgica para fazer uma pequena incisão na parede da aorta onde a adventícia foi cortada, insira a extremidade da cabeça do eixo deslizante na extremidade da cabeça do soco na cavidade aórtica através desta incisão, contraia o eixo deslizante para fora e a faca circular acima dele corta um pedaço da parede arterial. O bloco de tecido cortado pelo punch tem cerca de 3 mm de diâmetro (Figura 2J).
13. Retire o shunt. Realizar uma sutura contínua end-to-side entre a veia mamária interna e a parede aórtica com a sutura de polipropileno 6-0 (Figura 2K). Abra a braçadeira de semi-oclusão.
14. Registrar o fluxo de revascularização do miocárdio direito proximal ao local da anastomose usando ultrassonografia. Monitorar a atividade elétrica do coração usando o eletrocardiograma (Figura 2L).
15. Habite um tubo de drenagem temporário (Fr: 16) na cavidade torácica para permitir que o sangue e os fluidos drenem. Costure a incisão de pericárdio usando um fio de algodão 1-0 e feche o peito camada por camada (de dentro para fora: camada de pleura, camada muscular, camada de tecido subcutâneo, camada de pele) enquanto coloca penicilina (cerca de 0,5 g) em pó em cada camada. Remova o tubo de drenagem depois de costurar a incisão da pele usando um fio de algodão 1-0.

4. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Remova o tubo endotraqueal após os animais retornarem à respiração espontânea. O anestesiologista deve avaliar os sinais vitais do animal (por exemplo, frequência respiratória, frequência cardíaca, saturação de oxigênio, etc.) e remover o ECG depois que os animais acordarem e retornarem à atividade espontânea. Envie os animais de volta para a sala de alimentação e coloque os animais falsos em outro curral na sala de reprodução. Mantenha os animais aquecidos com um cobertor elétrico. Observe os animais a cada hora após a cirurgia (pelo menos 4 vezes).
2. Alimente o animal no dia seguinte à cirurgia. Adicione aspirina (200 mg) 2x ao dia por 7 dias à ração animal para prevenir a trombose pós-operatória e reduzir a dor da ferida.
   NOTA: Evite alimentar os animais no dia da cirurgia para evitar a aspiração.
3. Administrar o animal com uma injeção intramuscular de penicilina 1x ao dia por 7 dias consecutivos para prevenir a infecção pós-operatória (14.000 unidades por kg).

5. Exame ultra-sônico

1. Após a cirurgia de revascularização miocárdica, use uma manga de sonda ultrassônica estéril para envolver a sonda de matriz linear de alta frequência. Coloque a sonda na superfície do enxerto venoso.
2. Exiba o contorno do enxerto no modo de ultrassom bidimensional e, em seguida, mude para o modo Doppler colorido para detectar o fluxo sanguíneo no enxerto.

6. Coleta de tecido do enxerto venoso

1. Coletar 10 mL de amostra de sangue do circuito venoso da veia da orelha para testes bioquímicos. (Tabela 1). Centrifugar a amostra de sangue a 1.000 x g por 5 min e realizar testes bioquímicos com um analisador bioquímico automático.
2. Anestesiar o animal como descrito anteriormente. Após a confirmação da profundidade da anestesia, injete cloreto de potássio a 10% a 0,5mL/kg de peso corporal da veia marginal da orelha ou da veia do membro anterior. Em seguida, faça uma incisão esternal mediana de 10 cm com uma faca elétrica para colher o enxerto de veia 30 dias após a cirurgia. Fixe a posição do corpo como na etapa 2.2., e após a esterilização e colocação de uma cortina, faça uma incisão no esterno mediano para dividir o esterno. Durante a separação, evite os principais vasos sanguíneos e o coração e separe os vasos sanguíneos enxertados camada por camada.
3. Corte rapidamente os grandes vasos sanguíneos que se conectam ao coração, coloque o coração e a aorta ascendente em lascas de gelo e remova a ponte vascular do enxerto, a aorta conectada e a artéria coronária direita. Enxaguar todas as amostras com solução salina normal a 4 °C.
4. Pegue todo o vaso do enxerto de cerca de 3-4 cm de tamanho, divida-o em 4-5 partes iguais e transfira para tubos de criopreservação. Coloque rapidamente os tubos em nitrogênio líquido para congelar e mova-se para um freezer de temperatura ultrabaixa de -80 °C para armazenamento.
5. Para análise, enxaguar o enxerto com solução salina gelada a 0,9% e fixá-lo em solução de paraformaldeído a 4%. Mantenha uma proporção do tamanho do bloco de tecido para a solução fixadora de 1:10 e fixe o tecido por mais de 12 h.
6. Coloração das seções em 50 mL de solução aquosa de hematoxilina por 3 min. Separe as seções lavando com 50 mL de etanol de ácido clorídrico a 0,5% e 50 mL de água de amônia a 0,2% por 10 s cada.
7. Enxaguar com água corrente por 1 h e depois limpar em água destilada de molho por 3 min. Desidratar em etanol a 70% e 90% por 10 min cada. Coloque em 50 mL de solução de coloração de eosina alcoólica a 0,5% por 2-3 min.
8. Desidrate as seções coradas com etanol puro por 10 min e, em seguida, mergulhe em xileno puro por 10 min para tornar as amostras transparentes. Goteje as seções transparentes com cola neutra e cubra com uma tampa. Observe seções patológicas sob um microscópio de luz com ampliação de 40x.

Resultados

IMC e índices bioquímicos séricos
O IMC entre os grupos sham e VGD não foi significativamente diferente (sham vs. VGD, 22,05 kg/cm 2 ± 0,46 kg/cm 2 vs. 21,14 kg/cm 2 ± 0,39 kg/cm ², p = 0,46). Os resultados bioquímicos séricos estão listados na Tabela 1. Mudanças estatisticamente significativas entre os grupos foram encontradas em quatro índices bioquímicos, incluindo aspartato aminotransferase (AST, sham vs. VGD, 25,25 ...

Discussão

Neste estudo, descrevemos detalhadamente o protocolo de seleção de animais, preparo de instrumentos, procedimentos cirúrgicos e avaliação pós-operatória ao desenvolver um modelo de DVG induzida por CRM. Realizamos exame ultrassônico do enxerto venoso antes e após a cirurgia de revascularização miocárdica e exame histológico do enxerto 30 dias após a cirurgia. O fluxo sanguíneo na veia mamária interna foi normal antes da cirurgia de revascularização miocárdica, enquanto o fluxo retrógrado foi observado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aortic Punch	Medtronic Inc. , America	3.0mm, 3.5mm, 4.0mm	Used for proximal coronary bridge anastomosis
Automatic biochemical analyzer	IDEXX Laboratories, Inc. America	Catalyst One
Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit	LANDANGER, France
Cardiogram monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd	MEC-1000
Coronary Shunt	AXIUS	OF-1500, OF-2500, OF-3000	The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis.  The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis.
Defibrillator	MEDIANA	Mediana D500
Diazepam	Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China	H37023039	Narcotic inducer
Disposable manual electric knife	Covidien, America	E2516H
Electric negative pressure suction machine	Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd	YX932D
Esmolol	Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD	H20055990	Emergency drugs
Ice machine	Local suppliers, Guangzhou, China
Lidocaine	Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD	H51021662	Emergency drugs
Luxtec headlight system	Luxtec, America	AX-1375-BIF	Used for lighting fine parts during operation
Medical operation magnifier (glasses)	Germany Lista co, LTD	SuperVu Galilean 3.5×	Used for fine site operation during operation
Multi-function high-frequency electrotome	Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd	GD350-B
Nitrogen canister	Local suppliers, Guangzhou, China
Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture)	Johnson & Johnson, America	6-0, 7-0	Used to suture blood vessels.
Nonabsorbable suture (cotton thread)	Covidien, America	1-0	Used for skin and muscle tissue tugging
Open heart surgery instrument kit	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD
Propofol injection	Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD	H19990282	Anesthetic sedative
Refrigerator	Local suppliers, Guangzhou, China
Respiratory anesthesia machine for animal	Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China	R620-S1
Semi-occlusion clamp	Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd.	ZL1701RB	Temporarily cut off the aortic flow
vecuronium bromide	Richter, Hungary	JX20090127	Muscle relaxant
Veterinary ultrasound system	Royal Philips, Netherlands	CX50
Zoletil	Virbac, France	Zoletil 50	Animal narcotic