돼지 정맥 이식 질환 모델의 수립 및 평가

요약

이 프로토콜에서는 심폐 우회술 없이 왼쪽 흉벽의 작은 절개를 통해 새로운 돼지 정맥 우회술을 시행했습니다. 수술 후 병리학 연구가 수행되어 내막이 두꺼워지는 것으로 나타났습니다.

초록

정맥 이식 질환(VGD)은 관상동맥우회술(CABG) 실패의 주요 원인입니다. CABG-VGD의 대형 동물 모델은 질병 메커니즘의 조사 및 치료 전략의 개발에 필요합니다.

수술을 수행하기 위해 세 번째 늑간 공간을 통해 심실로 들어가 내부 유방 정맥을 조심스럽게 해부하고 생리 식염수에 담그십시오. 그런 다음 오른쪽 주요 관상 동맥을 허혈로 치료합니다. 표적 혈관을 절개하고, 션트 플러그를 배치하고, 이식 정맥의 말단부를 문합합니다. 상행 대동맥이 부분적으로 막히고 이식 정맥의 근위 끝이 천공 후 문합됩니다. 이식편 정맥의 개통을 확인하고 근위 우측 관상동맥을 결찰합니다.

CABG 수술은 혈관 이식편으로 사용하기 위해 왼쪽 내부 유방 정맥을 적출하기 위해 미니피그에서 수행됩니다. 혈청 생화학 검사는 수술 후 동물의 생리적 상태를 평가하는 데 사용됩니다. 초음파 검사는 이식 혈관의 근위부, 중간 및 말단부가 막히지 않았음을 보여줍니다. 수술 모델에서, CABG 수술 후 조직학적 검사에서 이식편 내의 난류 혈류가 관찰되고, 내막 증식과 관련된 정맥 이식편 협착증이 이식편에서 관찰된다. 여기에서 연구는 반복 가능한 CABG 유도 VGD 모델을 구축하기 위한 자세한 수술 절차를 제공합니다.

서문

최근 몇 년 동안 관상 동맥 심장 질환 사망률이 크게 감소했지만, 미국 중년 성인의 절반이 매년 허혈성 심장 관련 증상을 나타내며 노인의 1/3이 관상 동맥 심장 질환으로 사망합니다¹. 관상동맥우회술(CABG)은 심근 허혈을 개선하는 효과적인 수술 방식이며, 더 중요한 것은 다혈관 관상동맥 질환 치료를 위한 대체할 수 없는 수술 방식입니다². 그러나 시간이 지남에 따라 혈관 이식편은 염증, 내막 증식 및 진행성 죽상동맥경화증을 일으켜 정맥 이식 실패 또는 정맥 이식 질환(VGD)^을 유발하는 것으로 알려져 있습니다3. CABG 후 환자에서 재협착이 발생하면 경우에 따라 병든 혈관만 교체할 수 있다². 고령 환자와 추가된 동반 질환으로 인해 관상동맥 우회술을 다시 하는 것이 상당히 어렵습니다. 이식된 혈관과 관련된 병리학적 문제를 지연시키거나 조절하는 것은 해결해야 할 시급한 문제이다. CABG-VGD의 대형 동물 모델은 질병 메커니즘의 조사 및 치료 전략의 개발에 필요합니다. 연구자들은 생쥐⁴, 쥐⁵, 토끼^6, 돼지⁷과 같은 크고 작은 동물에서 동물 VGD 모델을 성공적으로 확립했다. 작은 동물에 비해 돼지와 같은 큰 동물은 인간과 유사한 해부학적 구조와 생리학적 특성을 가지고 있으며 수명이 더 깁니다 ^8,9. 따라서 대형 동물은 정맥 이식편 질환의 장기적인 병리학 적 변화를 탐구하고 약물 또는 장치의 전임상 시험에 더 적합합니다. 우리와 우리의 협력 팀은 돼지 심부전 모델을 확립하기 위해 수술 기법을 성공적으로 적용했으며 이 모델의 심장 병리학적 변화를 설명했습니다¹⁰.

CABG 수술은 임상에서 표준화되어 있지만, VGD 동물 모델 구축에 적용하면 종 간의 차이, 동물 장비 및 시설 확보, 동물 외과 수술, 동물 급여 및 간호 등이 연구자에게 큰 과제입니다. 임상 실습에서와 같이, VGD 동물 모델을 확립하기 위해 사용되는 CABG 수술에 대한 접근법은 정중선 흉골 절개술¹¹ 및 좌측 측면 개흉술¹²을 포함한다. 정중선 흉골 절개술이 더 일반적으로 사용됩니다^13,14. 그러나 이 접근 방식은 인간과 동물 모두에게 높은 위험을 초래합니다. Thankam et al.이 보고한 연구에서 모델링에 사용된 돼지 6마리 중 2마리가 수술 중 사망했습니다¹⁵. 모델 사망률이 높으면 연구 비용이 증가하고 결과의 정확도에 영향을 미칩니다. 한 연구에 따르면 돼지¹¹에서 CABG 유발 VGD를 확립하기 위해 왼쪽 흉벽 절개가 가능하다는 것이 밝혀졌습니다. 여기에서 본 연구는 미니피그에서 CABG 유도 VGD 모델에 대한 재현 가능한 수술을 확립하고 이 모델의 표현형을 평가하기 위한 단계별 프로토콜을 설명하는 것을 목표로 합니다. 실험 프로토콜은 심장 수술 및 마취 팀이 공동으로 설계했습니다. 왼쪽 제3늑간공간에 대한 수술적 접근은 수술 전 실험실에 있는 다른 미니피그의 사체에 따라 결정하였으며, 마취법은 중앙에서 사용한 방법에 따라 수행하였다(¹⁶). 동물모델을 평가하기 위해 혈액생화학적 검사, 초음파 검사, 조직검사 등을 실시하였다.

프로토콜

실험실 동물의 관리 및 사용 절차는 광동 실험실 동물 모니터링 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, National Research Council, USA)에 따라 수행하였다. 수술 절차는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 동물의 수술 전 준비

1. 체중이 30-35kg인 3개월 된 수컷 미니돼지 10마리를 가짜 그룹(n = 5)과 VGD 그룹(n = 5)으로 무작위로 나눕니다.
2. 체질량 지수(BMI)를 사용하여 돼지의 수술 전후 건강 상태를 평가합니다. 다음과 같이 BMI를 계산합니다.
   BMI = 체중(kg)/(몸길이[cm] ×몸길이[cm])
   참고: 몸 길이는 돼지의 코에서 꼬리 기저부까지 측정됩니다.
3. 마취 후 흡인을 피하기 위해 수술 전 12시간 동안 동물을 금식시킵니다. 마취기, 가스, 마취제, 마취관, 특수 후두경, 수술 도구, 갈비뼈 리테이너, 봉합사, 갑상선 견인기, 수술용 겸자 등을 포함한 마취기구 및 수술 기구를 준비합니다. 수술에 사용할 모든 기구를 소독하십시오.

2. 수술을 위한 동물 준비

1. 동물의 무게를 측정하고 마취 용량을 계산하십시오. 2mg/kg의 1:1 틸레타민 및 졸라제팜, 0.2mg/kg 디아제팜 및 0.02mg/kg의 아트로핀으로 구성된 마취 혼합물을 근육내 투여합니다¹⁷. 수술 중 통증 완화를 위해 펜타닐(50mg/kg)을 사용하십시오³⁰.
2. 적절한 마취면이 이루어졌는지 확인하고 유치 정맥 카테터(20G)를 가장자리 귀 정맥에 삽입하여 귀에 접근합니다. 돼지를 수술대 위로 옮기고 앙와위 자세로 놓습니다. 붕대로 팔다리를 고정시키고 멸균 드레이프로 머리를 들어 올리십시오.
   참고: 마취 상태는 안구의 중앙 고정, 동공 축소, 동공 반사 상실 및 통증 반사 상실로 모니터링되었습니다.  심박수 및 혈압은 기준선보다 낮은 수준으로 유지되었다. 외과의는 마비 상태에서 HR, BP 및 기타 매개변수를 모니터링하고 HR이 기준선보다 20% > 증가하면 마취 용량을 늘려야 합니다.
3. 수의학 후두경을 사용하여 후두개와 성문을 노출시킵니다. 7.0-7.5Fr 튜브로 기관 삽관을 수행하고 마취 호흡 회로에 연결하십시오.
   참고: 인공호흡기는 일회 호흡량 280mL, 흡기/호기 비율 1:2, 호흡수 20회/분, 호기말 양압(5cm H₂O)의 연속 양압 환기에 사용됩니다.
4. 브롬화 베쿠로늄(0.1mg/kg)을 정맥 주사하여 수술 중 근육을 이완시키고 2% 이소플루란을 사용하여 호흡수 16-20bpm, 일회 호흡량 10mL/kg으로 마취를 유지합니다.
   참고: Vecuronium은 마비된 동물에서 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 제공되며, 특히 유도 약물과 이소플루란의 용량이 권장량의 하단에 있기 때문에 더욱 그렇습니다.
5. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 돼지의 눈에 수의사 연고를 사용하십시오. 전기 담요를 사용하여 돼지의 체온을 38 °C ± 5 °C로 유지하십시오.
6. 심전도를 사용하여 심박수, 혈중 산소 수치 및 체온을 모니터링합니다.

3. 수술 절차

1. 왼쪽 흉벽을 면도하고 0.7% 요오드와 75% 알코올을 번갈아 가며 3회 도포하여 수술 부위를 왼쪽 하악 각도까지, 탯줄까지, 왼쪽에서 후방 겨드랑이 라인까지, 오른쪽에서 겨드랑이 앞까지 무균 상태로 준비합니다. 수술 부위 주위에 멸균 수술용 드레이프를 놓습니다.
2. 세 번째 왼쪽 늑간 공간에 전기 칼로 7-10cm 가로 절개를하고 피하 조직을 층별로 분리합니다 (그림 2A). 뼈 가위로 세 번째 갈비뼈의 5-6cm 부분을 제거하고 세 번째 갈비뼈-흉골 관절을 노출시킨 후 견인기로 내부 유방 정맥을 노출시킵니다(그림 2B).
3. 흉골 왼쪽의 왼쪽 내유선과 함께 내정맥을 찾습니다. 혈관 겸자로 내부 유방 정맥의 무딘 절제술을 수행하십시오.
4. 전기 나이프로 왼쪽 내부 유방 정맥의 가지를 전기 응고시켜 지혈을 수행하십시오. 지혈이 불완전한 경우 지혈을 위해 면사 결찰을 사용하십시오. 채취하는 동안 정맥의 두 끝을 Ligate하고 표시합니다(그림 2C).
5. 헤파린 나트륨 용액 2mL와 생리식염수 98mL를 첨가하여 헤파린 생리식염수를 준비합니다. 정맥을 제거한 후 전처리를 위해 헤파린 생리 식염수를 정맥에 주입합니다(그림 2D). 그런 다음 정맥을 생리 식염수에 넣고 백업을 위해 보관하십시오.
6. 위에서 설명한 것과 유사한 절개를하고 가짜 그룹의 내부 유방 정맥을 제거하십시오. 심낭을 열고 가짜 그룹의 흉벽을 닫습니다. 관상 동맥 우회술없이 병리학 적 조절을 위해 가짜 그룹의 내부 유방 정맥을 사용하십시오.
7. 오른쪽 관상 동맥 줄기를 노출시키기 위해 심낭에 전기 칼로 ~ 7cm 절개를합니다. 심낭을 매달고 1-0 수술 봉합사로 동측 피부에 봉합합니다(그림 2E). 오른쪽 관상 동맥 트렁크를 주변 조직과 분리합니다 (그림 2E).
8. 와이어 후크로 대동맥 근처의 고립된 우측 관상동맥의 근위 말단 아래에 있는 차단 밴드를 우회하고 차단 밴드를 조이고 이완하여 2분 허혈 및 5분 재관류의 3주기로 심근을 치료합니다(그림 2F). 허혈/재관류 전처리 동안 심전도 모니터로 심장의 전기적 활동을 모니터링합니다(그림 2G).
   참고: 오른쪽 관상동맥이 막히면 심전도에서 심박수와 ST 분절 상승이 증가합니다.
9. 밴드를 조여 올바른 관상 동맥 혈류를 차단합니다. 혈관을 덮고있는 심 외막을 자릅니다. 관상동맥벽을 노출시키고 수술용 칼날 끝으로 혈관 전벽 중앙을 세로로 자릅니다.
10. 내강을 자른 후 가위로 절개 부위를 확대하고 관상 동맥 션트를 놓습니다. 코일이 있는 션트의 한쪽 끝을 파열을 통해 원위 관상동맥에 삽입합니다. 관상동맥의 혈액을 속이 빈 관상동맥 션트로 션트하여 명확한 수술 영역을 확보합니다(그림 2H).
11. 7-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 내부 유방 정맥과 오른쪽 관상 동맥 줄기 사이에 종단 간 연속 봉합을 수행합니다(그림 2I). 상행 대동맥의 중간에서 상행 대동맥의 왼쪽 전외측 벽을 반 폐색 클램프로 폐색합니다.
12. 수술용 칼날을 사용하여 외막이 절단된 대동맥 벽에 작은 절개를 하고, 이 절개를 통해 펀치의 헤드 엔드에 있는 슬라이딩 샤프트의 헤드 엔드를 대동맥강에 삽입하고, 슬라이딩 샤프트를 바깥쪽으로 수축시키고, 그 위의 원형 나이프는 동맥 벽의 일부를 잘라냅니다. 펀치에 의해 잘라낸 조직 블록은 직경이 약 3mm입니다(그림 2J).
13. 션트를 당겨 빼냅니다. 6-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 내부 유방 정맥과 대동맥 벽 사이에 종단 간 연속 봉합을 수행합니다(그림 2K). 세미 오클루전 클램프를 엽니다.
14. 초음파를 사용하여 문합 부위에 근접한 우측 관상 동맥 줄기의 우회 흐름을 기록합니다. 심전도를 사용하여 심장의 전기적 활동을 모니터링합니다(그림 2L).
15. 임시 배액관(Fr: 16)을 흉강 내로 들여보내 혈액과 체액이 배출되도록 합니다. 1-0 면사를 사용하여 심낭 절개를 꿰매고 각 층에 페니실린 (약 0.5g) 분말을 넣으면서 가슴을 층별로 (안쪽에서 바깥쪽으로 : 흉막층, 근육층, 피하 조직층, 피부층) 닫습니다. 1-0 면사를 사용하여 피부 절개 부위를 꿰매 후 배액관을 제거합니다.

4. 수술 후 관리

1. 동물이 자발 호흡으로 돌아온 후 기관 내 튜브를 제거하십시오. 마취과 의사는 동물의 활력(예: 호흡수, 심박수, 산소 포화도 등)을 평가하고 동물이 깨어나 자발적인 활동으로 돌아온 후 ECG를 제거해야 합니다. 동물들을 먹이실로 돌려보내고 가짜 동물들을 사육실의 다른 우리에 넣습니다. 전기 담요로 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 수술 후 매 시간마다 동물을 관찰하십시오 (적어도 4 회).
2. 수술 다음날 동물에게 먹이를주십시오. 아스피린(200mg)을 동물 사료에 7일 동안 매일 2회 첨가하여 수술 후 혈전증을 예방하고 상처 통증을 줄입니다.
   알림: 흡인을 방지하기 위해 수술 당일 동물에게 먹이를 주지 마십시오.
3. 수술 후 감염을 예방하기 위해 연속 7 일 동안 매일 1 회 페니실린을 근육 주사하여 동물에게 투여하십시오 (kg 당 14,000 단위).

5. 초음파 검사

1. CABG 수술 후 멸균 초음파 프로브 슬리브를 사용하여 고주파 선형 어레이 프로브를 감쌉니다. 정맥 이식편 표면에 프로브를 놓습니다.
2. 2차원 초음파 모드에서 이식편의 윤곽을 표시한 다음 컬러 도플러 모드로 전환하여 이식편의 혈류를 감지합니다.

6. 정맥 이식 조직 수집

1. 생화학적 검사를 위해 귀 정맥의 정맥 회로에서 혈액 샘플 10mL를 수집합니다. (표 1). 혈액 샘플을 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 자동 생화학 분석기로 생화학적 테스트를 수행합니다.
2. 앞에서 설명한대로 동물을 마취하십시오. 마취 깊이가 확인되면 귀 변연부 정맥 또는 앞다리 정맥에서 10% 염화칼륨 0.5mL/kg 체중을 주입합니다. 그런 다음 수술 30일 후 전기칼로 10cm 중앙값 흉골 절개를 하여 정맥 이식편을 채취합니다. 2.2 단계와 같이 신체 위치를 고정하고 멸균 및 드레이프 배치 후 흉골 중앙 절개를하여 흉골을 분할합니다. 분리하는 동안 주요 혈관과 심장을 피하고 이식 된 혈관을 층별로 분리하십시오.
3. 심장에 연결된 큰 혈관을 빠르게 잘라내고 심장과 상행 대동맥을 얼음 조각 위에 놓고 이식편 혈관 다리, 연결된 대동맥 및 오른쪽 관상 동맥을 제거합니다. 모든 샘플을 4°C에서 생리식염수로 헹굽니다.
4. 약 3-4cm 크기의 이식편 용기 전체를 취하여 4-5등분으로 나누고 냉동보존관으로 옮깁니다. 튜브를 액체 질소에 빠르게 넣어 급속 동결하고 보관을 위해 -80°C 초저온 냉동고로 이동합니다.
5. 분석을 위해 얼음처럼 차가운 0.9 % 식염수로 이식편을 헹구고 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 고정하십시오. 조직 블록 크기 대 고정 용액의 비율을 1:10으로 유지하고 조직을 12시간 이상 고정합니다.
6. 헤마톡실린 수용액 50mL에 절편을 3분 동안 염색합니다. 0.5% 염산 에탄올 50mL와 0.2% 암모니아수 50mL로 각각 10초 동안 세척하여 절편을 분리합니다.
7. 흐르는 물로 1시간 동안 헹군 다음 증류수에 3분 동안 담가 세척합니다. 70 % 및 90 % 에탄올에서 각각 10 분 동안 탈수합니다. 0.5% 알코올 에오신 염색 용액 50 mL에 넣고 2-3분 동안 담가둡니다.
8. 염색된 부분을 순수한 에탄올로 10분 동안 탈수한 다음 순수한 자일렌에 10분 동안 담가 샘플을 투명하게 만듭니다. 투명 부분을 중성 접착제로 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다. 40x 배율의 광학 현미경으로 병리학적 부분을 관찰합니다.

결과

BMI 및 혈청 생화학 지표
가짜 그룹과 VGD 그룹 간의 BMI는 유의하게 다르지 않았습니다(가짜 대 VGD, 22.05kg/cm2 ± 0.46kg/cm2 대 21.14kg/cm2 ± 0.39kg/^cm2, p = 0.46). 혈청 생화학적 결과는 표 1에 열거되어 있다. 그룹 간 통계적으로 유의미한 변화는 아스파르테이트 아미노전이효소(AST, 가짜 대 VGD, 25.25 IU/L ± 1.88 IU/L 대 31.5 IU/L ± 2.58 IU/L), 혈청 빌?...

토론

본 연구에서는 CABG 유도 VGD 모델 개발 시 동물 선택, 기구 준비, 수술 절차, 수술 후 평가에 대한 프로토콜을 자세히 설명했습니다. CABG 수술 전후의 정맥 이식편에 대한 초음파 검사와 수술 후 30일 후에 이식편의 조직학적 검사를 시행하였다. 내부 유방 정맥의 혈류는 CABG 수술 전에 정상이었고, 내부 유방 정맥의 이식편에서는 역행 흐름이 관찰되었습니다. 가짜 수술군과 비교했을 때, 수술군 동물...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aortic Punch	Medtronic Inc. , America	3.0mm, 3.5mm, 4.0mm	Used for proximal coronary bridge anastomosis
Automatic biochemical analyzer	IDEXX Laboratories, Inc. America	Catalyst One
Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit	LANDANGER, France
Cardiogram monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd	MEC-1000
Coronary Shunt	AXIUS	OF-1500, OF-2500, OF-3000	The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis.  The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis.
Defibrillator	MEDIANA	Mediana D500
Diazepam	Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China	H37023039	Narcotic inducer
Disposable manual electric knife	Covidien, America	E2516H
Electric negative pressure suction machine	Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd	YX932D
Esmolol	Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD	H20055990	Emergency drugs
Ice machine	Local suppliers, Guangzhou, China
Lidocaine	Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD	H51021662	Emergency drugs
Luxtec headlight system	Luxtec, America	AX-1375-BIF	Used for lighting fine parts during operation
Medical operation magnifier (glasses)	Germany Lista co, LTD	SuperVu Galilean 3.5×	Used for fine site operation during operation
Multi-function high-frequency electrotome	Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd	GD350-B
Nitrogen canister	Local suppliers, Guangzhou, China
Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture)	Johnson & Johnson, America	6-0, 7-0	Used to suture blood vessels.
Nonabsorbable suture (cotton thread)	Covidien, America	1-0	Used for skin and muscle tissue tugging
Open heart surgery instrument kit	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD
Propofol injection	Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD	H19990282	Anesthetic sedative
Refrigerator	Local suppliers, Guangzhou, China
Respiratory anesthesia machine for animal	Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China	R620-S1
Semi-occlusion clamp	Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd.	ZL1701RB	Temporarily cut off the aortic flow
vecuronium bromide	Richter, Hungary	JX20090127	Muscle relaxant
Veterinary ultrasound system	Royal Philips, Netherlands	CX50
Zoletil	Virbac, France	Zoletil 50	Animal narcotic