Создание и оценка модели трансплантатной болезни вен свиней

Резюме

В этом протоколе новое шунтирование вены свиньи выполнялось через небольшой разрез в левой грудной стенке без искусственного кровообращения. Было проведено послеоперационное патологоанатомическое исследование, которое показало утолщение интимы.

Аннотация

Болезнь венозного трансплантата (ВГД) является основной причиной неудачи аортокоронарного шунтирования (АКШ). Большие животные модели АКШ-ВГД необходимы для исследования механизмов заболевания и разработки терапевтических стратегий.

Для проведения операции мы входим в сердечную камеру через третье межреберье, аккуратно рассекаем внутреннюю молочную вену и погружаем ее в обычный физиологический раствор. Затем правая главная коронарная артерия лечится от ишемии. Сосуд-мишень разрезают, устанавливают шунтирующую пробку и анастомозируют дистальный конец вены трансплантата. Восходящая аорта частично блокируется, а проксимальный конец вены трансплантата после перфорации анастомозируется. Проводится проверка проходимости трансплантатной вены и перевязка проксимальной правой коронарной артерии.

Операция АКШ проводится у мини-свиней для забора левой внутренней молочной вены для использования в качестве сосудистого трансплантата. Сывороточные биохимические тесты используются для оценки физиологического состояния животных после операции. Ультразвуковое исследование показывает, что проксимальный, средний и дистальный конец сосуда трансплантата не закупорены. В хирургической модели турбулентный кровоток в трансплантате наблюдается при гистологическом исследовании после операции АКШ, а в трансплантате наблюдается стеноз венозного трансплантата, связанный с гиперплазией интимы. В исследовании представлены подробные хирургические процедуры для создания повторяемой модели VGD, индуцированной АКШ.

Введение

Хотя смертность от ишемической болезни сердца значительно снизилась в последние годы, у половины взрослых среднего возраста в Соединенных Штатах ежегодно развиваются симптомы ишемической болезни сердца, а треть пожилых людей умирает от ишемической болезни сердца¹. Аортокоронарное шунтирование (АКШ) является эффективным хирургическим методом для улучшения ишемии миокарда и, что более важно, незаменимым хирургическим методом для лечения многососудистой ишемической болезни сердца². Однако со временем у сосудистых трансплантатов развивается воспаление, гиперплазия интимы и прогрессирующий атеросклероз, что, как известно, приводит к отторжению венозного трансплантата или заболеванию венозного трансплантата (VGD)³. У пациентов после АКШ, если возникает рестеноз, в некоторых случаях может быть заменен только больной кровеносный сосуд². Пожилые пациенты и дополнительные сопутствующие заболевания затрудняют повторное аортокоронарное шунтирование. Отсрочка или контроль патологических проблем, связанных с пересаженными кровеносными сосудами, является неотложной проблемой, которую необходимо решить. Большие животные модели АКШ-ВГД необходимы для исследования механизмов заболевания и разработки терапевтических стратегий. Исследователи успешно установили модели VGD у мелких и крупных животных, таких как мыши⁴, крысы⁵, кролики⁶ и свиньи⁷. По сравнению с мелкими животными крупные животные, такие как свиньи, имеют анатомическое строение и физиологические характеристики, сходные с человеческими, и имеют более длительную продолжительность жизни ^8,9. Таким образом, крупные животные больше подходят для изучения отдаленных патологических изменений при венозной трансплантатной болезни и для доклинических испытаний лекарств или устройств. Мы и наша сотрудничающая команда успешно применили хирургические методы для создания модели сердечной недостаточности свиней и описали сердечные патологические изменения в этой модели¹⁰.

Хирургия АКШ была стандартизирована в клинической практике, но когда она применяется к созданию моделей животных VGD, различия между видами, приобретение оборудования и средств для животных, хирургические операции на животных, а также кормление и уход за животными являются огромными проблемами для исследователей. Как и в клинической практике, подходы к хирургии АКШ, используемые для создания моделей VGD на животных, включают срединную стернотомию¹¹ и левую боковую торакотомию¹². Чаще используется срединная стернотомия^13,14. Однако такой подход сопряжен с высокими рисками как для людей, так и для животных. В исследовании, опубликованном Thankam et al., две из шести свиней, использованных для моделирования, умерли во время операции¹⁵. Высокая модельная смертность увеличивает затраты на исследования и влияет на точность результатов. Ранее исследование показало, что разрез левой грудной стенки возможен, чтобы установить АКШ-индуцированную VGD у^{свиней 11}. Здесь это исследование направлено на описание пошагового протокола для создания воспроизводимой операции для модели VGD, индуцированной АКШ, у мини-пигов, и для оценки фенотипа этой модели. Экспериментальный протокол был совместно разработан кардиохирургической и анестезиологической бригадами. Хирургический подход к левому третьему межреберью определяли по трупам других минипигов в лаборатории перед операцией, а метод анестезии проводили по методу, применяемому в центре¹⁶. Для оценки моделей животных были проведены биохимические анализы крови, ультразвуковое исследование и гистологическое исследование.

протокол

Процедуры ухода и использования лабораторных животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Гуандунского института мониторинга лабораторных животных. Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (8-е изд., 2011 г., Национальный исследовательский совет, США). Хирургическая процедура показана на рисунке 1.

1. Предоперационная подготовка животных

1. Случайным образом разделите 10 3-месячных мини-поросят-самцов весом 30-35 кг на фиктивную группу (n = 5) и группу VGD (n = 5).
2. Оцените предоперационное и послеоперационное состояние здоровья свиней, используя индекс массы тела (ИМТ). Рассчитайте ИМТ следующим образом:
   ИМТ = масса тела (кг)/(длина тела [см] × длина тела [см])
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длина тела измеряется от носа свиньи до основания хвоста.
3. Постите животных в течение 12 ч перед операцией, чтобы избежать аспирации после анестезии. Подготовьте анестезиологические приборы и хирургические инструменты, включая наркозный аппарат, газ, анестезирующие препараты, анестезиологический трубопровод, специальный ларингоскоп и хирургические инструменты, реберный фиксатор, швы, ретрактор щитовидной железы, хирургические щипцы и т. д. Стерилизуйте все инструменты, которые будут использоваться в операции.

2. Подготовка животных к операции

1. Взвесьте животных и рассчитайте дозу анестетика. Внутримышечно вводят анестезирующую смесь, содержащую 2 мг/кг тилетамина и золазепама 1:1, 0,2 мг/кг диазепама и 0,02 мг/кг атропина¹⁷. Используйте фентанил (50 мг / кг) для интраоперационного обезболивания³⁰.
2. Убедитесь, что достигнута надлежащая плоскость анестезии, и вставьте постоянный венозный катетер (20G) в маргинальную ушную вену, чтобы установить доступ к уху. Переложите поросенка на операционный стол и поставьте ее в положение лежа на спине. Обездвижить конечности бинтами и приподнять голову стерильной драпировкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние анестезии контролировалось центральной фиксацией глазного яблока, миозом, потерей зрачкового рефлекса и потерей болевого рефлекса.  Частота сердечных сокращений и артериальное давление поддерживались на более низком уровне, чем исходный уровень. Хирург должен контролировать ЧСС, АД и другие параметры при параличе и увеличивать дозу анестетика, если ЧСС увеличивается > 20% по сравнению с исходным уровнем.
3. Обнажают надгортанник и голосовую щель с помощью ветеринарного ларингоскопа. Выполните интубацию трахеи с помощью трубки 7,0-7,5Fr и подключите ее к дыхательному контуру анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат искусственной вентиляции легких используется для непрерывной вентиляции с положительным давлением с дыхательным объемом 280 мл, соотношением вдох/выдох 1:2, частотой дыхания 20 раз/мин и положительным давлением в конце выдоха (5 см H₂O).
4. Внутривенно вводят векурония бромид (0,1 мг / кг) для расслабления мышц во время хирургических процедур и используют 2% изофлуран для поддержания анестезии при частоте дыхания 16-20 ударов в минуту и дыхательном объеме 10 мл / кг.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Векуроний назначают для обеспечения адекватной глубины анестезии у парализованных животных, тем более что доза индукционного препарата и изофлурана находится на нижнем уровне рекомендуемой.
5. Используйте ветеринарную мазь на глазах свиньи, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Используйте электрические одеяла, чтобы поддерживать температуру тела свиньи на уровне 38 °C ± 5 °C.
6. Используйте электрокардиограмму для контроля частоты сердечных сокращений, уровня кислорода в крови и температуры тела.

3. Хирургические процедуры

1. Сбрейте левую грудную стенку и нанесите три чередующихся раунда 0,7% йода и 75% спирта, чтобы асептически подготовить операционную область до левого нижнечелюстного угла, вниз до пуповины, слева до задней подмышечной линии и справа до подмышечной впадины. Поместите стерильную хирургическую простыню вокруг операционной области.
2. Сделайте электроножом поперечный разрез 7-10 см в третьем левом межреберье и послойно отделите подкожные ткани (рисунок 2А). Костными ножницами удаляют 5-6-сантиметровый сегмент третьего ребра и втягивающим устройством обнажают внутреннюю молочную вену после обнажения третьего реберно-стернального сустава (рис. 2Б).
3. Найдите внутреннюю молочную вену вместе с левой внутренней грудной артерией на левой стороне грудины. Выполняют тупое рассечение внутренней молочной вены сосудистыми щипцами.
4. Выполняют гемостаз путем электрокоагуляции ветвей левой внутренней молочной вены электрическим ножом. Если гемостаз неполный, используйте перевязку хлопчатобумажной нитью для гемостаза. Перевязывайте и отметьте два конца вены во время забора (рис. 2C).
5. Приготовьте физиологический раствор гепарина, добавив 2 мл раствора гепарина натрия и 98 мл физиологического раствора. После удаления вены введите физиологический раствор гепарина в вену для предварительной обработки (рис. 2D). Затем поместите вену в физиологический раствор и сохраните ее для резервного копирования.
6. Сделайте аналогичный разрез, как описано выше, и удалите внутреннюю молочную вену в бутафорской группе. Вскрывают перикард, затем закрывают грудную стенку в фиктивной группе. Используйте внутреннюю молочную вену фиктивной группы для патологического контроля без аортокоронарного шунтирования.
7. Сделайте разрез ~ 7 см электрическим ножом на перикарде, чтобы обнажить ствол правой коронарной артерии. Подвешивают перикард и пришивают кожу с ипсилатеральной стороны хирургическими швами 1-0 (рис. 2Е). Отделите ствол правой коронарной артерии от окружающих тканей (рис. 2E).
8. Обойдите блокирующую ленту под проксимальным концом изолированной правой коронарной артерии возле аорты с помощью проволочного крючка и обработайте миокард тремя циклами 2-минутной ишемии и 5-минутной реперфузией, затягивая и расслабляя блокирующую ленту (рис. 2F). Контролируйте электрическую активность сердца с помощью монитора электрокардиограммы во время предварительного кондиционирования ишемии / реперфузии (рис. 2G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда правая коронарная артерия заблокирована, электрокардиограмма показывает повышенную частоту сердечных сокращений и подъем сегмента ST.
9. Затяните бандаж, чтобы заблокировать правильный коронарный кровоток. Разрежьте эпикард, покрывающий кровеносные сосуды. Обнажите стенку коронарной артерии и разрежьте продольно кончиком хирургического лезвия о центр передней стенки кровеносных сосудов.
10. После разрезания просвета увеличьте разрез ножницами и установите коронарный шунт. Вставьте один конец шунта с катушкой в дистальную коронарную артерию через разрыв. Шунтируйте кровь из коронарных артерий в полый коронарный шунт, чтобы обеспечить чистое операционное поле (рис. 2H).
11. Выполните непрерывный шов между внутренней молочной веной и правым коронарным стволом с помощью полипропиленового шва 7-0 (рис. 2I). В середине восходящей аорты окклюзируют левую переднебоковую стенку восходящей аорты полуокклюзионным зажимом.
12. Используйте хирургическое лезвие, чтобы сделать небольшой разрез в стенке аорты, где была разрезана адвентиция, вставьте головной конец скользящего стержня на головном конце пуансона в полость аорты через этот разрез, сузьте скользящий стержень наружу, а циркулярный нож над ним отрежет кусок артериальной стенки. Тканевый блок, вырезанный пуансоном, имеет диаметр около 3 мм (рис. 2J).
13. Вытащите шунт. Выполните непрерывный шов между внутренней молочной веной и стенкой аорты полипропиленовым швом 6-0 (рис. 2K). Откройте полуокклюзионный зажим.
14. Записывают шунтирование ствола правой коронарной артерии проксимальнее места анастомоза с помощью УЗИ. Контролируйте электрическую активность сердца с помощью электрокардиограммы (рис. 2L).
15. Вставьте временную дренажную трубку (Fr: 16) в грудную полость, чтобы кровь и жидкости могли стекать. Сшейте разрез перикарда хлопчатобумажной нитью 1-0 и закройте грудную клетку слой за слоем (изнутри наружу: слой плевры, мышечный слой, слой подкожной клетчатки, слой кожи), помещая на каждый слой порошок пенициллина (около 0,5 г). Снимите дренажную трубку после зашивания разреза кожи с помощью хлопчатобумажной нити 1-0.

4. Послеоперационный уход

1. Удаляют эндотрахеальную трубку после того, как животные вернутся к спонтанному дыханию. Анестезиолог должен оценить жизненно важные показатели животного (например, частоту дыхания, частоту сердечных сокращений, насыщение кислородом и т. д.) и удалить ЭКГ после того, как животные проснутся и вернутся к спонтанной активности. Отправьте животных обратно в комнату для кормления и поместите фиктивных животных в другой загон в комнате для разведения. Держите животных в тепле электрическим одеялом. Наблюдайте за животными каждый час после операции (не менее 4 раз).
2. Кормите животное на следующий день после операции. Добавляйте аспирин (200 мг) 2 раза в день в течение 7 дней в корм для животных, чтобы предотвратить послеоперационный тромбоз и уменьшить боль в ране.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте кормления животных в день операции, чтобы предотвратить аспирацию.
3. Вводите животному внутримышечную инъекцию пенициллина 1 раз в день в течение 7 дней подряд, чтобы предотвратить послеоперационную инфекцию (14 000 единиц на кг).

5. Ультразвуковое исследование

1. После операции АКШ используйте стерильный рукав ультразвукового зонда, чтобы обернуть высокочастотный линейный датчик. Поместите зонд на поверхность венозного трансплантата.
2. Отобразите контур трансплантата в режиме двумерного ультразвука, затем перейдите в режим цветного допплера, чтобы обнаружить кровоток в трансплантате.

6. Забор ткани венозного трансплантата

1. Соберите 10 мл образца крови из венозного контура ушной вены для биохимического тестирования. (Таблица 1). Центрифугируйте образец крови в концентрации 1000 x g в течение 5 минут и проведите биохимические тесты с помощью автоматического биохимического анализатора.
2. Обезболивайте животное, как описано ранее. После подтверждения глубины анестезии вводят 10% хлорид калия 0,5 мл / кг массы тела из краевой вены уха или вены передних конечностей. Затем сделайте 10-сантиметровый срединный разрез грудины электрическим ножом, чтобы собрать трансплантат вены через 30 дней после операции. Зафиксируйте положение тела, как в шаге 2.2., а после стерилизации и размещения драпировки сделайте срединный разрез грудины, чтобы расколоть грудину. Во время разделения избегайте основных кровеносных сосудов и сердца и разделяйте пересаженные кровеносные сосуды слой за слоем.
3. Быстро отрежьте крупные кровеносные сосуды, соединяющиеся с сердцем, поместите сердце и восходящую аорту на ледяную крошку и удалите сосудистый мостик трансплантата, соединенную аорту и правую коронарную артерию. Промойте все образцы физиологическим раствором при температуре 4 °C.
4. Возьмите весь сосуд трансплантата размером около 3-4 см, разделите его на 4-5 равных частей и перенесите в пробирки для криоконсервации. Быстро поместите пробирки в жидкий азот для мгновенной заморозки и переместите в морозильную камеру со сверхнизкой температурой −80 °C для хранения.
5. Для анализа промыть привой ледяным 0,9%-ным физиологическим раствором и зафиксировать в 4%-ном растворе параформальдегида. Выдерживают соотношение размера тканевого блока к фиксирующему раствору 1:10 и фиксируют ткань более 12 ч.
6. Окрашивают срезы в 50 мл водного раствора гематоксилина в течение 3 мин. Разделите секции, промыв 50 мл 0,5% соляной кислоты этанола и 50 мл 0,2% аммиачной воды в течение 10 с каждая.
7. Промыть проточной водой в течение 1 ч, а затем очистить в дистиллированной воде, замочив на 3 мин. Обезвоживание в 70% и 90% этаноле в течение 10 мин каждый. Поместить в 50 мл 0,5% спиртового раствора для окрашивания эозина на 2-3 мин.
8. Обезвоживают окрашенные участки чистым этанолом в течение 10 мин, а затем замачивают в чистом ксилоле на 10 мин, чтобы сделать образцы прозрачными. Промокните прозрачные участки нейтральным клеем и накройте покровным стеклом. Наблюдайте патологические срезы под световым микроскопом при 40-кратном увеличении.

Результаты

ИМТ и сывороточные биохимические показатели
ИМТ между фиктивной и VGD группами достоверно не различался (фиктивный против VGD, 22,05 кг/см2 ± 0,46 кг/см2 против 21,14 кг/см2 ± 0,39 кг/^см2, p = 0,46). Биохимические результаты сыворотки крови приведены в таблице 1

Обсуждение

В этом исследовании мы подробно описали протокол отбора животных, подготовки инструментов, хирургических процедур и послеоперационной оценки при разработке модели VGD, индуцированной АКШ. Мы провели ультразвуковое исследование венозного трансплантата до и после операции АКШ и гистол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aortic Punch	Medtronic Inc. , America	3.0mm, 3.5mm, 4.0mm	Used for proximal coronary bridge anastomosis
Automatic biochemical analyzer	IDEXX Laboratories, Inc. America	Catalyst One
Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit	LANDANGER, France
Cardiogram monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd	MEC-1000
Coronary Shunt	AXIUS	OF-1500, OF-2500, OF-3000	The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis.  The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis.
Defibrillator	MEDIANA	Mediana D500
Diazepam	Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China	H37023039	Narcotic inducer
Disposable manual electric knife	Covidien, America	E2516H
Electric negative pressure suction machine	Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd	YX932D
Esmolol	Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD	H20055990	Emergency drugs
Ice machine	Local suppliers, Guangzhou, China
Lidocaine	Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD	H51021662	Emergency drugs
Luxtec headlight system	Luxtec, America	AX-1375-BIF	Used for lighting fine parts during operation
Medical operation magnifier (glasses)	Germany Lista co, LTD	SuperVu Galilean 3.5×	Used for fine site operation during operation
Multi-function high-frequency electrotome	Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd	GD350-B
Nitrogen canister	Local suppliers, Guangzhou, China
Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture)	Johnson & Johnson, America	6-0, 7-0	Used to suture blood vessels.
Nonabsorbable suture (cotton thread)	Covidien, America	1-0	Used for skin and muscle tissue tugging
Open heart surgery instrument kit	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD
Propofol injection	Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD	H19990282	Anesthetic sedative
Refrigerator	Local suppliers, Guangzhou, China
Respiratory anesthesia machine for animal	Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China	R620-S1
Semi-occlusion clamp	Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd.	ZL1701RB	Temporarily cut off the aortic flow
vecuronium bromide	Richter, Hungary	JX20090127	Muscle relaxant
Veterinary ultrasound system	Royal Philips, Netherlands	CX50
Zoletil	Virbac, France	Zoletil 50	Animal narcotic