Istituzione e valutazione di un modello di malattia da trapianto di vena suina

Riepilogo

In questo protocollo, il nuovo innesto di bypass venoso del maiale è stato eseguito attraverso una piccola incisione nella parete toracica sinistra senza bypass cardiopolmonare. È stato condotto uno studio di patologia postoperatoria, che ha mostrato ispessimento intimale.

Abstract

La malattia da trapianto venoso (VGD) è la principale causa di fallimento dell'innesto di bypass coronarico (CABG). Sono necessari grandi modelli animali di CABG-VGD per lo studio dei meccanismi della malattia e lo sviluppo di strategie terapeutiche.

Per eseguire l'intervento chirurgico, entriamo nella camera cardiaca attraverso il terzo spazio intercostale e sezioniamo attentamente la vena mammaria interna e la immergiamo nella normale soluzione salina. L'arteria coronaria principale destra viene quindi trattata per l'ischemia. La nave bersaglio viene incisa, viene posizionato un tappo di derivazione e l'estremità distale della vena dell'innesto viene anastomizzato. L'aorta ascendente è parzialmente bloccata e l'estremità prossimale della vena dell'innesto viene anastomizzata dopo la perforazione. La vena dell'innesto viene controllata per la pervietà e l'arteria coronaria destra prossimale è legata.

La chirurgia CABG viene eseguita in maialini per raccogliere la vena mammaria interna sinistra per il suo uso come innesto vascolare. I test biochimici del siero vengono utilizzati per valutare lo stato fisiologico degli animali dopo l'intervento chirurgico. L'esame ecografico mostra che l'estremità prossimale, media e distale del vaso di innesto non è ostruita. Nel modello chirurgico, il flusso sanguigno turbolento nell'innesto viene osservato all'esame istologico dopo l'intervento chirurgico CABG e la stenosi venosa dell'innesto associata a iperplasia intimale è osservata nell'innesto. Lo studio fornisce procedure chirurgiche dettagliate per la creazione di un modello VGD indotto da CABG ripetibile.

Introduzione

Sebbene la mortalità per malattia coronarica sia diminuita significativamente negli ultimi anni, la metà degli adulti di mezza età negli Stati Uniti sviluppa sintomi ischemici legati al cuore ogni anno e un terzo degli anziani muore di malattia coronarica¹. L'innesto di bypass coronarico (CABG) è una modalità chirurgica efficace per migliorare l'ischemia miocardica e, cosa più importante, è una modalità chirurgica insostituibile per il trattamento della malattia coronarica multivasale². Nel corso del tempo, tuttavia, gli innesti vascolari sviluppano infiammazione, iperplasia intimale e aterosclerosi progressiva, che è nota per portare a insufficienza dell'innesto venoso o malattia dell'innesto venoso (VGD)³. Nei pazienti dopo CABG, se si verifica restenosi, solo il vaso sanguigno malato può essere sostituito in alcuni casi². I pazienti più anziani e le comorbidità aggiunte rendono il rifacimento dell'innesto di bypass coronarico piuttosto impegnativo. Ritardare o controllare i problemi patologici associati ai vasi sanguigni trapiantati è un problema urgente da risolvere. Sono necessari grandi modelli animali di CABG-VGD per lo studio dei meccanismi della malattia e lo sviluppo di strategie terapeutiche. I ricercatori hanno stabilito con successo modelli VGD animali in animali piccoli e grandi come topi⁴, ratti⁵, conigli⁶ e maiali⁷. Rispetto ai piccoli animali, gli animali di grandi dimensioni come i maiali hanno strutture anatomiche e caratteristiche fisiologiche simili all'uomo e hanno una durata di vita più lunga ^8,9. Pertanto, gli animali di grandi dimensioni sono più adatti per esplorare i cambiamenti patologici a lungo termine nella malattia venosa del trapianto e per i test preclinici di farmaci o dispositivi. Noi e il nostro team di collaboratori abbiamo applicato con successo tecniche chirurgiche per stabilire un modello di insufficienza cardiaca suina e descritto i cambiamenti patologici cardiaci in questo modello¹⁰.

La chirurgia CABG è stata standardizzata nella pratica clinica, ma quando viene applicata alla creazione di modelli animali VGD, le differenze tra le specie, l'acquisizione di attrezzature e strutture per animali, le operazioni chirurgiche per animali e l'alimentazione e l'allattamento degli animali sono enormi sfide per i ricercatori. Come nella pratica clinica, gli approcci per la chirurgia CABG utilizzati per stabilire modelli animali VGD includono la sternotomia¹¹ della linea mediana e la toracotomia laterale sinistra¹². La sternotomia della linea mediana è più comunemente usata^13,14. Tuttavia, questo approccio presenta rischi elevati sia per gli esseri umani che per gli animali. Nello studio riportato da Thankam et al., due dei sei maiali utilizzati per la modellazione sono morti durante l'intervento chirurgico¹⁵. L'elevata mortalità del modello aumenta i costi di studio e influisce sull'accuratezza dei risultati. Uno studio ha dimostrato in precedenza che un'incisione della parete toracica sinistra era fattibile per stabilire VGD indotta da CABG nei suini¹¹. Qui, questo studio mira a descrivere un protocollo passo-passo per stabilire un intervento chirurgico riproducibile per un modello VGD indotto da CABG in maialini e per valutare il fenotipo di questo modello. Il protocollo sperimentale è stato progettato congiuntamente dai team di cardiochirurgia e anestesia. L'approccio chirurgico per il terzo spazio intercostale sinistro è stato determinato in base ai cadaveri di altri maialini in laboratorio prima dell'intervento chirurgico e il metodo di anestesia è stato eseguito secondo il metodo utilizzato al centro¹⁶. Sono stati condotti test biochimici del sangue, esame ecografico e esame istologico per valutare i modelli animali.

Protocollo

Le procedure per la cura e l'uso degli animali da laboratorio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Istituto di monitoraggio degli animali da laboratorio del Guangdong. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (8th Ed., 2011, National Research Council, USA). La procedura chirurgica è mostrata nella Figura 1.

1. Preparazione preoperatoria degli animali

1. Dividi casualmente 10 maialini maschi di 3 mesi del peso di 30-35 kg nel gruppo sham (n = 5) e nel gruppo VGD (n = 5).
2. Valutare le condizioni di salute preoperatorie e postoperatorie dei suini utilizzando l'indice di massa corporea (BMI). Calcola il BMI come segue:
   BMI = peso corporeo (kg)/(lunghezza corpo [cm] × lunghezza corpo [cm])
   NOTA: La lunghezza del corpo viene misurata dal naso del maiale alla base della coda.
3. Digiunare gli animali per 12 ore prima dell'intervento chirurgico per evitare l'aspirazione dopo l'anestesia. Preparare apparecchi per anestesia e strumenti chirurgici, tra cui una macchina per anestesia, gas, farmaci per anestetici, una pipeline per anestesia, uno speciale laringoscopio e strumenti chirurgici, un fermo costolica, punti di sutura, un divaricatore tiroideo, pinze chirurgiche, ecc. Sterilizzare tutti gli strumenti da utilizzare nell'ambulatorio.

2. Preparare gli animali per l'intervento chirurgico

1. Pesare gli animali e calcolare la dose di anestetico. Somministrare per via intramuscolare la miscela anestetica comprendente 2 mg/kg di 1:1 Tiletamina e Zolazepam, 0,2 mg/kg diazepam e 0,02 mg/kg di atropina¹⁷. Utilizzare fentanil (50 mg / kg) per alleviare il dolore intraoperatorio³⁰.
2. Assicurarsi che si raggiunga un piano anestetico adeguato e inserire un catetere venoso permanente (20G) nella vena dell'orecchio marginale per stabilire l'accesso all'orecchio. Trasferire il maiale sul tavolo operatorio e posizionarlo in posizione supina. Immobilizzare gli arti con bende ed elevare la testa con un drappeggio sterile.
   NOTA: Lo stato dell'anestesia è stato monitorato mediante fissazione centrale del bulbo oculare, miosi, perdita del riflesso pupillare e perdita del riflesso del dolore.  La frequenza cardiaca e la pressione sanguigna sono state mantenute a un livello inferiore rispetto al basale. Il chirurgo deve monitorare la FC, la pressione sanguigna e altri parametri sotto paralisi e aumentare la dose di anestetico se l'HR aumenta > 20% rispetto al basale.
3. Esporre l'epiglottide e la glottide utilizzando un laringoscopio veterinario. Eseguire l'intubazione tracheale con un tubo 7.0-7.5Fr e collegarlo al circuito respiratorio dell'anestesia.
   NOTA: Il ventilatore viene utilizzato per la ventilazione continua a pressione positiva con volume corrente 280 ml, rapporto inspiratorio/espiratorio 1:2, frequenza respiratoria 20 volte/min e pressione positiva di fine espirazione (5 cm H₂O).
4. Iniettare bromuro di vecuronio per via endovenosa (0,1 mg/kg) per rilassare i muscoli durante le procedure chirurgiche e utilizzare isoflurano al 2% per mantenere l'anestesia a una frequenza respiratoria di 16-20 bpm e un volume corrente di 10 ml/kg.
   NOTA: Il vecuronio viene somministrato per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia negli animali paralizzati, soprattutto perché la dose di farmaco di induzione e isoflurano è all'estremità inferiore di quella raccomandata.
5. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi del maiale per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Utilizzare termocoperte per mantenere la temperatura corporea del maiale a 38 °C ± 5 °C.
6. Utilizzare un elettrocardiogramma per monitorare la frequenza cardiaca, i livelli di ossigeno nel sangue e la temperatura corporea.

3. Procedure chirurgiche

1. Rasare la parete toracica sinistra e applicare tre cicli alternati di iodio allo 0,7% e alcol al 75% per preparare asetticamente l'area chirurgica fino all'angolo mandibolare sinistro, fino al cordone ombelicale, sinistra alla linea ascellare posteriore e destra al fronte ascellare. Posizionare un drappo chirurgico sterile intorno all'area chirurgica.
2. Fare un'incisione trasversale di 7-10 cm con un coltello elettrico nel terzo spazio intercostale sinistro e separare i tessuti sottocutanei strato per strato (Figura 2A). Rimuovere un segmento di 5-6 cm della terza costola con le forbici ossee ed esporre la vena mammaria interna con un divaricatore dopo aver esposto la terza articolazione costola-sternale (Figura 2B).
3. Individuare la vena mammaria interna insieme con l'arteria mammaria interna sinistra sul lato sinistro dello sterno. Eseguire una dissezione smussata della vena mammaria interna con una pinza vascolare.
4. Eseguire l'emostasi mediante elettrocoagulazione dei rami della vena mammaria interna sinistra con un coltello elettrico. Se l'emostasi è incompleta, utilizzare la legatura del filo di cotone per l'emostasi. Argare e segnare le due estremità della vena durante la raccolta (Figura 2C).
5. Preparare soluzione salina normale di eparina aggiungendo 2 ml di soluzione di eparina sodica e 98 ml di soluzione salina normale. Dopo aver rimosso la vena, iniettare soluzione salina normale di eparina nella vena per il pretrattamento (Figura 2D). Quindi, mettere la vena in soluzione salina normale e tenerla per il backup.
6. Fare un'incisione simile a quella sopra descritta e rimuovere la vena mammaria interna nel gruppo fittizio. Apri il pericardio, quindi chiudi la parete toracica nel gruppo fittizio. Utilizzare la vena mammaria interna del gruppo fittizio per il controllo patologico senza innesto di bypass coronarico.
7. Fare un'incisione di ~ 7 cm con un coltello elettrico sul pericardio per esporre il tronco dell'arteria coronaria destra. Sospendere il pericardio e cucire sulla pelle sul lato omolaterale con le suture chirurgiche 1-0 (Figura 2E). Separare il tronco coronarico destro dai tessuti circostanti (Figura 2E).
8. Bypassare la banda bloccante sotto l'estremità prossimale dell'arteria coronaria destra isolata vicino all'aorta con un gancio metallico e trattare il miocardio con tre cicli di ischemia di 2 min e riperfusione di 5 min stringendo e rilassando la banda di blocco (Figura 2F). Monitorare l'attività elettrica del cuore con il monitor dell'elettrocardiogramma durante il precondizionamento dell'ischemia/riperfusione (Figura 2G).
   NOTA: Quando l'arteria coronaria destra è bloccata, l'elettrocardiogramma mostra un aumento della frequenza cardiaca e dell'elevazione del segmento ST.
9. Stringere la fascia per bloccare il flusso sanguigno coronarico destro. Tagliare l'epicardio che copre i vasi sanguigni. Esporre la parete dell'arteria coronaria e tagliare longitudinalmente con la punta di una lama chirurgica contro il centro della parete anteriore dei vasi sanguigni.
10. Dopo aver tagliato il lume, allargare l'incisione con le forbici e posizionare uno shunt coronarico. Inserire un'estremità dello shunt con una bobina nell'arteria coronaria distale attraverso la lacrima. Deviare il sangue nelle arterie coronarie nello shunt coronarico cavo per garantire un campo operativo chiaro (Figura 2H).
11. Eseguire una sutura continua end-to-side tra la vena mammaria interna e il tronco coronarico destro con la sutura in polipropilene 7-0 (Figura 2I). Nel mezzo dell'aorta ascendente, occludere la parete anterolaterale sinistra dell'aorta ascendente con un morsetto semi-occlusivo.
12. Utilizzare una lama chirurgica per fare una piccola incisione nella parete aortica in cui è stata tagliata l'avventizia, inserire l'estremità della testa dell'albero scorrevole all'estremità della testa del pugno nella cavità aortica attraverso questa incisione, contrarre l'albero di scorrimento verso l'esterno e il coltello circolare sopra di esso taglia un pezzo della parete arteriosa. Il blocco di tessuto tagliato dal punzone ha un diametro di circa 3 mm (Figura 2J).
13. Tira fuori lo shunt. Eseguire una sutura continua end-to-side tra la vena mammaria interna e la parete aortica con la sutura in polipropilene 6-0 (Figura 2K). Aprire il morsetto di semi-occlusione.
14. Registrare il flusso di bypass del tronco coronarico destro prossimale al sito di anastomosi utilizzando gli ultrasuoni. Monitorare l'attività elettrica del cuore utilizzando l'elettrocardiogramma (Figura 2L).
15. Installare un tubo di drenaggio temporaneo (Fr: 16) nella cavità toracica per consentire al sangue e ai liquidi di drenare. Cucire l'incisione del pericardio usando un filo di cotone 1-0 e chiudere il torace strato per strato (dall'interno verso l'esterno: strato di pleura, strato muscolare, strato di tessuto sottocutaneo, strato di pelle) mentre si posiziona la polvere di penicillina (circa 0,5 g) su ogni strato. Rimuovere il tubo di drenaggio dopo aver cucito l'incisione cutanea utilizzando un filo di cotone 1-0.

4. Assistenza post-operatoria

1. Rimuovere il tubo endotracheale dopo che gli animali sono tornati alla respirazione spontanea. L'anestesista deve valutare i parametri vitali dell'animale (ad esempio, frequenza respiratoria, frequenza cardiaca, saturazione di ossigeno, ecc.) e rimuovere l'ECG dopo che gli animali si svegliano e tornano all'attività spontanea. Rimanda gli animali nella stanza di alimentazione e metti gli animali finti in un altro recinto nella stanza di allevamento. Tieni gli animali al caldo con una coperta elettrica. Osservare gli animali ogni ora dopo l'intervento chirurgico (almeno 4 volte).
2. Dai da mangiare all'animale il giorno dopo l'intervento chirurgico. Aggiungere l'aspirina (200 mg) 2 volte al giorno per 7 giorni al mangime per prevenire la trombosi post-operatoria e ridurre il dolore della ferita.
   NOTA: Evitare di nutrire gli animali il giorno dell'intervento chirurgico per prevenire l'aspirazione.
3. Somministrare l'animale con un'iniezione intramuscolare di penicillina 1 volta al giorno per 7 giorni consecutivi per prevenire l'infezione post-operatoria (14.000 unità per kg).

5. Esame ultrasonico

1. Dopo l'intervento chirurgico CABG, utilizzare un manicotto sterile per sonda ad ultrasuoni per avvolgere la sonda lineare ad alta frequenza. Posizionare la sonda sulla superficie dell'innesto venoso.
2. Visualizza il contorno dell'innesto nella modalità ecografica bidimensionale, quindi passa alla modalità Color Doppler per rilevare il flusso sanguigno nell'innesto.

6. Raccolta di tessuto venoso

1. Raccogliere 10 ml di campione di sangue dal circuito venoso della vena dell'orecchio per test biochimici. (Tabella 1). Centrifugare il campione di sangue a 1.000 x g per 5 minuti ed eseguire test biochimici con un analizzatore biochimico automatico.
2. Anestetizzare l'animale come descritto in precedenza. Dopo aver confermato la profondità dell'anestesia, iniettare il 10% di cloruro di potassio 0,5 ml / kg di peso corporeo dalla vena marginale dell'orecchio o dalla vena degli arti anteriori. Quindi, eseguire un'incisione sternale mediana di 10 cm con un coltello elettrico per raccogliere l'innesto venoso 30 giorni dopo l'intervento chirurgico. Fissare la posizione del corpo come nel punto 2.2., e dopo la sterilizzazione e il posizionamento di un drappo, fare un'incisione mediana dello sterno per dividere lo sterno. Durante la separazione, evitare i principali vasi sanguigni e il cuore e separare i vasi sanguigni innestati strato per strato.
3. Tagliare rapidamente i grandi vasi sanguigni che si collegano al cuore, posizionare il cuore e l'aorta ascendente su trucioli di ghiaccio e rimuovere il ponte vascolare dell'innesto, l'aorta collegata e l'arteria coronaria destra. Risciacquare tutti i campioni con soluzione salina normale a 4 °C.
4. Prendi l'intero recipiente di innesto di circa 3-4 cm, dividilo in 4-5 parti uguali e trasferiscilo nei tubi di crioconservazione. Mettere rapidamente i tubi in azoto liquido per congelare e passare a un congelatore a temperatura ultra bassa a -80 °C per la conservazione.
5. Per l'analisi, sciacquare l'innesto con soluzione salina ghiacciata allo 0,9% e fissarlo in una soluzione di paraformaldeide al 4%. Mantenere un rapporto tra la dimensione del blocco tissutale e la soluzione fissativa di 1:10 e fissare il tessuto per più di 12 ore.
6. Colorare le sezioni in 50 ml di soluzione acquosa di ematossilina per 3 min. Separare le sezioni lavando con 50 ml di etanolo acido cloridrico allo 0,5% e 50 ml di acqua ammoniacale allo 0,2% per 10 s ciascuno.
7. Risciacquare con acqua corrente per 1 ora e poi pulire in acqua distillata immergendo per 3 min. Disidratare in etanolo al 70% e al 90% per 10 minuti ciascuno. Introdurre in 50 ml di soluzione colorante di eosina alcolica allo 0,5% per 2-3 minuti.
8. Disidratare le sezioni colorate con etanolo puro per 10 minuti e quindi immergere in xilene puro per 10 minuti per rendere trasparenti i campioni. Gocciolare le sezioni trasparenti con colla neutra e coprire con un coprivetrino. Osservare le sezioni patologiche al microscopio ottico con ingrandimento 40x.

Risultati

BMI e indici biochimici sierici
Il BMI tra i gruppi sham e VGD non era significativamente diverso (sham vs. VGD, 22,05 kg/cm 2 ± 0,46 kg/cm 2 vs. 21,14 kg/cm 2 ± 0,39 kg/cm ², p = 0,46). I risultati biochimici del siero sono elencati nella Tabella 1. Cambiamenti statisticamente significativi tra i gruppi sono stati trovati in quattro indici biochimici, tra cui aspartato aminotransferasi (AST, sham vs. VGD, 25,25 UI/L ± 1,88 UI/L ...

Discussione

In questo studio, abbiamo descritto in dettaglio il protocollo per la selezione degli animali, la preparazione degli strumenti, le procedure chirurgiche e la valutazione post-operatoria durante lo sviluppo di un modello VGD indotto da CABG. Abbiamo eseguito l'esame ecografico dell'innesto venoso prima e dopo l'intervento chirurgico CABG e l'esame istologico dell'innesto 30 giorni dopo l'intervento. Il flusso sanguigno nella vena mammaria interna era normale prima dell'intervento chirurgico CABG, mentre il flusso retrogra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aortic Punch	Medtronic Inc. , America	3.0mm, 3.5mm, 4.0mm	Used for proximal coronary bridge anastomosis
Automatic biochemical analyzer	IDEXX Laboratories, Inc. America	Catalyst One
Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit	LANDANGER, France
Cardiogram monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd	MEC-1000
Coronary Shunt	AXIUS	OF-1500, OF-2500, OF-3000	The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis.  The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis.
Defibrillator	MEDIANA	Mediana D500
Diazepam	Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China	H37023039	Narcotic inducer
Disposable manual electric knife	Covidien, America	E2516H
Electric negative pressure suction machine	Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd	YX932D
Esmolol	Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD	H20055990	Emergency drugs
Ice machine	Local suppliers, Guangzhou, China
Lidocaine	Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD	H51021662	Emergency drugs
Luxtec headlight system	Luxtec, America	AX-1375-BIF	Used for lighting fine parts during operation
Medical operation magnifier (glasses)	Germany Lista co, LTD	SuperVu Galilean 3.5×	Used for fine site operation during operation
Multi-function high-frequency electrotome	Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd	GD350-B
Nitrogen canister	Local suppliers, Guangzhou, China
Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture)	Johnson & Johnson, America	6-0, 7-0	Used to suture blood vessels.
Nonabsorbable suture (cotton thread)	Covidien, America	1-0	Used for skin and muscle tissue tugging
Open heart surgery instrument kit	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD
Propofol injection	Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD	H19990282	Anesthetic sedative
Refrigerator	Local suppliers, Guangzhou, China
Respiratory anesthesia machine for animal	Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China	R620-S1
Semi-occlusion clamp	Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd.	ZL1701RB	Temporarily cut off the aortic flow
vecuronium bromide	Richter, Hungary	JX20090127	Muscle relaxant
Veterinary ultrasound system	Royal Philips, Netherlands	CX50
Zoletil	Virbac, France	Zoletil 50	Animal narcotic