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Resumen

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

Resumen

El citoesqueleto de actina, la principal maquinaria mecánica en la célula, media numerosas actividades celulares físicas esenciales, incluyendo la deformación, división, migración y adhesión celular. Sin embargo, el estudio de la dinámica y la estructura de la red de actina in vivo se complica por la regulación bioquímica y genética dentro de las células vivas. Para construir un modelo mínimo desprovisto de regulación bioquímica intracelular, la actina se encapsula dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV, también llamadas liposomas). Los liposomas biomiméticos son del tamaño de una célula y facilitan una visión cuantitativa de las propiedades mecánicas y dinámicas de la red del citoesqueleto, abriendo una ruta viable para la biología sintética ascendente. Para generar liposomas para encapsulación, se utiliza el método de emulsión invertida (también conocido como método de transferencia de emulsión), que es una de las técnicas más exitosas para encapsular soluciones complejas en liposomas para preparar varios sistemas que imitan células. Con este método, se agrega una mezcla de proteínas de interés al tampón interno, que luego se emulsiona en una solución de aceite mineral que contiene fosfolípidos para formar gotas de lípidos monocapa. Los liposomas deseados se generan a partir de gotas lipídicas monocapa que cruzan una interfaz lípido/aceite-agua. Este método permite la encapsulación de polímeros de actina concentrados en los liposomas con los componentes lipídicos deseados, allanando el camino para la reconstitución in vitro de una red de citoesqueleto bioimitador.

Introducción

El citoesqueleto de actina juega un papel fundamental en la construcción de la arquitectura intracelular de la célula mediante la coordinación de la contractilidad a nivel molecular y la generación de fuerza 1,2,3. Como resultado, media numerosas actividades celulares esenciales, incluyendo la deformación celular4,5, división6, migración 7,8 y adhesión9. La reconstitución in vitro de las redes de actina ha ganado una gran atención en los últimos años 10,11,12,13,14,15,16,17. El objetivo de la reconstitución es construir un modelo mínimo de la célula desprovisto de la compleja regulación bioquímica que existe dentro de las células vivas. Esto ofrece un ambiente controlable para sondear actividades intracelulares específicas y facilita la identificación y análisis de diferentes componentes del citoesqueleto de actina18,19. Además, la encapsulación de las redes de actina in vitro dentro de las vesículas unilamelares gigantes de fosfolípidos (GUV, liposomas) proporciona un espacio confinado pero deformable con un límite semipermeable. Imita el microambiente fisiológico y mecánico de la maquinaria de actina dentro de la célula 9,20,21,22.

Entre los diversos métodos para preparar liposomas, el método de hidratación de la película lipídica (también conocido como método de hinchazón) es una de las primeras técnicas23. La película lipídica seca hidrata con la adición de tampones, formando burbujas membranosas que eventualmente se convierten en vesículas24. Para producir vesículas más grandes con un mayor rendimiento, un método mejorado que avanza desde el método de hidratación de la película, conocido como el método de electroformación25, aplica un campo eléctrico de CA para promover eficientemente el proceso de hidratación26. Las principales limitaciones de estos métodos basados en la hidratación para la encapsulación de actina son que tiene una baja eficiencia de encapsulación de proteínas altamente concentradas, y sólo es compatible con composiciones lipídicas específicas24. La técnica de emulsión invertida, en comparación, tiene menos limitaciones para los componentes lipídicos y las concentraciones de proteínas20,27,28,29. En este método, se agrega una mezcla de proteínas para la encapsulación al tampón acuoso interno, que luego se emulsiona en una solución de aceite mineral que contiene lípidos, formando gotitas de monocapa lipídica. Las gotas lipídicas monocapa luego cruzan a través de otra interfaz lípido/aceite-agua a través de la centrifugación para formar vesículas lipídicas bicapa (liposomas). Esta técnica ha demostrado ser una de las estrategias más exitosas para la encapsulación de actina24,30. Por separado, hay algunos métodos de dispositivos microfluídicos, incluyendo el chorro pulsado 31,32, la eyección transitoria de membrana33 y el método cDICE34. Las similitudes entre el método de emulsión invertida y el método microfluídico son el disolvente lipídico (aceite) que se utiliza y la introducción de la interfaz lípido/aceite-agua para la formación de la valva externa de los liposomas. Por el contrario, la generación de liposomas por el método microfluídico requiere una configuración de dispositivos microfluídicos y se acompaña de aceite atrapado entre las dos valvas de la bicapa, lo que requiere un paso adicional para la eliminación del aceite35.

En este manuscrito, utilizamos la técnica de emulsión invertida para preparar liposomas encapsulando una red de actina F polimerizada como se usó anteriormente22. La mezcla de proteínas para la encapsulación se colocó primero en un tampón con condiciones no polimerizantes para mantener la actina en su forma globular (G). Todo el proceso se llevó a cabo a 4 °C para evitar la polimerización temprana de actina, que luego se desencadenó al permitir que la muestra se calentara a temperatura ambiente. Una vez a temperatura ambiente, la actina polimeriza en su forma filamentosa (F). Se puede agregar una variedad de proteínas de unión a actina a la solución tampón acuosa interna para estudiar las funcionalidades y propiedades de las proteínas, lo que proporciona información adicional sobre su interacción con la red de actina y la superficie de la membrana. Este método también se puede aplicar a la encapsulación de diversas proteínas de interés36 y objetos grandes (micropartículas, micronadadores autopropulsados, etc.) cercanos al tamaño de los liposomas finales 28,37.

Protocolo

1. Preparación de tampones y soluciones proteicas

  1. Prepare el tampón acuoso de no polimerización interna (INP) en un volumen total de 5 mL mezclando 0.1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 320 mM sacarosa y0.2 mM ATP.
  2. Prepare la mezcla de proteínas (PM) agregando proteínas al tampón INP a 4 °C con las siguientes concentraciones: 11.2 μM de actina G no fluorescente, actina marcada fluorescente de 2.8 μM y Arp2/3 de 0.24 μM (Tabla de materiales). Para formar una capa de actina F, agregue 100 nM gelsolin, 4 μM de cofilina y 2.2 μM VCA-His a la PM. Como experimento de control, reemplace PM por un colorante fluorescente de 100 μg / ml (Tabla de materiales).
  3. Prepare el tampón acuoso de polimerización interna (IP) (acuoso) en un volumen total de 5 mL mezclando 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP y 80 mM sacarosa.
  4. Prepare el tampón final (FB) mezclando tampón INP (que contiene PM) y tampón IP en una proporción de volumen de 1: 1 para producir la solución acuosa interna en un volumen total de 30 μL que se encapsulará dentro del liposoma.
  5. Prepare el tampón exterior (OB) acuoso en un volumen total de 150 μL mezclando 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 212 mM glucosa y 0.1 mg/mL β-caseína.
    NOTA: La osmolaridad del OB se puede ajustar con glucosa para asegurar que la presión osmótica del OB sea ligeramente mayor que la del FB (20-60 mOsm). La densidad del FB debe ser ligeramente mayor que la del OB.

2. Preparación de liposomas basada en las técnicas de emulsión invertida

  1. Preparar la mezcla de lípidos y aceite
    1. Agregue 100 μL de 25 mg/ml de L-α-fosfatidilcolina (Egg PC no fluorescente, también llamado EPC, incluyendo 1% de DHPE) en un vial de vidrio. Evaporar el cloroformo con gas argón, dejando una película lipídica sólida seca (2,5 mg) en el fondo del vial.
      1. Para formar una capa de actina F, añadir sal de níquel succinil} (DOGS-NTA-Ni) a una proporción de 10:1 de EPC a DOGS-NTA-Ni y mezclar antes de la evaporación del cloroformo.
    2. Añadir 2 ml de aceite mineral y sonicar la mezcla de lípidos y aceite a temperatura ambiente en un baño durante 1 h para volver a suspender los lípidos.
      NOTA: La mezcla de lípidos y aceite después de la sonicación se puede mantener durante 1 semana a 4 °C. Se sugiere la re-sonicación antes de su uso.
  2. Preparar una emulsión Final Buffer in oil (FB/oil) para preparar gotas lipídicas monocapa que contengan la proteína de interés.
    1. A 100 μL de mezcla de lípidos y aceite tomada en un tubo de plástico, agregue 10 μL de FB. Asegúrese de que FB esté en una gota.
    2. Con una jeringa de vidrio, extraiga la mezcla de lípido-aceite-FB y aspire suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces para emulsionarla; extraiga primero una pequeña cantidad de mezcla de lípidos y aceite, y luego la gota de FB colocando la punta de la jeringa en la periferia de la gota para romperla en pequeñas gotas. Repita la aspiración hacia arriba y hacia abajo hasta que se forme una emulsión blanquecina y turbia.
  3. Coloque 30 μL de OB en un tubo de plástico separado. Coloque 30 μL de la mezcla de lípidos y aceite sobre OB y déjelo reposar durante ~ 10 minutos para desarrollar una monocapa lipídica en la interfaz.
    NOTA: Si los lípidos están cargados o la proteína está incorporada, la duración de este paso debe extenderse38.
  4. Preparar los liposomas
    1. Añadir con cuidado 50 μL de la emulsión FB/aceite (paso 2.2) a la fase superior de aceite del tubo a partir del paso 2.3.
    2. Centrifugar el tubo de plástico a 100 x g durante 15 minutos a 4 °C. Varíe el tiempo y la velocidad de centrifugación para optimizar la formación de liposomas.
      NOTA: Después de la centrifugación, la fase superior de aceite debe estar despejada, y la OB inferior (que contiene liposomas) debe estar ligeramente turbia.
    3. Retire con cuidado la fase de aceite con una pipeta. Aspire volumen adicional si es necesario. Asegúrese de no colocar la punta de la pipeta en el lado del tubo para evitar crear un menisco de aceite en la parte superior de la fase liposómica.
    4. Con una nueva pipeta, pegue lentamente la punta de la pipeta en la fase inferior restante y aspire el volumen acuoso para recoger los liposomas.
      NOTA: Es mejor perder volumen que incorporar el aceite. La inclusión de aceite hará que los liposomas se rompan y los componentes internos se liberarán en el tampón externo. Corte la punta de una pipeta para reducir el cizallamiento.

3. Observación microscópica

  1. Vierta 100 μL de OB en el pocillo de una cámara de incubación (placa de 4 pocillos que contiene cubreobjetos redondos de 12 mm). Deposite suavemente los liposomas recolectados (paso 2.4.4) en OB, y luego coloque otro cubreobjetos en la parte superior de la cámara.
    NOTA: El OB contiene la β-caseína para pasivar la superficie del vidrio y minimizar la adherencia entre los liposomas20.
  2. Observe los liposomas con un microscopio confocal utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63x. Use líneas láser de 488 nm, 647 nm y 561 nm para observar lípidos marcados con fluorescencia, colorantes fluorescentes encapsulados y actina marcada con fluorescencia encapsulada, respectivamente. Captura los fotogramas de interés y guarda las imágenes en formato TIFF.
  3. Procesar y analizar imágenes en ImageJ/Fiji39. Para los nuevos usuarios de ImageJ/Fiji, un tutorial en línea está disponible (ver Tabla de materiales).
    1. Abra el archivo TIFF utilizando el software ImageJ/Fiji.
    2. Vaya a Imagen > ajustar > brillo/contraste. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen a la escala deseada ajustando los ajustes Mínimo y Máximo , y los controles deslizantes Brillo y Contraste .
    3. Haga clic en la herramienta de selección de rectángulos en la barra de herramientas y seleccione la región de interés (ROI). Vaya a Imagen > Recortar para recortar el ROI.
    4. Vaya a Analizar > establecer escala. En la ventana emergente, introduzca 1,0 en el campo Relación de aspecto de píxeles y establezca μm como Unidad de longitud. En el campo Distancia en píxeles, introduzca el ancho de la imagen en píxeles . En el campo Distancia conocida , introduzca el ancho real de la imagen en micras.
    5. Para medir el tamaño del liposoma, con la herramienta Selección ovalada de la barra de herramientas, dibuje un círculo a lo largo del borde del liposoma. Vaya a Analizar > Medir para medir el área del círculo, a partir de la cual se puede calcular el diámetro del liposoma.

Resultados

La preparación de liposomas basada en la técnica de emulsión invertida se ilustra gráfica y esquemáticamente en la Figura 1.

Primero, se prepararon liposomas vacíos (desnudos) (~ 5-50 μm de diámetro) que estaban compuestos de fosfolípidos (EPC) y lípidos fluorescentes (DHPE). Un tinte fluorescente brillante de color rojo lejano se encapsuló dentro de liposomas desnudos como un experimento de control. Si una monocapa lipídica se ha formado con éxito en...

Discusión

Varios pasos clave determinan el éxito de un alto rendimiento de liposomas durante el proceso de preparación. Para disolver completamente la película lipídica en el aceite, la muestra debe ser sonicada hasta que la película lipídica en el fondo del vial de vidrio desaparezca por completo. Después de la sonicación, la mezcla de lípidos y aceite debe almacenarse durante la noche a temperatura ambiente en condiciones oscuras para que las moléculas lipídicas se dispersen más29. La mezcla p...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Reconocemos la financiación de ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., los Institutos Nacionales de Salud (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, Universidad de Michigan / Genentech, SUBK00016255 y Human Frontiers Science Program (HFSP) número de subvención RGY0073/2018 a M.P.M. Cualquier opinión, hallazgo, conclusión o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la ARO, NIH o HFSP. S.C. reconoce conversaciones fructíferas con V. Yadav, C. Muresan y S. Amiri.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaneSigmaD27802-25GDABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAKL99-Dnon-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAR05fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 dyeThermoFisherfluorescent dye
Andor iQ3Andor Technologiescontrol and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine BrainCytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
Calcium chloride dihydrateSigma10035048CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)Quorum Technologiesincubation chamber
Cofilin protein: human recombinantCytoskeleton, IncCF01-Ccofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glucose
DithiothreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens RecombinantCytoskeleton, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tipCole-ParmerUX-07940-53glass syringe
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alpha-PhosphatidylcholineAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
Magnesium chlorideSigma7786303MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oilSigma8042475mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Potassium chlorideSigma7447407KCl
SucroseSigma57-50-1sucrose
β-Casein from bovine milkSigmaC6905-250MG

Referencias

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