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Résumé

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

Résumé

Le cytosquelette d’actine, la principale machinerie mécanique de la cellule, intervient dans de nombreuses activités cellulaires physiques essentielles, notamment la déformation, la division, la migration et l’adhésion cellulaires. Cependant, l’étude de la dynamique et de la structure du réseau d’actine in vivo est compliquée par la régulation biochimique et génétique au sein des cellules vivantes. Pour construire un modèle minimal dépourvu de régulation biochimique intracellulaire, l’actine est encapsulée dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV, également appelées liposomes). Les liposomes biomimétiques sont de la taille d’une cellule et facilitent un aperçu quantitatif des propriétés mécaniques et dynamiques du réseau de cytosquelettes, ouvrant une voie viable pour la biologie synthétique ascendante. Pour générer des liposomes pour l’encapsulation, la méthode d’émulsion inversée (également appelée méthode de transfert d’émulsion) est utilisée, qui est l’une des techniques les plus efficaces pour encapsuler des solutions complexes dans des liposomes afin de préparer divers systèmes imitant les cellules. Avec cette méthode, un mélange de protéines d’intérêt est ajouté au tampon interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des phospholipides pour former des gouttelettes lipidiques monocouches. Les liposomes souhaités sont générés à partir de gouttelettes lipidiques monocouches traversant une interface lipide/huile-eau. Cette méthode permet l’encapsulation de polymères d’actine concentrés dans les liposomes avec les composants lipidiques souhaités, ouvrant la voie à la reconstitution in vitro d’un réseau de cytosquelettes biomimiques.

Introduction

Le cytosquelette d’actine joue un rôle fondamental dans la construction de l’architecture intracellulaire de la cellule en coordonnant la contractilité au niveau moléculaire et la génération de force 1,2,3. En conséquence, il intervient dans de nombreuses activités cellulaires essentielles, notamment la déformation cellulaire4,5, la division6, la migration 7,8 et l’adhésion9. La reconstitution in vitro des réseaux d’actine a attiré énormément d’attention ces dernières années 10,11,12,13,14,15,16,17. Le but de la reconstitution est de construire un modèle minimal de la cellule dépourvu de la régulation biochimique complexe qui existe dans les cellules vivantes. Cela offre un environnement contrôlable pour sonder des activités intracellulaires spécifiques et facilite l’identification et l’analyse des différents composants du cytosquelette d’actine18,19. De plus, l’encapsulation de réseaux d’actine in vitro à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes phospholipides (GUV, liposomes) fournit un espace confiné mais déformable avec une limite semi-perméable. Il imite le microenvironnement physiologique et mécanique de la machinerie d’actine dans la cellule 9,20,21,22.

Parmi les différentes méthodes de préparation des liposomes, la méthode d’hydratation du film lipidique (également connue sous le nom de méthode de gonflement) est l’une des premières techniques23. Le film lipidique sec s’hydrate avec l’ajout de tampons, formant des bulles membraneuses qui finissent par devenir des vésicules24. Pour produire des vésicules plus grandes avec un rendement plus élevé, une méthode améliorée passant de la méthode d’hydratation du film, connue sous le nom de méthode d’électroformation25, applique un champ électrique AC pour favoriser efficacement le processus d’hydratation26. Les principales limites de ces méthodes basées sur l’hydratation pour l’encapsulation de l’actine sont qu’elles ont une faible efficacité d’encapsulation des protéines hautement concentrées, et qu’elles ne sont compatibles qu’avec des compositions lipidiques spécifiques24. La technique de l’émulsion inversée, en comparaison, a moins de limitations pour les composants lipidiques et les concentrations de protéines20,27,28,29. Dans cette méthode, un mélange de protéines pour l’encapsulation est ajouté au tampon aqueux interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des lipides, formant des gouttelettes lipides-monocouches. Les gouttelettes lipidiques monocouches traversent ensuite une autre interface lipide/huile-eau par centrifugation pour former des vésicules lipidiques bicouches (liposomes). Cette technique s’est avérée être l’une des stratégies les plus efficaces pour l’encapsulation d’actine24,30. Séparément, il existe certaines méthodes de dispositifs microfluidiques, notamment le jet pulsé31,32, l’éjection à membrane transitoire 33 et la méthode cDICE 34. Les similitudes entre la méthode d’émulsion inversée et la méthode microfluidique sont le solvant lipidique (huile) utilisé et l’introduction d’une interface lipide/huile-eau pour la formation du feuillet externe des liposomes. En revanche, la génération de liposomes par la méthode microfluidique nécessite une mise en place de dispositifs microfluidiques et s’accompagne d’huile piégée entre les deux feuillets de la bicouche, ce qui nécessite une étape supplémentaire pour l’élimination de l’huile35.

Dans ce manuscrit, nous avons utilisé la technique de l’émulsion inversée pour préparer des liposomes encapsulant un réseau d’actine F polymérisé tel qu’utilisé précédemment22. Le mélange de protéines pour l’encapsulation a d’abord été placé dans un tampon avec des conditions non polymérisantes pour maintenir l’actine sous sa forme globulaire (G). L’ensemble du processus a été effectué à 4 ° C pour empêcher la polymérisation précoce de l’actine, qui a ensuite été déclenchée en permettant à l’échantillon de se réchauffer à température ambiante. Une fois à température ambiante, l’actine polymérise sous sa forme filamenteuse (F). Une variété de protéines liant l’actine peuvent être ajoutées à la solution tampon aqueuse interne pour étudier les fonctionnalités et les propriétés des protéines, fournissant ainsi des informations supplémentaires sur son interaction avec le réseau d’actine et la surface de la membrane. Cette méthode peut également être appliquée à l’encapsulation de diverses protéines d’intérêt36 et de grands objets (microparticules, micronageurs automoteurs, etc.) proches de la taille des liposomesfinaux28,37.

Protocole

1. Préparation des tampons et des solutions protéiques

  1. Préparer le tampon aqueux de non-polymérisation interne (INP) dans un volume total de 5 mL en mélangeant 0,1 mM de CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM de DTT, 0,5 mM de Dabco, 320 mM de saccharose et0,2 mM d’ATP.
  2. Préparer le mélange de protéines (PM) en ajoutant des protéines au tampon INP à 4 °C avec les concentrations suivantes : 11,2 μM de G-actine non fluorescente, 2,8 μM d’actine marquée par fluorescence et 0,24 μM d’Arp2/3 (Tableau des matériaux). Pour former une couche d’actine F, ajoutez 100 nM de gelsoline, 4 μM de cofiline et 2,2 μM de VCA-His au PM. Comme expérience de contrôle, remplacer les particules par un colorant fluorescent de 100 μg/mL (Tableau des matériaux).
  3. Préparer le tampon aqueux de polymérisation interne (IP) (aqueux) dans un volume total de 5 mL en mélangeant 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP et 80 mM saccharose.
  4. Préparer le tampon final (FB) en mélangeant le tampon INP (contenant PM) et le tampon IP à un rapport volumique de 1:1 pour obtenir la solution aqueuse interne dans un volume total de 30 μL qui sera encapsulé dans le liposome.
  5. Préparer le tampon extérieur aqueux (OB) dans un volume total de 150 μL en mélangeant 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucose et0,1 mg/mL β-caséine.
    REMARQUE: L’osmolarité de l’OB peut être ajustée avec du glucose pour s’assurer que la pression osmotique de l’OB est légèrement supérieure à celle de l’OB (20-60 mOsm). La densité de la FB devrait être légèrement supérieure à celle de l’OB.

2. Préparation de liposomes basée sur les techniques d’émulsion inversée

  1. Préparer le mélange lipide-huile
    1. Ajouter 100 μL de 25 mg/mL de L-α-phosphatidylcholine (Egg PC non fluorescent, aussi appelé EPC, y compris 1 % de DHPE) dans un flacon en verre. Évaporer le chloroforme avec du gaz argon, en laissant un film lipidique solide sec (2,5 mg) au fond du flacon.
      1. Pour former une couche de F-actine, ajouter du sel de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacétique] succinyl} nickel (DOGS-NTA-Ni) dans un rapport de 10:1 EPC / DOGS-NTA-Ni et mélanger avant l’évaporation du chloroforme.
    2. Ajouter 2 mL d’huile minérale et sonifier le mélange lipide-huile à température ambiante dans un bain pendant 1 h pour remettre les lipides en suspension.
      REMARQUE: Le mélange lipide-huile après sonication peut être conservé pendant 1 semaine à 4 ° C. La ré-sonication est suggérée avant utilisation.
  2. Préparer une émulsion finale de tampon dans l’huile (FB/huile) pour préparer des gouttelettes lipidiques monocouches contenant la protéine d’intérêt.
    1. À 100 μL de mélange lipide-huile pris dans un tube en plastique, ajouter 10 μL de FB. Assurez-vous que FB est dans une gouttelette.
    2. À l’aide d’une seringue en verre, prélever le mélange lipide-huile-FB et aspirer doucement de haut en bas plusieurs fois pour l’émulsionner; prélever d’abord une petite quantité de mélange lipide-huile, puis la gouttelette FB en plaçant l’extrémité de la seringue à la périphérie de la gouttelette pour la briser en minuscules gouttelettes. Répétez l’aspiration de haut en bas jusqu’à ce qu’une émulsion blanchâtre et trouble se forme.
  3. Mettez 30 μL d’OB dans un tube en plastique séparé. Placez 30 μL du mélange lipide-huile sur l’OB et laissez-le reposer pendant ~ 10 minutes pour développer une monocouche lipidique à l’interface.
    REMARQUE: Si les lipides sont chargés ou si la protéine est incorporée, la durée de cette étape doit être prolongée38.
  4. Préparer les liposomes
    1. Ajouter délicatement 50 μL de l’émulsion FB/huile (étape 2.2) à la phase huileuse supérieure du tube à partir de l’étape 2.3.
    2. Centrifuger le tube en plastique à 100 x g pendant 15 minutes à 4 °C. Variez le temps et la vitesse de centrifugation pour optimiser la formation de liposomes.
      REMARQUE: Après la centrifugation, la phase supérieure de l’huile doit être claire et l’OB inférieur (contenant des liposomes) doit être légèrement trouble.
    3. Retirez délicatement la phase huileuse à l’aide d’une pipette. Aspirez un volume supplémentaire si nécessaire. Assurez-vous de ne pas placer l’embout de la pipette sur le côté du tube pour éviter de créer un ménisque d’huile au-dessus de la phase liposomique.
    4. Avec une nouvelle pipette, collez lentement l’embout de la pipette dans la phase inférieure restante et aspirez le volume aqueux pour recueillir les liposomes.
      REMARQUE: Il est préférable de perdre du volume que d’incorporer l’huile. L’inclusion d’huile provoquera la rupture des liposomes et les composants internes seront libérés dans le tampon externe. Coupez l’extrémité d’une pipette pour réduire le cisaillement.

3. Observation microscopique

  1. Verser 100 μL d’OB dans le puits d’une chambre d’incubation (plaque à 4 puits contenant des lamelles de couverture rondes de 12 mm). Déposer délicatement les liposomes collectés (étape 2.4.4) dans l’OB, puis placer une autre lamelle de couverture sur le dessus de la chambre.
    REMARQUE: L’OB contient la β-caséine pour passiver la surface du verre et minimiser le collage entre les liposomes20.
  2. Observez les liposomes avec un microscope confocal à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 63x. Utilisez des raies laser de 488 nm, 647 nm et 561 nm pour observer respectivement les lipides marqués par fluorescence, les colorants fluorescents encapsulés et l’actine encapsulée marquée par fluorescence. Capturez les images d’intérêt et enregistrez les images au format TIFF.
  3. Traiter et analyser des images dans ImageJ/Fiji39. Pour les nouveaux utilisateurs d’ImageJ/Fiji, un tutoriel en ligne est disponible (voir le tableau des matériaux).
    1. Ouvrez le fichier TIFF à l’aide du logiciel ImageJ/Fiji.
    2. Accédez à Image > Réglez > luminosité/contraste. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image à l’échelle souhaitée en ajustant les paramètres Minimum et Maximum , ainsi que les curseurs Luminosité et Contraste .
    3. Cliquez sur l’outil de sélection de rectangle dans la barre d’outils et sélectionnez la région d’intérêt (ROI). Accédez à Image > Recadrer pour recadrer le retour sur investissement.
    4. Allez à Analyser > échelle définie. Dans la fenêtre contextuelle, entrez 1.0 dans le champ Format des pixels et définissez μm comme unité de longueur. Dans le champ Distance en pixels, entrez la largeur de l’image en pixels . Dans le champ Distance connue , entrez la largeur réelle de l’image en microns.
    5. Pour mesurer la taille du liposome, à l’aide de l’outil de sélection ovale de la barre d’outils, tracez un cercle le long du bord du liposome. Allez à Analyser > Mesure pour mesurer la surface du cercle, à partir de laquelle le diamètre du liposome peut être calculé.

Résultats

La préparation des liposomes basée sur la technique de l’émulsion inversée est illustrée graphiquement et schématiquement sur la figure 1.

Tout d’abord, des liposomes vides (nus) (~5-50 μm de diamètre) composés de phospholipides (EPC) et de lipides fluorescents (DHPE) ont été préparés. Un colorant fluorescent rouge vif a été encapsulé dans des liposomes nus comme expérience de contrôle. Il a été possible de déterminer si une monocouche lip...

Discussion

Plusieurs étapes clés déterminent le succès d’un rendement élevé en liposomes pendant le processus de préparation. Pour dissoudre complètement le film lipidique dans l’huile, l’échantillon doit être soniqué jusqu’à ce que le film lipidique au fond du flacon en verre disparaisse complètement. Après la sonication, le mélange lipide-huile doit être stocké pendant la nuit à température ambiante dans des conditions sombres pour que les molécules lipidiques se dispersent davantage2...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous reconnaissons le financement ARO MURI W911NF-14-1-0403 à M.P.M., le National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 à M.P.M., les National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 et Human Frontiers Science Program (HFSP) numéro de subvention RGY0073/2018 à M.P.M. Toute opinion, constatation, conclusion ou recommandation exprimée dans ce document est celle de l’auteur (s) et ne reflète pas nécessairement les points de vue de l’ARO, des NIH ou du HFSP. S.C. reconnaît les discussions fructueuses avec V. Yadav, C. Muresan et S. Amiri.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaneSigmaD27802-25GDABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAKL99-Dnon-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAR05fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 dyeThermoFisherfluorescent dye
Andor iQ3Andor Technologiescontrol and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine BrainCytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
Calcium chloride dihydrateSigma10035048CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)Quorum Technologiesincubation chamber
Cofilin protein: human recombinantCytoskeleton, IncCF01-Ccofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glucose
DithiothreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens RecombinantCytoskeleton, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tipCole-ParmerUX-07940-53glass syringe
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alpha-PhosphatidylcholineAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
Magnesium chlorideSigma7786303MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oilSigma8042475mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Potassium chlorideSigma7447407KCl
SucroseSigma57-50-1sucrose
β-Casein from bovine milkSigmaC6905-250MG

Références

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