JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

Abstract

שלד האקטין (actin cytoskleton), המנגנון המכני העיקרי בתא, מתווך מספר רב של פעילויות פיזיות חיוניות, כולל דפורמציה של התא, חלוקה, נדידה והידבקות. עם זאת, חקר הדינמיקה והמבנה של רשת האקטין in vivo מסובך על ידי הרגולציה הביוכימית והגנטית בתוך תאים חיים. כדי לבנות מודל מינימלי נטול ויסות ביוכימי תוך-תאי, אקטין עטוף בתוך שלפוחיות חד-עיניות ענקיות (GUVs, הנקראות גם ליפוזומים). הליפוזומים הביומימטיים הם בגודל של תאים ומאפשרים תובנה כמותית לגבי התכונות המכניות והדינמיות של רשת השלד הציטוסקולרי, מה שפותח נתיב בר קיימא לביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה. כדי ליצור ליפוזומים לאנקפסולציה, נעשה שימוש בשיטת האמולסיה ההפוכה (המכונה גם שיטת העברת האמולסיה), שהיא אחת הטכניקות המוצלחות ביותר לכמוסות תמיסות מורכבות לליפוזומים כדי להכין מערכות שונות המחקות תאים. בשיטה זו, תערובת של חלבונים מעניינים מתווספת למאגר הפנימי, אשר מתחלב מאוחר יותר בתמיסת שמן מינרלי המכילה פוספוליפידים ליצירת טיפות שומנים חד-שכבתיות. הליפוזומים הרצויים מופקים מטיפות ליפידים חד-שכבתיות החוצות ממשק שומנים/שמן-מים. שיטה זו מאפשרת עטיפה של פולימרי אקטין מרוכזים לתוך הליפוזומים עם מרכיבי השומנים הרצויים, ובכך סוללת את הדרך לשחזור במבחנה של רשת ציטוסקלטון ביומימיק.

Introduction

שלד האקטין ממלא תפקיד בסיסי בבניית הארכיטקטורה התוך-תאית של התא על ידי תיאום התכווצות ברמה המולקולרית ויצירת כוח 1,2,3. כתוצאה מכך, הוא מתווך פעילויות תאיות חיוניות רבות, כולל עיוות תאים4,5, חלוקה6, נדידה 7,8 והידבקות9. שחזור מבחנה של רשתות אקטין זכה לתשומת לב עצומה בשנים האחרונות 10,11,12,13,14,15,16,17. מטרת השיקום היא לבנות מודל מינימלי של התא נטול הרגולציה הביוכימית המורכבת הקיימת בתוך תאים חיים. זה מציע סביבה ניתנת לשליטה כדי לחקור פעילויות תוך תאיות ספציפיות ומקל על זיהוי וניתוח של מרכיבים שונים של שלד אקטין18,19. יתר על כן, המעטפת של רשתות אקטין במבחנה בתוך שלפוחיות חד-עיניות ענקיות פוספוליפידיות (GUVs, ליפוזומים) מספקת מרחב מוגבל אך מעוות עם גבול חדיר למחצה. הוא מחקה את המיקרו-סביבה הפיזיולוגית והמכנית של מנגנון האקטין בתוך התא 9,20,21,22.

בין שיטות שונות להכנת ליפוזומים, שיטת הידרציה סרט שומנים (הידוע גם בשם שיטת הנפיחות) היא אחת הטכניקות המוקדמות ביותר23. סרט השומנים היבש מתמזג עם תוספת של מאגרים, ויוצר בועות ממברניות שהופכות בסופו של דבר לשלפוחיות24. כדי לייצר שלפוחיות גדולות יותר עם תפוקה גבוהה יותר, שיטה משופרת המתקדמת משיטת הידרציה הסרט, המכונה שיטת האלקטרופורמציה25, מפעילה שדה חשמלי AC כדי לקדם ביעילות את תהליך ההידרציה26. המגבלות העיקריות של שיטות מבוססות הידרציה אלה לכמוסות אקטין הן שיש לו יעילות אנקפסולציה נמוכה של חלבונים מרוכזים מאוד, והוא תואם רק להרכבי שומנים ספציפיים24. לשיטת האמולסיה ההפוכה, לשם השוואה, יש פחות מגבלות על מרכיבי השומנים וריכוזי החלבון20,27,28,29. בשיטה זו, תערובת של חלבונים עבור אנקפסולציה מתווספת למאגר מימי פנימי, אשר מתחלב מאוחר יותר בתמיסת שמן מינרלי המכילה שומנים, ויוצרת טיפות שומנים חד-שכבתיים. טיפות השומנים החד-שכבתיות עוברות דרך ממשק אחר של שומנים/שמן-מים דרך צנטריפוגה ויוצרות שלפוחיות ליפידים דו-שכבתיות (ליפוזומים). טכניקה זו הוכיחה את עצמה כאחת האסטרטגיות המוצלחות ביותר לאנקפסולציהשל אקטין 24,30. בנפרד, ישנן כמה שיטות של התקנים מיקרופלואידיים, כולל סילון פועם31,32, פליטת ממברנה חולפת33, ושיטת cDICE 34. קווי הדמיון בין שיטת התחליב ההפוך לבין השיטה המיקרופלואידית הם ממס השומנים (שמן) המשמש והכנסת ממשק שומנים/שמן-מים ליצירת העלון החיצוני של הליפוזומים. לעומת זאת, יצירת ליפוזומים בשיטה המיקרופלואידית דורשת מערך של התקנים מיקרופלואידיים ומלווה בשמן הכלוא בין שני העלונים של הדו-שכבתי, מה שדורש צעד נוסף להסרת שמן35.

בכתב יד זה, השתמשנו בטכניקת האמולסיה ההפוכה כדי להכין ליפוזומים העוטפים רשת F-אקטין פולימרית כפי שהיה נהוג בעבר22. תערובת החלבונים לאנקפסולציה הוכנסה לראשונה למאגר עם תנאים נון-פולימריזציה כדי לשמור על אקטין בצורתו הגלובולרית (G). התהליך כולו בוצע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע פילמור מוקדם של אקטין, אשר הופעל מאוחר יותר על ידי מתן אפשרות לדגימה להתחמם לטמפרטורת החדר. ברגע שהוא מגיע לטמפרטורת החדר, האקטין מתפלמר לצורתו החוטית (F). ניתן להוסיף מגוון חלבונים קושרי אקטין לתמיסת המאגר המימית הפנימית כדי לחקור את הפונקציונליות והתכונות של חלבונים, ובכך לספק עוד תובנות לגבי האינטראקציה שלו עם רשת האקטין ופני הממברנה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על אנקפסולציה של חלבונים שונים בעלי עניין36 ואובייקטים גדולים (מיקרו-חלקיקים, מיקרו-סווימימרים בעלי הנעה עצמית וכו') הקרובים לגודל הליפוזומים הסופיים 28,37.

Protocol

1. הכנת מאגרים ותמיסות חלבון

  1. הכן את המאגר הפנימי המיימי למניעת פילמור (INP) בנפח כולל של 5 מ"ל על ידי ערבוב של 0.1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 320 mM סוכרוז ו-0.2 mM ATP.
  2. הכינו את תערובת החלבונים (PM) על ידי הוספת חלבונים למאגר INP בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם הריכוזים הבאים: 11.2 μM G-אקטין שאינו פלואורסצנטי, 2.8 μM עם תווית פלואורסצנטית של אקטין, ו-0.24 μM Arp2/3 (טבלת חומרים). כדי ליצור שכבת F-actin, הוסיפו 100 ננומטר ג'לסולין, 4 μM קופילין ו-2.2 μM VCA-His ל-PM. כניסוי בקרה, החלף את PM ב-100 מיקרוגרם/מ"ל בצבע פלואורסצנטי (טבלת חומרים).
  3. הכן את חיץ הפילמור הפנימי (IP) (מימי) בנפח כולל של 5 מ"ל על ידי ערבוב 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP ו- 80 mM סוכרוז.
  4. הכן את המאגר הסופי (FB) על-ידי ערבוב מאגר INP (המכיל PM) ומאגר IP ביחס נפח של 1:1 כדי להפיק את התמיסה המימית הפנימית בנפח כולל של 30 μL שיהיה עטוף בתוך הליפוזום.
  5. הכן את המאגר החיצוני המיימי (OB) בנפח כולל של 150 μL על ידי ערבוב 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 212 mM גלוקוז, ו 0.1 מ"ג / מ"ל β קזאין.
    הערה: ניתן לכוונן את האוסמולריות של ה- OB עם גלוקוז כדי להבטיח שהלחץ האוסמוטי של ה- OB יהיה מעט גדול יותר מזה של ה- FB (20-60 mOsm). הצפיפות של FB צריך להיות מעט גבוה יותר מאשר OB.

2. הכנת ליפוזומים על בסיס טכניקות תחליב הפוך

  1. מכינים את תערובת שמן השומנים
    1. יש להוסיף 100 מיקרו-ליטר של 25 מ"ג/מ"ל L-α-פוספטידילכולין (Egg PC שאינו פלואורסצנטי, המכונה גם EPC, כולל 1% DHPE) לתוך בקבוקון זכוכית. מאדים כלורופורם בגז ארגון, ומשאירים שכבת שומנים מוצקה יבשה (2.5 מ"ג) בתחתית הבקבוקון.
      1. כדי ליצור שכבת F-actin, יש להוסיף 1,2-דיאולאויל-sn-glycero-3-{[n(5-אמינו-1-קרבוקסיפנטיל) חומצה אימינודיאצטית] succinyl} מלח ניקל (DOGS-NTA-Ni) ביחס של 10:1 של EPC ל-DOGS-NTA-Ni ולערבב לפני אידוי הכלורופורם.
    2. הוסיפו 2 מ"ל של שמן מינרלי וסונו את תערובת שמן השומנים בטמפרטורת החדר באמבטיה למשך שעה אחת כדי להשעות מחדש את השומנים.
      הערה: ניתן לשמור את תערובת השומנים-שמן לאחר סוניקציה למשך שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מומלץ לבצע סוניקציה מחדש לפני השימוש.
  2. הכינו חיץ סופי בתחליב שמן (FB/שמן) להכנת טיפות שומנים חד-שכבתיות המכילות את החלבון המעניין.
    1. ל-100 μL של תערובת שמן שומנים שנלקחה בצינור פלסטיק, הוסיפו 10 μL של FB. ודא כי FB הוא בטיפה אחת.
    2. באמצעות מזרק זכוכית, צייר את תערובת השומנים-שמן-FB ושאף בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לתחליב אותה; ציירו תחילה כמות קטנה של תערובת שומנים-שמן, ולאחר מכן את טיפת ה-FB על ידי הנחת קצה המזרק בשולי הטיפה כדי לפרק אותו לטיפות זעירות. חזור על השאיפה למעלה ולמטה עד שנוצר תחליב לבנבן ועכור.
  3. שים 30 μL של OB בצינור פלסטיק נפרד. מניחים 30 μL של תערובת שמן שומנים על גבי OB ולתת לו לשבת במשך ~ 10 דקות כדי לפתח מונולייר שומנים בממשק.
    הערה: אם השומנים טעונים או שהחלבון משולב, יש להאריך את משך שלב זה38.
  4. מכינים את הליפוזומים
    1. הוסיפו בזהירות 50 μL של תחליב FB/שמן (שלב 2.2) לשלב השמן העליון של הצינור משלב 2.3.
    2. צנטריפוגה צינור פלסטיק ב 100 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. זמן משתנה ומהירות צנטריפוגה כדי למטב להיווצרות ליפוזום.
      הערה: לאחר צנטריפוגה, שלב השמן העליון צריך להיות ברור, וה- OB התחתון (המכיל ליפוזומים) צריך להיות מעונן מעט.
    3. הסר בזהירות את שלב השמן על ידי פיפטה. שאפו אמצעי אחסון נוסף במידת הצורך. הקפידו לא לשים את קצה הפיפטה בצד הצינור כדי למנוע יצירת מניסקוס של שמן על גבי שלב הליפוזום.
    4. בעזרת פיפטה חדשה, הדביקו באיטיות את קצה הפיפטה לשלב התחתון שנותר ושאפו את הנפח המיימי לאיסוף ליפוזומים.
      הערה: עדיף לאבד נפח מאשר לשלב את השמן. הכללת השמן תגרום לקרע בליפוזומים, והרכיבים הפנימיים ישוחררו לתוך המאגר החיצוני. חותכים את קצה הפיפטה כדי להפחית את הגזירה.

3. תצפית מיקרוסקופיה

  1. יוצקים 100 μL של OB לתוך הבאר של תא דגירה (צלחת 4 באר המכילה 12 מ"מ כיסוי עגול). מפקידים בעדינות את הליפוזומים שנאספו (שלב 2.4.4) לתוך OB, ולאחר מכן מניחים כיסוי נוסף על גבי התא.
    הערה: ה- OB מכיל את ה- β קזאין כדי לעבור את משטח הזכוכית ולמזער את ההדבקה בין הליפוזומים20.
  2. התבונן בליפוזומים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרת טבילת שמן פי 63. השתמש בקווי לייזר של 488 ננומטר, 647 ננומטר ו-561 ננומטר כדי לצפות בליפידים המסומנים באופן פלואורסצנטי, בצבע פלואורסצנטי עטוף ובאקטין המסומן פלואורסצנטי, בהתאמה. צלם את המסגרות המעניינות ושמור את התמונות בפורמט TIFF.
  3. לעבד ולנתח תמונות ב- ImageJ/Fiji39. למשתמשים חדשים של ImageJ/Fiji, מדריך מקוון זמין (ראה טבלת חומרים).
    1. פתח את קובץ ה- TIFF באמצעות תוכנת ImageJ / פיג'י.
    2. עבור אל תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות. התאם את הבהירות והניגודיות של התמונה לקנה המידה הרצוי על-ידי התאמת ההגדרות 'מינימום ומקסימום' והמחוונים 'בהירות' ו'ניגודיות'.
    3. לחץ על הכלי בחירת מלבן בסרגל הכלים ובחר את אזור העניין (ROI). עבור אל חיתוך > תמונה כדי לחתוך את ההחזר על ההשקעה.
    4. עבור אל ניתוח קנה מידה > מוגדר. בחלון המוקפץ, הזינו 1.0 בשדה 'יחסי גודל של פיקסלים' והגדירו את μm כיחידת האורך. בשדה 'מרחק בפיקסלים', הזינו את רוחב התמונה בפיקסלים. בשדה 'מרחק ידוע', הזן את רוחב התמונה האמיתי במיקרונים.
    5. למדידת גודל הליפוזום, בעזרת הכלי בחירה אליפסה בסרגל הכלים, ציירו עיגול לאורך קצה הליפוזום. עבור אל נתח > מידה כדי למדוד את שטח המעגל, שממנו ניתן לחשב את קוטר הליפוזום.

תוצאות

הכנת ליפוזומים המבוססים על טכניקת האמולסיה ההפוכה מודגמת באופן גרפי וסכמטי באיור 1.

ראשית, הוכנו ליפוזומים ריקים (בקוטר ~5-50 מיקרומטר) שהורכבו מפוספוליפידים (EPC) ושומנים פלואורסצנטיים (DHPE). צבע פלואורסצנטי אדום בוהק נעטף בליפוזומים חשופים כניסוי בקרה. ניתן לק?...

Discussion

מספר שלבים מרכזיים קובעים את ההצלחה של תשואה גבוהה של ליפוזומים במהלך תהליך ההכנה. כדי להמיס לחלוטין את שכבת השומנים בשמן, יש לנתק את הדגימה עד ששכבת השומנים בתחתית בקבוקון הזכוכית תיעלם לחלוטין. לאחר הסוניקציה, יש לאחסן את תערובת שמן השומנים למשך הלילה בטמפרטורת החדר בתנאים חשוכים כדי שמ...

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

אנו מכירים במימון ARO MURI W911NF-14-1-0403 ל- M.P.M., המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 1R01GM126256 ל- M.P.M., המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, אוניברסיטת מישיגן / Genentech, SUBK00016255 ותוכנית המדע של גבולות האדם (HFSP) מספר מענק RGY0073/2018 ל- M.P.M. כל דעה, ממצא, מסקנות או המלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים/ים ואינן משקפות בהכרח את דעותיהם של ה-ARO, NIH או HFSP. ס.צ. מכיר בדיונים פוריים עם ו' ידב, ג' מורסן וס' אמירי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaneSigmaD27802-25GDABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAKL99-Dnon-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAR05fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 dyeThermoFisherfluorescent dye
Andor iQ3Andor Technologiescontrol and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine BrainCytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
Calcium chloride dihydrateSigma10035048CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)Quorum Technologiesincubation chamber
Cofilin protein: human recombinantCytoskeleton, IncCF01-Ccofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glucose
DithiothreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens RecombinantCytoskeleton, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tipCole-ParmerUX-07940-53glass syringe
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alpha-PhosphatidylcholineAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
Magnesium chlorideSigma7786303MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oilSigma8042475mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Potassium chlorideSigma7447407KCl
SucroseSigma57-50-1sucrose
β-Casein from bovine milkSigmaC6905-250MG

References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. . Methods in Cell Biology. 128, 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -. T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. . Reconstituting the Cytoskeleton. , (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. . Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved