In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Riepilogo

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

Abstract

Il citoscheletro di actina, il principale macchinario meccanico nella cellula, media numerose attività fisiche cellulari essenziali, tra cui la deformazione, la divisione, la migrazione e l'adesione cellulare. Tuttavia, lo studio della dinamica e della struttura della rete di actina in vivo è complicato dalla regolazione biochimica e genetica all'interno delle cellule vive. Per costruire un modello minimale privo di regolazione biochimica intracellulare, l'actina viene incapsulata all'interno di vescicole unilamellari giganti (GUV, chiamate anche liposomi). I liposomi biomimetici sono di dimensioni cellulari e facilitano una comprensione quantitativa delle proprietà meccaniche e dinamiche della rete del citoscheletro, aprendo una strada praticabile per la biologia sintetica bottom-up. Per generare liposomi per l'incapsulamento, viene utilizzato il metodo dell'emulsione invertita (noto anche come metodo di trasferimento dell'emulsione), che è una delle tecniche di maggior successo per incapsulare soluzioni complesse in liposomi per preparare vari sistemi di imitazione cellulare. Con questo metodo, una miscela di proteine di interesse viene aggiunta al tampone interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente fosfolipidi per formare goccioline lipidiche monostrato. I liposomi desiderati sono generati da goccioline lipidiche monostrato che attraversano un'interfaccia lipide/olio-acqua. Questo metodo consente l'incapsulamento di polimeri di actina concentrati nei liposomi con i componenti lipidici desiderati, aprendo la strada alla ricostituzione in vitro di una rete di citoscheletri biomima.

Introduzione

Il citoscheletro di actina svolge un ruolo fondamentale nella costruzione dell'architettura intracellulare della cellula coordinando la contrattilità a livello molecolare e la generazione di forza ^1,2,3. Di conseguenza, media numerose attività cellulari essenziali, tra cui la deformazione cellulare^4,5, la divisione⁶, la migrazione ^7,8 e l'adesione⁹. La ricostituzione in vitro delle reti di actina ha guad....

Protocollo

1. Preparazione di tamponi e soluzioni proteiche

1. Preparare il tampone acquoso interno di non polimerizzazione (INP) in un volume totale di 5 mL miscelando 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccarosio e_0,2 mM ATP.
2. Preparare il mix proteico (PM) aggiungendo proteine al tampone INP a 4 °C con le seguenti concentrazioni: 11,2 μM di G-actina non fluorescente, 2,8 μM di actina marcata con fluorescenza e 0,24 μM di Arp2/3 (Tabella dei materiali). Per formare uno strato di F-actina, aggiungere 100 nM gelsolina, 4 μM cofilina e 2,2 μM VCA-His al PM. Come esperimento di controllo,....

Risultati

La preparazione dei liposomi basata sulla tecnica dell'emulsione invertita è illustrata graficamente e schematicamente nella Figura 1.

In primo luogo, sono stati preparati liposomi vuoti (~ 5-50 μm di diametro) composti da fosfolipidi (EPC) e lipidi fluorescenti (DHPE). Un colorante fluorescente brillante e rosso lontano è stato incapsulato all'interno di liposomi nudi come esperimento di controllo. Se un monostrato lipidico si è formato con successo nella per.......

Discussione

Diversi passaggi chiave determinano il successo di un'alta resa di liposomi durante il processo di preparazione. Per sciogliere completamente il film lipidico nell'olio, il campione deve essere sonicato fino a quando il film lipidico sul fondo della fiala di vetro scompare completamente. Dopo la sonicazione, la miscela di olio lipidico deve essere conservata durante la notte a temperatura ambiente in condizioni di oscurità affinché le molecole lipidiche si disperdano ulteriormente²⁹. La miscela .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)	Avanti Polar Lipids Inc.	231615773	Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane	Sigma	D27802-25G	DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AKL99-D	non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AR05	fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma	A2383-10G	ATP
Alexa Fluor 647 dye	ThermoFisher		fluorescent dye
Andor iQ3	Andor Technologies		control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain	Cytoskeleton, Inc	RP01P-A	Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate	Sigma	10035048	CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)	Quorum Technologies		incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant	Cytoskeleton, Inc	CF01-C	cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)	Andor Technologies	LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA	Sigma	G7528	glucose
Dithiothreitol	DOT Scientific	DSD11000-10	DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant	Cytoskeleton, Inc	HPG6	gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip	Cole-Parmer	UX-07940-53	glass syringe
HEPES	AmericanBio	7365-45-9
ImageJ/Fiji			https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids Inc.	97281442	EPC
Magnesium chloride	Sigma	7786303	MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil	Sigma	8042475	mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)			VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)	Thermo Fisher	O12650	DHPE
Potassium chloride	Sigma	7447407	KCl
Sucrose	Sigma	57-50-1	sucrose
β-Casein from bovine milk	Sigma	C6905-250MG