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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

Zusammenfassung

Das Aktinzytoskelett, die wichtigste mechanische Maschinerie in der Zelle, vermittelt zahlreiche wesentliche physikalische zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zellverformung, Teilung, Migration und Adhäsion. Die Untersuchung der Dynamik und Struktur des Aktinnetzwerks in vivo wird jedoch durch die biochemische und genetische Regulation innerhalb lebender Zellen erschwert. Um ein minimales Modell ohne intrazelluläre biochemische Regulation zu erstellen, wird Aktin in riesige unilamellare Vesikel (GUVs, auch Liposomen genannt) eingekapselt. Die biomimetischen Liposomen sind zellgroß und ermöglichen einen quantitativen Einblick in die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zytoskelett-Netzwerks, was einen gangbaren Weg für die synthetische Bottom-up-Biologie eröffnet. Um Liposomen für die Verkapselung zu erzeugen, wird die invertierte Emulsionsmethode (auch als Emulsionstransfermethode bezeichnet) verwendet, eine der erfolgreichsten Techniken zur Verkapselung komplexer Lösungen in Liposomen, um verschiedene zellnachahmende Systeme herzustellen. Bei dieser Methode wird dem inneren Puffer eine Mischung interessanter Proteine zugegeben, die später in einer phospholipidhaltigen Mineralöllösung zu einschichtigen Lipidtröpfchen emulgiert wird. Die gewünschten Liposomen werden aus einschichtigen Lipidtröpfchen erzeugt, die eine Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche kreuzen. Diese Methode ermöglicht die Verkapselung konzentrierter Aktinpolymere in die Liposomen mit gewünschten Lipidkomponenten und ebnet den Weg für die in vitro Rekonstitution eines bioimitierenden Zytoskelett-Netzwerks.

Einleitung

Das Aktinzytoskelett spielt eine grundlegende Rolle beim Aufbau der intrazellulären Architektur der Zelle, indem es die Kontraktilität auf molekularer Ebene und die Krafterzeugung koordiniert 1,2,3. Infolgedessen vermittelt es zahlreiche essentielle zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zelldeformation4,5, Division6, Migration 7,8 und Adhäsion9. Die in vitro Rekonstitution von Aktinnetzwerken hat in den letzten Jahren enorme Aufmerksamkeit erlangt 10,11,12,13,14,15,16,17. Das Ziel der Rekonstitution ist es, ein Minimalmodell der Zelle ohne die komplexe biochemische Regulation zu erstellen, die in lebenden Zellen existiert. Dies bietet eine kontrollierbare Umgebung zur Untersuchung spezifischer intrazellulärer Aktivitäten und erleichtert die Identifizierung und Analyse verschiedener Komponenten des Aktinzytoskeletts18,19. Darüber hinaus bietet die Verkapselung von in vitro Aktinnetzwerken in Phospholipid-Riesen-Unilamellenvesikeln (GUVs, Liposomen) einen begrenzten, aber deformierbaren Raum mit einer semipermeablen Grenze. Es ahmt die physiologische und mechanische Mikroumgebung der Aktinmaschinerie innerhalb der Zelle 9,20,21,22 nach.

Unter verschiedenen Methoden zur Herstellung von Liposomen ist die Lipidfilmhydratationsmethode (auch bekannt als Quellmethode) eine der frühesten Techniken23. Der trockene Lipidfilm hydratisiert unter Zugabe von Puffern und bildet membranöse Blasen, die schließlich zu Vesikeln werden24. Um größere Vesikel mit einer höheren Ausbeute zu erzeugen, wendet ein verbessertes Verfahren, das von der Filmhydratationsmethode fortschreitet, bekannt als Elektrobildungsmethode25, ein elektrisches Wechselstromfeld an, um den Hydratationsprozess26 effizient zu fördern. Die Haupteinschränkungen dieser hydratationsbasierten Methoden zur Aktinverkapselung bestehen darin, dass sie eine geringe Verkapselungseffizienz von hochkonzentrierten Proteinen aufweist und nur mit spezifischen Lipidzusammensetzungen kompatibel ist24. Die invertierte Emulsionstechnik hat im Vergleich dazu weniger Einschränkungen für Lipidkomponenten und Proteinkonzentrationen20,27,28,29. Bei diesem Verfahren wird eine Mischung von Proteinen zur Verkapselung in den inneren wässrigen Puffer gegeben, der später in einer lipidhaltigen Mineralöllösung emulgiert wird, wobei Lipid-Monoschicht-Tröpfchen gebildet werden. Die einschichtigen Lipidtröpfchen durchqueren dann durch Zentrifugation eine weitere Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche, um zweischichtige Lipidvesikel (Liposomen) zu bilden. Diese Technik hat sich als eine der erfolgreichsten Strategien zur Aktinverkapselung24,30 erwiesen. Unabhängig davon gibt es einige mikrofluidische Gerätemethoden, einschließlich gepulstes Jetting31,32, transienten Membranauswurf 33 und das cDICE-Verfahren 34. Die Ähnlichkeiten zwischen der inversen Emulsionsmethode und der mikrofluidischen Methode sind das verwendete Lipidlösungsmittel (Öl) und die Einführung einer Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche für die Bildung des äußeren Blattes von Liposomen. Im Gegensatz dazu erfordert die Erzeugung von Liposomen durch das mikrofluidische Verfahren einen Aufbau mikrofluidischer Vorrichtungen und wird von Öl begleitet, das zwischen den beiden Blättchen der Doppelschicht eingeschlossen ist, was einen zusätzlichen Schritt zur Ölentfernung erfordert35.

In diesem Manuskript verwendeten wir die invertierte Emulsionstechnik, um Liposomen herzustellen, die ein polymerisiertes F-Aktin-Netzwerk einkapseln, wie zuvor verwendet22. Die Proteinmischung für die Verkapselung wurde zunächst in einen Puffer mit nichtpolymerisierenden Bedingungen gegeben, um Aktin in seiner globulären (G) Form zu erhalten. Der gesamte Prozess wurde bei 4 °C durchgeführt, um eine frühe Aktinpolymerisation zu verhindern, die später ausgelöst wurde, indem die Probe auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Bei Raumtemperatur polymerisiert das Aktin in seine filamentöse (F) Form. Eine Vielzahl von Aktin-bindenden Proteinen kann der inneren wässrigen Pufferlösung hinzugefügt werden, um Proteinfunktionalitäten und -eigenschaften zu untersuchen und so weitere Einblicke in ihre Interaktion mit dem Aktinnetzwerk und der Membranoberfläche zu erhalten. Dieses Verfahren kann auch auf die Verkapselung verschiedener Proteine von Interesse36 und großer Objekte (Mikropartikel, selbstfahrende Mikroschwimmer usw.) nahe der Größe der endgültigen Liposomen 28,37 angewendet werden.

Protokoll

1. Herstellung von Puffern und Proteinlösungen

  1. Bereiten Sie den wässrigen inneren Nichtpolymerisationspuffer (INP) in einem Gesamtvolumen von 5 ml durch Mischen von 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM Saccharose und0,2 mM ATP vor.
  2. Bereiten Sie den Proteinmix (PM) vor, indem Sie dem INP-Puffer bei 4 °C Proteine mit folgenden Konzentrationen hinzufügen: 11,2 μM nicht-fluoreszierendes G-Aktin, 2,8 μM fluoreszenzmarkiertes Aktin und 0,24 μM Arp2/3 (Materialtabelle). Um eine F-Aktin-Schicht zu bilden, fügen Sie dem PM 100 nM Gelsolin, 4 μM Cofilin und 2,2 μM VCA-His hinzu. Als Kontrollexperiment PM durch 100 μg/ml Fluoreszenzfarbstoff ersetzen (Table of Materials).
  3. Der wässrige innere Polymerisationspuffer (IP) (wässrig) wird in einem Gesamtvolumen von 5 mL durch Mischen von 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP und 80 mM Saccharose hergestellt.
  4. Bereiten Sie den Endpuffer (FB) vor, indem Sie INP-Puffer (mit PM) und IP-Puffer in einem Volumenverhältnis von 1: 1 mischen, um die innere wässrige Lösung in einem Gesamtvolumen von 30 μL zu erhalten, das im Liposom verkapselt wird.
  5. Bereiten Sie den wässrigen Außenpuffer (OB) in einem Gesamtvolumen von 150 μL durch Mischen von 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM Glucose und0,1 mg/ml β-Kasein vor.
    HINWEIS: Die Osmolarität des OB kann mit Glukose eingestellt werden, um sicherzustellen, dass der osmotische Druck des OB etwas größer ist als der des FB (20-60 mOsm). Die Dichte des FB sollte etwas höher sein als der OB.

2. Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik

  1. Lipid-Öl-Mischung vorbereiten
    1. 100 μL 25 mg/ml L-α-Phosphatidylcholin (nicht fluoreszierendes Ei-PC, auch EPC genannt, einschließlich 1% DHPE) in eine Durchstechflasche aus Glas geben. Verdampfen Sie Chloroform mit Argongas, wobei ein trockener fester Lipidfilm (2,5 mg) am Boden der Durchstechflasche verbleibt.
      1. Um eine F-Aktinschicht zu bilden, wird 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaessigsäure]succinyl}-nickelsalz (DOGS-NTA-Ni) im Verhältnis 10:1 von EPC zu DOGS-NTA-Ni gegeben und vor dem Verdampfen von Chloroform gemischt.
    2. Fügen Sie 2 ml Mineralöl hinzu und beschallen Sie das Lipid-Öl-Gemisch bei Raumtemperatur in einem Bad für 1 h, um die Lipide wieder zu suspendieren.
      HINWEIS: Das Lipid-Öl-Gemisch nach der Beschallung kann 1 Woche bei 4 °C aufbewahrt werden. Eine Beschallung wird vor dem Gebrauch empfohlen.
  2. Bereiten Sie eine Final Buffer in Öl (FB / Öl) Emulsion zur Herstellung von Monolayer-Lipidtröpfchen vor, die das interessierende Protein enthalten.
    1. Zu 100 μL Lipid-Öl-Gemisch in einem Kunststoffröhrchen 10 μL FB hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass sich FB in einem Tröpfchen befindet.
    2. Verwenden Sie eine Glasspritze, ziehen Sie die Lipid-Öl-FB-Mischung und saugen Sie sie mehrmals vorsichtig auf und ab, um sie zu emulgieren. Ziehen Sie zuerst eine kleine Menge Lipid-Öl-Gemisch und dann das FB-Tröpfchen, indem Sie die Spitze der Spritze an den Rand des Tröpfchens legen, um es in winzige Tröpfchen aufzubrechen. Wiederholen Sie die Auf- und Abaspiration, bis sich eine weißliche und trübe Emulsion gebildet hat.
  3. Geben Sie 30 μL OB in ein separates Kunststoffröhrchen. Geben Sie 30 μL der Lipid-Öl-Mischung auf OB und lassen Sie sie ~10 Minuten ruhen, um eine Lipidmonoschicht an der Grenzfläche zu entwickeln.
    HINWEIS: Wenn die Lipide geladen sind oder das Protein eingebaut ist, sollte die Dauer dieses Schritts verlängert werden38.
  4. Liposomen vorbereiten
    1. Geben Sie vorsichtig 50 μL der FB/Ölemulsion (Schritt 2.2) in die obere Ölphase des Röhrchens aus Schritt 2.3.
    2. Zentrifugieren Sie das Kunststoffröhrchen bei 100 x g für 15 Minuten bei 4 °C. Variieren Sie Zeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit, um die Liposomenbildung zu optimieren.
      HINWEIS: Nach der Zentrifugation sollte die obere Ölphase klar sein und der untere OB (mit Liposomen) sollte leicht trüb sein.
    3. Entfernen Sie die Ölphase vorsichtig per Pipette. Bei Bedarf zusätzliches Volumen absaugen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitze nicht an die Seite des Röhrchens legen, um zu vermeiden, dass ein Meniskus aus Öl auf der Liposomenphase entsteht.
    4. Mit einer neuen Pipette stecken Sie die Pipettenspitze langsam in die verbleibende untere Phase und saugen Sie das wässrige Volumen ab, um Liposomen zu sammeln.
      HINWEIS: Es ist besser, Volumen zu verlieren, als das Öl einzuarbeiten. Der Einschluss von Öl führt dazu, dass Liposomen reißen und die internen Komponenten in den externen Puffer freigesetzt werden. Schneiden Sie die Spitze einer Pipette ab, um die Scherung zu reduzieren.

3. Mikroskopische Beobachtung

  1. Gießen Sie 100 μL OB in die Vertiefung einer Inkubationskammer (4-Well-Platte mit 12 mm runden Deckgläsern). Die gesammelten Liposomen (Schritt 2.4.4) werden vorsichtig in OB gegeben und dann ein weiteres Deckglas auf die Kammer gelegt.
    HINWEIS: Der OB enthält das β-Kasein, um die Glasoberfläche zu passivieren und das Anhaften zwischen den Liposomen20 zu minimieren.
  2. Beobachten Sie Liposomen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Öl-Immersionsobjektiv. Verwenden Sie 488 nm, 647 nm und 561 nm Laserlinien, um fluoreszenzmarkiertes Lipid, verkapselten Fluoreszenzfarbstoff bzw. verkapseltes fluoreszierend markiertes Aktin zu beobachten. Erfassen Sie die gewünschten Frames und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format.
  3. Verarbeiten und analysieren Sie Bilder in ImageJ/Fiji39. Für neue Benutzer von ImageJ/Fiji steht ein Online-Tutorial zur Verfügung (siehe Materialtabelle).
    1. Öffnen Sie die TIFF-Datei mit der ImageJ/Fiji-Software.
    2. Gehen Sie zu Bild > passen Sie > Helligkeit/Kontrast an. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes auf den gewünschten Maßstab an, indem Sie die Einstellungen Minimum und Maximum sowie die Schieberegler Helligkeit und Kontrast anpassen.
    3. Klicken Sie in der Symbolleiste auf das Auswahlwerkzeug Rechteck und wählen Sie den gewünschten Bereich (ROI) aus. Gehen Sie zu Bild > Zuschneiden , um den ROI zu erhöhen.
    4. Wechseln Sie zu Analysieren > festgelegten Maßstab. Geben Sie im Popup-Fenster 1.0 in das Feld Pixel-Seitenverhältnis ein und legen Sie μm als Längeneinheit fest. Geben Sie im Feld Abstand in Pixel die Bildbreite in Pixel ein. Geben Sie im Feld Bekannte Entfernung die tatsächliche Bildbreite in Mikrometern ein.
    5. Um die Größe des Liposoms zu messen, zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug "Oval " in der Symbolleiste einen Kreis entlang der Kante des Liposoms. Gehen Sie zu Analysieren > Messen , um die Fläche des Kreises zu messen, aus der der Durchmesser des Liposoms berechnet werden kann.

Ergebnisse

Die Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik ist in Abbildung 1 grafisch und schematisch dargestellt.

Zunächst wurden leere (nackte) Liposomen (~5-50 μm Durchmesser) hergestellt, die aus Phospholipid (EPC) und fluoreszierendem Lipid (DHPE) zusammengesetzt waren. Ein heller, tiefroter Fluoreszenzfarbstoff wurde als Kontrollexperiment in nackte Liposomen eingekapselt. Ob sich eine Lipidmonoschicht erfolgreich in der Peripherie des Tröpfch...

Diskussion

Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg einer hohen Ausbeute an Liposomen während des Herstellungsprozesses. Um den Lipidfilm im Öl vollständig aufzulösen, muss die Probe beschallt werden, bis der Lipidfilm am Boden der Glasdurchstechflasche vollständig verschwindet. Nach der Beschallung muss das Lipid-Öl-Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen gelagert werden, damit sich die Lipidmoleküle weiter verteilenkönnen 29. Die Mischung kann bis zu einer Woche bei 4...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir bestätigen die Finanzierung von ARO MURI W911NF-14-1-0403 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 und die Fördernummer RGY0073/2018 des Human Frontiers Science Program (HFSP) an M.P.M. Alle Meinungen, Ergebnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der ARO, NIH oder HFSP wider. S.C. würdigt fruchtbare Gespräche mit V. Yadav, C. Muresan und S. Amiri.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaneSigmaD27802-25GDABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAKL99-Dnon-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAR05fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 dyeThermoFisherfluorescent dye
Andor iQ3Andor Technologiescontrol and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine BrainCytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
Calcium chloride dihydrateSigma10035048CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)Quorum Technologiesincubation chamber
Cofilin protein: human recombinantCytoskeleton, IncCF01-Ccofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glucose
DithiothreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens RecombinantCytoskeleton, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tipCole-ParmerUX-07940-53glass syringe
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alpha-PhosphatidylcholineAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
Magnesium chlorideSigma7786303MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oilSigma8042475mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Potassium chlorideSigma7447407KCl
SucroseSigma57-50-1sucrose
β-Casein from bovine milkSigmaC6905-250MG

Referenzen

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