JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

本稿では、F-アクチン細胞骨格を巨大な単層脂質小胞(リポソームとも呼ばれる)に封入する実験技術と、リポソーム膜の内小葉に皮質生物模倣型F-アクチン層を形成する方法を示す。

要約

細胞内の主要な機械的機構であるアクチン細胞骨格は、細胞の変形、分裂、遊走、および接着を含む多数の重要な物理的細胞活動を媒介する。しかし、 インビボ でのアクチンネットワークのダイナミクスと構造の研究は、生細胞内の生化学的および遺伝的調節によって複雑になる。細胞内生化学的調節を欠いた最小モデルを構築するために、アクチンは巨大な単層小胞(GUV、リポソームとも呼ばれる)の内部に封入される。生体模倣リポソームは細胞サイズであり、細胞骨格ネットワークの機械的および動的特性に対する定量的洞察を容易にし、ボトムアップ合成生物学のための実行可能なルートを開く。封入用のリポソームを生成するために、反転エマルジョン法(エマルジョン移動法とも呼ばれる)が利用され、これは複雑な溶液をリポソームに封入して様々な細胞模倣系を調製するための最も成功した技術の1つである。この方法では、目的のタンパク質の混合物を内部緩衝液に添加し、これを後でリン脂質含有鉱物油溶液に乳化させて単層脂肪滴を形成する。所望のリポソームは、脂質/油水界面を横切る単層脂肪滴から生成される。この方法は、所望の脂質成分を含むリポソームへの濃縮アクチンポリマーのカプセル化を可能にし、生体模倣細胞骨格ネットワークの in vitro 再構成への道を開く。

概要

アクチン細胞骨格は、分子レベルの収縮性と力発生1,2,3を調整することによって、細胞の細胞内構造を構築する上で基本的な役割を果たす。その結果、細胞変形4、5、分裂6、遊走7、8、および接着9を含む多数の重要な細胞活動を媒介する。アクチンネットワークのインビトロ再構成は、近年10、11、12、13、14、15、16、17で大きな注目を集めている。再構成の目標は、生細胞内に存在する複雑な生化学的調節を欠いている細胞の最小モデルを構築することである。これは、特定の細胞内活動をプローブするための制御可能な環境を提供し、アクチン細胞骨格18、19の異なる成分の同定および分析を容易にする。さらに、リン脂質巨大単層小胞(GUV、リポソーム)内のインビトロアクチンネットワークのカプセル化は、半透過性の境界を有する閉じ込められたが変形可能な空間を提供する。細胞9、20、21、22内のアクチン機構の生理学的および機械的微小環境を模倣する。

リポソームを調製するための様々な方法の中で、脂質膜水和法(膨潤法としても知られる)は、最も初期の技術の1つである23。乾燥脂質膜は、緩衝液を添加して水和し、膜状の気泡を形成し、最終的に小胞24となる。より大きな小胞をより高い収率で製造するために、電形成法25として知られる膜水和法から進歩する改良された方法は、交流電界を印加して水和プロセス26を効率的に促進する。アクチン封入のためのこれらの水和ベースの方法の主な制限は、高濃度タンパク質のカプセル化効率が低く、かつ特定の脂質組成物とのみ適合性があることである24。この反転エマルジョン技術は、比較して、脂質成分およびタンパク質濃度に対する制限が少ない20、27、28、29である。この方法では、カプセル化のためのタンパク質の混合物が内部水性緩衝液に添加され、これは後で脂質含有鉱物油溶液中で乳化され、脂質単層液滴を形成する。次いで、単層脂肪滴は、遠心分離を介して別の脂質/油水界面を通過し、二重層脂質小胞(リポソーム)を形成する。この技術は、アクチンカプセル化のための最も成功した戦略の1つであることが証明されています24,30。これとは別に、パルス噴出31、32、過渡膜噴出33、およびcDICE法34を含むいくつかのマイクロ流体デバイス法がある。逆乳化法とマイクロ流体法の類似点は、利用される脂質溶媒(油)と、リポソームの外側小葉の形成のための脂質/油水界面の導入である。対照的に、マイクロ流体法によるリポソームの生成は、マイクロ流体デバイスのセットアップを必要とし、二重層の2つの小葉の間に閉じ込められた油を伴い、これは、油除去のための余分なステップを必要とする35。

この原稿では、以前に使用したように、逆エマルジョン技術を使用して、重合F-アクチンネットワークを封入したリポソームを調製した22。封入用のタンパク質混合物を、まず、アクチンをその球状(G)形態に維持するために、非重合条件を有する緩衝液に入れた。初期のアクチン重合を防ぐために、全プロセスを4°Cで実施し、後にサンプルを室温まで昇温させることによって引き起こされた。室温で一旦、アクチンは重合して糸状(F)形態になる。様々なアクチン結合タンパク質を内部水性緩衝液に添加して、タンパク質の機能性および特性を研究することができ、したがって、アクチンネットワークおよび膜表面との相互作用に関する洞察をさらに提供する。この方法は、最終リポソーム28、37のサイズに近い目的の様々なタンパク質36および大きな物体(微粒子、自走式マイクロスイマーなど)の封入にも適用することができる。

プロトコル

1. 緩衝液およびタンパク質溶液の調製

  1. 0.1 mM CaCl 2、10 mM HEPES (pH 7.5)、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、320 mM スクロース、および 0.2 mM ATP を混合して、全容量 5 mL の水性内部非重合 (INP) バッファーを調製します。
  2. タンパク質ミックス(PM)を調製するには、11.2 μM 非蛍光 G-アクチン、2.8 μM 蛍光標識アクチン、および 0.24 μM Arp2/3 (材料表) の濃度で INP バッファーにタンパク質を添加します。F-アクチン層を形成するには、100 nM ゲルソリン、4 μM コフィリン、および 2.2 μM VCA-His を PM に加えます。対照実験として、PMを100μg/mLの蛍光色素で置き換えます(材料表)。
  3. 100 mM KCl、4 mM MgCl2、10 mM HEPES (pH 7.5)、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、10 mM ATP、および 80 mM スクロースを混合して、全容量 5 mL の水性内部重合(IP)バッファー (水性) を調製します。
  4. INPバッファー(PMを含む)とIPバッファーを1:1の容量比で混合して最終バッファー(FB)を調製し、リポソーム内に内包される全容量30μLの内水溶液を得た。
  5. 10 mM HEPES (pH 7.5)、50 mM KCl、2mM MgCl 2、0.2 mM CaCl 2、2mM ATP、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、212 mM グルコース、および 0.1 mg/mL β-カゼインを混合して、全容量 150 μL の水性アウトサイドバッファー (OB) を調製します。
    注:OBの浸透圧は、OBの浸透圧がFB(20-60mOsm)の浸透圧よりもわずかに大きいことを保証するためにグルコースで調整することができます。FBの密度はOBよりわずかに高くなければなりません。

反転エマルジョン技術に基づくリポソームの調製

  1. 脂質-油混合物を調製する
    1. 100 μL の 25 mg/mL L-α-ホスファチジルコリン (非蛍光エッグPC、EPC とも呼ばれ、1% DHPE を含む) をガラスバイアルに入れます。クロロホルムをアルゴンガスで蒸発させ、バイアルの底に乾燥固体脂質膜(2.5mg)を残す。
      1. F-アクチン層を形成するには、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-{[n(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル}ニッケル塩(DOGS-NTA-Ni)をEPCとDOGS-NTA-Niの比率で10:1の比率で加え、クロロホルムの蒸発前に混合する。
    2. 2mLの鉱油を加え、脂質 - 油混合物を室温で1時間浴中で超音波処理して脂質を再懸濁させる。
      注:超音波処理後の脂質 - 油混合物は、4°Cで1週間保持することができます。 使用前に再超音波処理が推奨されます。
  2. 目的のタンパク質を含む単層脂肪滴を調製するための最終緩衝液(FB /オイル)エマルジョンを調製する。
    1. プラスチックチューブに取り込んだ脂質-油混合物100 μLに、FBを10 μL加える。FB が 1 つの液滴に入っていることを確認します。
    2. ガラスシリンジを使用して、脂質 - 油 - FB混合物を引き出し、それを乳化するために複数回静かに上下に吸引する。最初に少量の脂質 - 油混合物を引き出し、次にシリンジの先端を液滴の周囲に配置してFB液滴を小さな液滴に分解する。白っぽくて濁ったエマルジョンが形成されるまで、上下の吸引を繰り返します。
  3. 30 μLのOBを別のプラスチックチューブに入れます。30μLの脂質-油混合物をOBの上に置き、それを約10分間放置して界面に脂質単層を発達させる。
    注:脂質が荷電している場合、またはタンパク質が組み込まれている場合、このステップの持続時間は延長されるべきである38。
  4. リポソームを調製する
    1. 50 μLのFB/オイルエマルジョン(ステップ2.2)をステップ2.3のチューブの上部油相に慎重に加えます。
    2. プラスチックチューブを100 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 リポソーム形成のために最適化するために時間と遠心分離速度を変化させる。
      注:遠心分離後、上部の油相は透明であるべきであり、下部OB(リポソームを含む)はわずかに濁っているべきである。
    3. 油相をピペットで慎重に取り除きます。必要に応じて余分なボリュームを吸引します。リポソーム相の上にオイルのメニスカスを作らないように、ピペットチップをチューブの側面に置かないようにしてください。
    4. 新しいピペットで、ピペットチップを残りの底相にゆっくりと突き刺し、水性ボリュームを吸引してリポソームを回収する。
      注:オイルを組み込むよりも、ボリュームを失う方が良いです。油分を含めるとリポソームが破裂し、内部成分が外部バッファーに放出されます。せん断を減らすためにピペットの先端を切断します。

3. 顕微鏡観察

  1. 100 μL の OB をインキュベーションチャンバー (12 mm の丸いカバーグラスを含む 4 ウェルプレート) のウェルに注ぎます。回収したリポソームをOBに静かに沈着させ(ステップ2.4.4)、チャンバーの上に別のカバースリップを置きます。
    注:OBは、ガラス表面を不動態化し、リポソーム20間の固着を最小限に抑えるために、β-カゼインを含有する。
  2. 63倍の油浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡でリポソームを観察します。488 nm、647 nm、および 561 nm のレーザーラインを使用して、蛍光標識脂質、封入蛍光色素、および封入蛍光標識アクチンをそれぞれ観察します。目的のフレームをキャプチャし、TIFF形式で画像を保存します。
  3. ImageJ/Fiji39で画像を処理および分析します。ImageJ/Fijiの新規ユーザー向けには、オンラインチュートリアルをご用意しています( 資料表を参照)。
    1. ImageJ/Fijiソフトウェアを使用してTIFFファイルを開きます。
    2. 画像に移動し>明るさ/コントラスト>調整します。画像の明るさとコントラストを目的のスケールに調整するには、「最小」と「最大」の設定、および「明るさ」スライダと「コントラスト」スライダを調整します。
    3. ツールバーの 長方形 選択ツールをクリックし、関心領域(ROI)を選択します。 [画像>トリミング] に移動してROIをトリミングします。
    4. [分析] > [スケールの設定] に移動します。ポップアップウィンドウで、「ピクセル縦横比」フィールドに「1.0」と入力し、「長さの単位」として μm を設定します。「ピクセル単位の距離」フィールドに、画像の幅をピクセル単位で入力します。[既知の距離] フィールドに、実際の画像幅をミクロン単位で入力します。
    5. リポソームのサイズを測定するには、ツールバーの 楕円形 選択ツールを使用して、リポソームの端に沿って円を描きます。 [分析>測定] に移動して、リポソームの直径を計算できる円の面積を測定します。

結果

反転エマルジョン技術に基づくリポソームの調製を、 図1にグラフィカルかつ概略的に例示する。

まず、リン脂質(EPC)および蛍光脂質(DHPE)で構成された空(ベア)リポソーム(直径約5〜50μm)を調製した。対照実験として、明るい遠赤色蛍光色素を裸のリポソーム内に封入した。液滴の周囲に脂質単層が首尾よく形成されたかどうかは、図...

ディスカッション

いくつかの重要なステップは、調製プロセス中の高収率のリポソームの成功を決定する。油中の脂質膜を完全に溶解するには、ガラスバイアルの底部の脂質膜が完全に消失するまでサンプルを超音波処理しなければならない。超音波処理の後、脂質 - 油混合物は、脂質分子がさらに分散するために暗条件下で室温で一晩保存されなければならない29。混合物は、4°Cで最大1週...

開示事項

著者は利益相反がないと宣言しています。

謝辞

我々は、ARO MURI W911NF-14-1-0403 to M.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)R01 1R01GM126256からM.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)U54 CA209992、NIH RO1 GM126256、NIH U54 CA209992、ミシガン大学/ジェネンテック、SUBK00016255及びヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラム(HFSP)の助成金番号RGY0073/2018からM.P.M.への資金提供を認める。この資料に記載されている意見、所見、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしもARO、NIH、またはHFSPの見解を反映するものではありません。S.C.は、V.ヤダヴ、C.ムレサン、S.アミリとの実りある議論を認める。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaneSigmaD27802-25GDABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAKL99-Dnon-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscleCytoskeleton, IncAR05fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 dyeThermoFisherfluorescent dye
Andor iQ3Andor Technologiescontrol and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine BrainCytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
Calcium chloride dihydrateSigma10035048CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)Quorum Technologiesincubation chamber
Cofilin protein: human recombinantCytoskeleton, IncCF01-Ccofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glucose
DithiothreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens RecombinantCytoskeleton, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tipCole-ParmerUX-07940-53glass syringe
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alpha-PhosphatidylcholineAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
Magnesium chlorideSigma7786303MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oilSigma8042475mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Potassium chlorideSigma7447407KCl
SucroseSigma57-50-1sucrose
β-Casein from bovine milkSigmaC6905-250MG

参考文献

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. . Methods in Cell Biology. 128, 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -. T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. . Reconstituting the Cytoskeleton. , (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. . Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved