Registros topográficos de EEG de potenciales evocados visuales en ratones utilizando electrodos de película delgada multicanal

Resumen

El presente protocolo describe un procedimiento sencillo para adquirir y analizar la topografía de potenciales evocados visuales epicraneales con 32 electrodos de película delgada multicanal en el ratón.

Resumen

Los potenciales evocados visuales (PEV) permiten la caracterización de la función visual en modelos preclínicos de ratón. Existen varios métodos para medir los PEV en ratones, desde el EEG no invasivo, los electrodos únicos subcutáneos y el ECoG hasta los registros de la corteza visual multicanal intracortical totalmente invasivos. Puede ser útil adquirir una caracterización global y topográfica a nivel de EEG de las respuestas visuales previas a las mediciones de microelectrodos intracorticales locales en entornos experimentales agudos. Por ejemplo, un caso de uso es evaluar los cambios intermodales globales en la topografía de VEP en modelos de sordera antes de estudiar sus efectos a nivel intracortical local. El EEG epicraneal multicanal es un método robusto para adquirir una medida general de la actividad visual cortical. El EEG epicraneal multicanal proporciona resultados comparables a través de un enfoque estandarizado y coherente para, por ejemplo, identificar cambios intermodales, patológicos o relacionados con la edad en la función visual cortical. El presente estudio presenta un método para obtener la distribución topográfica de VEPs evocadas por flash con una matriz de electrodos EEG de película delgada de 32 canales en ratones anestesiados. Combinado con el análisis en el dominio del tiempo y la frecuencia, este enfoque permite una rápida caracterización y cribado de la topografía y las propiedades visuales básicas de la función visual cortical del ratón, que puede combinarse con varios entornos experimentales agudos.

Introducción

Los ratones son un modelo preclínico de procesos degenerativos de la visión y enfermedades oftalmológicas 1,2,3,4. Los potenciales evocados visuales (PEV) se utilizan comúnmente para medir la función visual cortical y, por ejemplo, para evaluar la degeneración visual en modelos patológicos ^5,6. La latencia VEP, el tiempo de conducción, la amplitud, las características multifocales o la agudeza espacial de los potenciales evocados visuales corticales proporcionan información diagnóstica sobre la integridad funcional del sistema visual ^7,8,9.

En ratones, los potenciales evocados visuales corticales se pueden medir a través de varias escalas espaciales con métodos de diferente complejidad, desde EEG no invasivo, electrodos de aguja subdérmicos y tornillos implantados en el cráneo, hasta abordajes intracraneales completamente invasivos con ECoG epicortical, hasta registros de electrodos intracorticales 10,11,12,13,14,15,16,17 . Estos métodos tienen diferentes fortalezas y debilidades. Por ejemplo, un número bajo de electrodos solo proporciona información limitada sobre la distribución cortical de VEP, mientras que los electrodos de aguja subcutánea a menudo no garantizan ubicaciones de registro consistentes. Además, los tornillos implantados o los métodos totalmente invasivos requieren dañar, penetrar o extirpar el cráneo y, a menudo, solo proporcionan información local.

En los experimentos agudos, a menudo se desea una primera visión global de la función visual cortical, a la que finalmente siguen otros pasos experimentales y se comparan con los registros intracorticales locales. Por ejemplo, un caso de uso potencial se utiliza primero para investigar los efectos a nivel de EEG de la reorganización visual intermodal de la sordera o la pérdida auditiva en la topografía VEP y la actividad visual cortical^18,19 antes de estudiar los impactos a nivel intracortical local.

Los registros de EEG multicanal con matrices de electrodos múltiples de película delgada pueden proporcionar una topografía VEP sistematizada a partir del cráneo del ratón 20,21,22,23,24. Dichos registros epicraneales pueden tener ventajas sobre los registros ECoG, ya que dejan intacta la integridad del cráneo y evitan la manipulación directa de la superficie cortical. Además, los electrodos múltiples de película delgada proporcionan una configuración de electrodos estandarizada, lo que permite la comparación de la actividad cerebral espacio-temporal evocada visual entre experimentos similares a un sistema de EEG estandarizado en humanos²⁵. Un marco estandarizado también facilita el uso de herramientas comunes de análisis de EEG (por ejemplo, Fieldtrip, Chronux, EEGLAB y ERPLAB) para analizar el EEG del ratón en el dominio del tiempo y la frecuencia o en términos de conectividad 26,27,28,29,30,31.

El presente protocolo describe un procedimiento para el registro topográfico de VEP en ratones utilizando un electrodo de película delgada de 32 canales. Esto se puede utilizar como parte de experimentos agudos seguidos de pasos experimentales adicionales, como registros de microelectrodos intracorticales de áreas específicas del cerebro. Aquí se demuestra cómo registrar de forma fiable los VEP evocados por el flash epicraneal con electrodos de película fina de 32 canales desde el ratón. Además, se presenta un análisis ejemplar de los registros topográficos de VEP en el dominio del tiempo y la frecuencia.

Protocolo

Todos los animales fueron manejados y alojados de acuerdo con las normas alemanas (TierSchG, BGBl. I S. 1206, 1313) y de la Unión Europea (ETS 123; Directiva 2010/63/UE) para la investigación con animales. Los experimentos con animales fueron aprobados por las autoridades estatales alemanas (Oficina Estatal de Protección del Consumidor y Seguridad Alimentaria de Baja Sajonia, LAVES) y fueron supervisados por el responsable de bienestar animal de la universidad. Para el presente estudio se utilizó un ratón macho C57BL/6J de 3 meses de edad.

1. Detalles del animal

1. Realizar las medidas de VEP en ratones adecuadas para la pregunta de investigación en particular.
2. Tenga en cuenta las peculiaridades fisiológicas de la cepa de ratones que pueden afectar el experimento por la alteración de las sensibilidades anestésicas, la susceptibilidad a las convulsiones, la edad o los antecedentes genéticos.
   NOTA: Las cepas de ratones con diferentes antecedentes genéticos a menudo pueden desarrollar otras deficiencias sensoriales (por ejemplo, pérdida auditiva progresiva C57BL/6), que pueden pasar desapercibidas pero afectar indirectamente el procesamiento visual (por ejemplo, influencias intermodales¹⁹).

2. Inducción de la anestesia general

1. Prepare un campo quirúrgico en el sitio de registro. Determinar el peso prequirúrgico del ratón.
2. Inducir la anestesia con ketamina/xilacina, i.p., con una dosis de 100 mg/kg de clorhidrato de ketamina, 4 mg/kg de clorhidrato de xilacina y 5 mg/kg de carprofeno (ver Tabla de Materiales).
3. Inmediatamente después de la inyección, vuelva a colocar el ratón en la jaula.
4. Coloque una lámpara calefactora infrarroja (consulte la tabla de materiales) a una distancia adecuada y espere la inducción completa de la anestesia general durante al menos 5 minutos.
5. Observe la detención de los movimientos espontáneos y la pérdida del reflejo de enderezamiento. Compruebe si hay pérdida del reflejo de pellizco de los dedos del pie.

3. Monitorización fisiológica y mantenimiento de la anestesia general

1. Transfiera el mouse al sitio de grabación en una almohadilla térmica.
2. Utilice una sonda de temperatura rectal conectada a un sistema de control de temperatura para mantener la temperatura corporal central entre 37,6 y 37,8 °C.
3. Asegure la temperatura corporal óptima del mouse. Además de la almohadilla térmica, minimice la pérdida de calor aumentando la temperatura ambiente si es necesario.
4. Coloque dos electrodos subcutáneos de alambre de plata (0,2 mm de diámetro, ver Tabla de Materiales) cerca del hombro derecho y la pata trasera izquierda para el monitoreo del ECG.
5. Conecte los electrodos de ECG de alambre plateado al amplificador de ECG.
6. Controle la frecuencia cardíaca y las ondas de ECG en un osciloscopio (consulte la tabla de materiales) durante el experimento.
   NOTA: Durante una anestesia adecuada con ketamina/xilacina, la frecuencia cardíaca puede oscilar entre 160 y 250 lpm^32,33. La frecuencia cardíaca puede variar según la tensión del ratón, la edad y el estado fisiológico.
7. Revise el reflejo de pellizco de los dedos de los pies y los signos vitales. La ausencia de la respuesta refleja de pinzamiento del dedo del pie indica un nivel suficiente de anestesia.
8. Controle de cerca el estado y la calidad de los ojos durante el procedimiento y aplique gotas o gel oftálmicos.
9. Controle los niveles adecuados de anestesia mediante el control regular de los parámetros fisiológicos, la frecuencia cardíaca, los reflejos y la actividad del EEG.
10. Si el nivel de anestesia general es demasiado bajo, aplique una dosis adicional de ketamina/xilacina (i.p.).
11. Proceda rápidamente con los pasos experimentales para minimizar la duración de la anestesia general y el número de dosis subsiguientes de ketamina/xilacina adicionales utilizadas para mantener la anestesia general.

4. Colocación de electrodos y configuración de registro

1. En el lugar de la grabación, vuelva a evaluar la profundidad anestésica adecuada comprobando el reflejo de pellizco de los dedos de los pies.
2. Afeita la parte superior de la cabeza con una afeitadora eléctrica.
3. Para permitir un campo visual libre, no fije a los ratones en un marco estereotáctico durante el experimento.
4. Aplique lidocaína (si además lo requieren las pautas institucionales locales para el cuidado de los animales).
5. Realice una incisión de 1 cm en la línea media del cuero cabelludo.
6. Retraiga la piel hacia ambos lados usando pinzas de vasos pequeños para mantener la piel en su lugar y exponer el cráneo.
7. Limpiar la superficie del cráneo con un bastoncillo de algodón y solución salina NaCl (0,9%).
8. Coloque un electrodo de referencia de alambre de plata (diámetro de 0,2 mm) para el EEG por vía subcutánea por encima de la nariz (referencia de nariz) o detrás de la oreja (mastoides).
9. Conecte la referencia de nariz a través del conector de la sonda a la salida de referencia de la etapa principal (consulte la tabla de materiales).
10. A continuación, conecte el electrodo de EEG a la cabecera utilizando un adaptador conectado a la cabecera a través de un conector de sonda y conectado a un portaelectrodos (consulte la Tabla de materiales).
11. Coloque el electrodo de EEG multicanal de película delgada (consulte la Tabla de materiales) en el cráneo con bregma como posición de referencia para garantizar una posición de electrodo estandarizada para cada experimento.
12. Use una gota de solución salina para ajustar la posición del electrodo. Mientras la superficie del cráneo aún está húmeda, el electrodo se puede mover fácilmente. Luego, seca el cráneo cuidadosamente con un hisopo de algodón.
13. Espere hasta que la solución salina se seque y el electrodo se adhiera firmemente al cráneo.
14. Cubra el electrodo con una pequeña gota de aceite de silicona para evitar la adherencia del electrodo a la piel suprayacente. Este paso ayuda a quitar fácilmente el electrodo después de la grabación.
    NOTA: Tenga cuidado de no aplicar demasiado aceite de silicona para evitar deteriorar el contacto del electrodo con el cráneo.
15. Cierre la piel sobre el electrodo para protegerlo y minimizar el ruido eléctrico.
16. Aplique una pequeña gota de adhesivo tisular (consulte la tabla de materiales) sobre la piel para evitar que se vuelva a abrir la incisión cutánea.

5. Registro de EEG y medición de VEP

1. Filtre las señales de EEG durante la adquisición con un filtro amplio entre 1 y 9000 Hz. Utilice configuraciones de filtro amplio para el control de artefactos. Realice el ruido y el filtrado adecuado más adelante durante el procesamiento sin conexión.
2. Verifique la calidad de la señal de la actividad de EEG en curso verificando si hay ruido eléctrico de alta frecuencia, artefactos de 50/60 Hz y artefactos de ECG. Aplique conexiones de tierra y de referencia adecuadas al animal y al equipo o aplique un blindaje adecuado.
3. Verifique la profundidad de la anestesia observando la actividad del EEG. Trate de evitar un estado de anestesia "demasiado profundo" que se caracteriza por la aparición de actividad EEG de supresión de ráfagas. Tenga en cuenta el curso del tiempo del experimento y asegúrese de que la anestesia no sea demasiado ligera durante la grabación.
4. Utilice un estroboscopio LED (u otros tipos de estimulación visual) para producir destellos ultracortos (consulte la Tabla de materiales) (Figura 1).
5. Coloque el estroboscopio a una distancia de 30 cm para la estimulación visual binocular frente al ratón.
   NOTA: El ratón y el estroboscopio se colocan en una cámara oscura e insonorizada durante el experimento.
6. Adapte los ratones a la oscuridad durante 5 minutos antes de la estimulación.
7. El estroboscopio provoca destellos activando el estroboscopio con un pulso TTL.
   NOTA: Puede producirse un artefacto de estimulación debido al alto voltaje del estroboscopio. Esto se puede atenuar aumentando la distancia o blindando el electrodo.
8. Genere disparadores TTL de hardware con un dispositivo de E/S multifunción (consulte la tabla de materiales) controlado por una PC de estimulación para activar la fuente de luz (es decir, estroboscopio).
9. Envíe la señal TTL en paralelo al sistema de adquisición para proporcionar marcas de tiempo de alta precisión para el inicio del estímulo.
10. Envíe la salida TTL, que se sincroniza con el flash, desde el estroboscopio LED como retroalimentación y como segundo control para marcas de tiempo precisas de activación del inicio del estímulo. Regístrelo junto con las grabaciones.
11. Establezca la tasa de estímulo (por ejemplo, intervalo entre estímulos = 2 s). Establezca el número de repeticiones de estímulos (por ejemplo, n = 150 repeticiones)
12. Ajuste las intensidades manualmente en el estroboscopio (por ejemplo, una duración del flash de 512 μs a un valor fijo de 3000 lm).
    NOTA: Esto, sin embargo, tiene que adaptarse a la pregunta experimental específica.
13. Inicie la presentación del estímulo, registre las señales de EEG con un software de grabación (consulte la Tabla de materiales) y guarde los datos en la PC de grabación.

6. Finalización del experimento, extracción de electrodos y limpieza de electrodos

1. Si la grabación es parte de un protocolo más largo, continúe con otros pasos experimentales.
2. Al final del experimento, eutanasiar al animal de acuerdo con las directrices institucionales^23,34.
3. Retire el electrodo de EEG con cuidado (ya que se pueden reutilizar).
4. Lentamente, con la aplicación de líquido, retire el electrodo del cráneo.
   NOTA: Los electrodos pueden adherirse a la superficie del cráneo; Evite dañar los sitios de platino durante la extracción.
5. Limpiar el electrodo después del experimento con solución salina isotónica NaCl (0,9%) y sumergirlo en una solución eliminaproteínas y desinfectante (ver Tabla de Materiales) durante 30 min.
6. Guarde la guía de electrodos en un lugar seco y protegido.

7. Procesamiento básico de señales VEP: dominio del tiempo y la frecuencia

1. Importe los archivos de datos brutos en el software de análisis (véase Tabla de materiales).
2. Filtre las señales de EEG con un filtro de fase cero de paso de banda Butterworth entre 1 y 100 Hz.
   NOTA: Seleccione los tipos de filtros y parámetros adecuados en función de la pregunta de investigación respectiva 27,35,36.
3. Reduzca la resolución de las señales a 1000 Hz.
4. Segmente las señales de EEG en ensayos y promedie los ensayos para obtener potenciales evocados visuales y determinar la latencia máxima N1.
   NOTA: La rereferenciación se puede realizar fuera de línea si es necesario (por ejemplo, referencia promedio común, referencia bipolar, referencia "laplaciana" promedio local)²³.
5. Determine los valores de voltaje en puntos de tiempo específicos de interés y trace mapas de distribución de voltaje utilizando el software de análisis.
6. Calcule la potencia de campo global³⁷ calculando la desviación estándar espacial de todos los canales de electrodos.
7. Calcule un espectrograma de tiempo-frecuencia multicono con Chronux Toolbox^28,31. Utilice un producto de ancho de banda TW = 3 y K = 5 conos con un tamaño de ventana de 300 ms y un tamaño de paso de 30 ms.

Resultados

El registro de potenciales evocados visuales con EEG multicanal permite la evaluación de la topografía de las amplitudes, latencias o componentes de frecuencia de VEP en ratones. La Figura 2A muestra un ejemplo de una topografía VEP evocada por flash registrada con un EEG epicraneal de 32 canales de un ratón macho C57BL/6J de 3 meses de edad. La actividad evocada visual más fuerte ocurre en la región occipital por encima de la corteza visual.

Discusión

Este artículo describe un método para registrar el EEG epicraneal multicanal con electrodos de película delgada y cómo adquirir una representación topográfica consistente de los potenciales evocados visuales en el ratón. Aquí, mostramos de manera ejemplar la estimulación con flash binocular, pero este enfoque también se puede aplicar con otros tipos de estímulos visuales (es decir, monoculares, rejillas espaciales, campo visual focal) utilizando, por ejemplo, una pantalla más...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bepanthen 5% Dexpantheol	Bayer		Ophtamic gel
Cheetah software 5.11	Neuralnyx	Version 5.11	Recording software for neurophysiologcal signals
Digital Lynx SX	Neuralynx	Digital Lynx 16SX	Recording system
ECG differential amplifier	Otoconsult	WDA2 V1.0
Electric shaver	Aesculap	GT420
Electrode Holder	TSE Systems	430005-HE
Examination light	Heine	HL 5000	Cold light source lamp
Heating Pad + Temperature Control system	CWE	TC-1000 Mouse
Histoacryl 0.5 mL	B.Braun		Tissue adhesive
Infrared heat lamp	Sanitas	SIL 06
Ketamine 10%	WDT		Ketaminhydrochlorid
LED stroboscope	Monarch	Nova Strobe PBL	Visual stimulation
Matlab 2021a	The Mathworks	2021a	Stimulus control and analysis
Moria Vessel Clamp	Fine Science Tools	18320-11
Mouse EEG electrode	NeuroNexus	H32 (Reticular)	32-channel EEG electrode. Thickness: 20 μm; length: 8.6 mm; width 6.8 mm. Platinum sites: 500 μm diameter
Mouse Frame	custom made		Information available on request
Multifunction I/O device	National Instruments	PCIe-6353 with BNC 2090A	Analog stimulus generation, output, and trigger
NaCl 0.9%	B.Braun		Isotonic, sterile, nonpyrogenic
Neuralynx HS36	Neuralynx	HS-36	Headstage
Neuronexus probe connector	Neuralynx	ADPT-HS36-N2T-32A	Electrode connector
Oscilloscope	Tektronix	TDS 2014B
Progent Intensive Cleaner	Menicon		Protein remover and disinfecting solution for rigid gas permeable lenses
Recording PC	HP	HP Z800	Recording PC
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis		Carprofen
Silicon Oil M 1000	Carl Roth	4045.1
Silver wire	Science Products	AG-8W	Diameter 203 µm; ECG and reference electrode
Sound proof chamber	IAC acoustics
Stereotactic Micromanipulator	TSE Systems	430005-M/P	For EEG electrode placement
Stimulation PC	Dell	Dell Precision T5810	Stimulation PC
Surgical microscope	Zeiss	Op-Mi Focus
Surgical tape	3M	1527-0	1.25 cm x 9.1 m
Thilo-Tears 3 mg/g	Alcon Pharma GmbH		Ophtamic gel
Vaselin Lichtenstein	Winthrop		White vaselin ointment
Xylazin 2%	Bernburg		Xylazinehydrochlorid
Xylocaine Spray (10 mg/puff)	Aspen		Lidocaine