Registrazioni EEG topografiche dei potenziali evocati visivi nei topi utilizzando elettrodi a film sottile multicanale

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una semplice procedura per acquisire e analizzare la topografia dei potenziali evocati visivi epicraniali con 32 elettrodi a film sottile multicanale nel topo.

Abstract

I potenziali evocati visivi (VEP) consentono la caratterizzazione della funzione visiva in modelli murini preclinici. Esistono vari metodi per misurare i VEP nei topi, dall'EEG non invasivo, agli elettrodi singoli sottocutanei e all'ECoG alle registrazioni intracorticali multicanale della corteccia visiva completamente invasive. Può essere utile acquisire una caratterizzazione globale a livello di EEG topografico delle risposte visive prima delle misurazioni locali dei microelettrodi intracorticali in contesti sperimentali acuti. Ad esempio, un caso d'uso consiste nel valutare i cambiamenti intermodali globali nella topografia VEP nei modelli di sordità prima di studiarne gli effetti a livello intracorticale locale. L'EEG epicranico multicanale è un metodo robusto per acquisire una tale misura panoramica dell'attività visiva corticale. L'EEG epicranico multicanale fornisce risultati comparabili attraverso un approccio standardizzato e coerente, ad esempio, per identificare i cambiamenti crossmodali, patologici o legati all'età nella funzione visiva corticale. Il presente studio presenta un metodo per ottenere la distribuzione topografica di VEP evocati da flash con un array di elettrodi EEG a film sottile a 32 canali in topi anestetizzati. Combinato con l'analisi nel dominio del tempo e della frequenza, questo approccio consente una rapida caratterizzazione e screening della topografia e delle proprietà visive di base della funzione visiva corticale del topo, che può essere combinata con vari contesti sperimentali acuti.

Introduzione

I topi sono un modello preclinico dei processi degenerativi della vista e delle malattie oftalmologiche 1,2,3,4. I potenziali evocati visivi (PEP) sono comunemente usati per misurare la funzione visiva corticale e, ad esempio, per valutare la degenerazione visiva in modelli patologici ^5,6. La latenza VEP, il tempo di conduzione, l'ampiezza, le caratteristiche multifocali o l'acuità spaziale dei potenziali evocati visivi corticali forniscono informazioni diagnostiche sull'integrità funzionale del sistema visivo ^7,8,9.

Nei topi, i potenziali evocati visivi corticali possono essere misurati su varie scale spaziali con metodi di diversa complessità, dall'EEG non invasivo, agli elettrodi ad ago sottodermici e alle viti impiantate nel cranio, agli approcci intracranici completamente invasivi con ECoG epicorticale, alle registrazioni di elettrodi intracorticali 10,11,12,13,14,15,16,17 . Questi metodi hanno diversi punti di forza e di debolezza. Ad esempio, un numero ridotto di elettrodi fornisce solo informazioni limitate sulla distribuzione corticale della VEP, mentre gli elettrodi ad ago sottocutanei spesso non riescono a garantire posizioni di registrazione coerenti. Inoltre, le viti impiantate o i metodi completamente invasivi richiedono il danneggiamento, la penetrazione o la rimozione del cranio e spesso forniscono solo informazioni locali.

Negli esperimenti acuti, è spesso auspicabile una prima panoramica globale della funzione visiva corticale, che viene eventualmente seguita da ulteriori passaggi sperimentali e confrontata con le registrazioni intracorticali locali. Ad esempio, un potenziale caso d'uso viene utilizzato in primo luogo per studiare gli effetti a livello EEG della riorganizzazione visiva crossmodale della sordità o della perdita dell'udito sulla topografia VEP e sull'attività visiva corticale^18,19 prima di studiare gli impatti a livello intracorticale locale.

Le registrazioni EEG multicanale con array multi-elettrodi a film sottile possono fornire una topografia VEP sistematizzata dal cranio di topo 20,21,22,23,24. Tali registrazioni epicraniche possono avere vantaggi rispetto alle registrazioni ECoG lasciando intatta l'integrità del cranio ed evitando la manipolazione diretta della superficie corticale. Inoltre, i multi-elettrodi a film sottile forniscono una configurazione standardizzata degli elettrodi, consentendo il confronto dell'attività cerebrale spazio-temporale evocata visiva tra esperimenti simili a un sistema EEG standardizzato nell'uomo²⁵. Un framework standardizzato facilita anche l'utilizzo di strumenti comuni per l'analisi EEG (ad esempio, Fieldtrip, Chronux, EEGLAB ed ERPLAB) per analizzare l'EEG del topo nel dominio del tempo e della frequenza o in termini di connettività 26,27,28,29,30,31.

Il presente protocollo descrive una procedura per registrazioni topografiche di VEP nei topi utilizzando un elettrodo a film sottile a 32 canali. Questo può essere utilizzato come parte di esperimenti acuti seguiti da ulteriori passaggi sperimentali, come la registrazione di microelettrodi intracorticali da specifiche aree cerebrali. Qui viene dimostrato come registrare in modo affidabile i VEP evocati dal flash epicranico con elettrodi a film sottile a 32 canali dal topo. Inoltre, viene presentata un'analisi esemplare delle registrazioni topografiche VEP nel dominio del tempo e della frequenza.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati gestiti e alloggiati secondo le norme tedesche (TierSchG, BGBl. I S. 1206, 1313) e dell'Unione Europea (ETS 123; direttiva 2010/63/UE) per la ricerca sugli animali. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle autorità statali tedesche (Ufficio statale della Bassa Sassonia per la protezione dei consumatori e la sicurezza alimentare, LAVES) e sono stati monitorati dall'ufficiale universitario per il benessere degli animali. Per il presente studio è stato utilizzato un topo maschio C57BL/6J di 3 mesi.

1. Dettagli dell'animale

1. Eseguire le misure VEP nei topi adeguate alla particolare domanda di ricerca.
2. Essere consapevoli delle peculiarità del ceppo di topo nella fisiologia che possono influenzare l'esperimento da sensibilità anestesiologiche alterate, suscettibilità alle convulsioni, età o background genetico.
   NOTA: I ceppi di topi con background genetici diversi possono spesso sviluppare altre menomazioni sensoriali (ad esempio, perdita progressiva dell'udito C57BL/6), che potrebbero passare inosservate ma influenzare indirettamente l'elaborazione visiva (ad esempio, influenze cross-modali¹⁹).

2. Induzione dell'anestesia generale

1. Preparare un campo chirurgico nel sito di registrazione. Determinare il peso pre-chirurgico del topo.
2. Indurre l'anestesia con ketamina/xilazina, i.p., con un dosaggio di 100 mg/kg di ketamina cloridrato, 4 mg/kg di xilazincloridrato e 5 mg/kg di carprofene (vedi Tabella dei materiali).
3. Immediatamente dopo l'iniezione, rimetti il topo nella gabbia.
4. Posizionare una lampada riscaldante a infrarossi (vedi Tabella dei materiali) a una distanza adeguata e attendere l'induzione completa dell'anestesia generale per almeno 5 minuti.
5. Osservare l'arresto dei movimenti spontanei e la perdita del riflesso raddrizzante. Verificare la perdita del riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi.

3. Monitoraggio fisiologico e mantenimento dell'anestesia generale

1. Trasferisci il mouse sul sito di registrazione su un termoforo.
2. Utilizzare una sonda di temperatura rettale collegata a un sistema di controllo della temperatura per mantenere la temperatura corporea interna a 37,6-37,8 °C.
3. Garantire una temperatura corporea ottimale del mouse. Oltre al termoforo, ridurre al minimo la perdita di calore aumentando la temperatura ambiente, se necessario.
4. Posizionare due elettrodi sottocutanei a filo d'argento (diametro 0,2 mm, vedere la Tabella dei materiali) vicino alla spalla destra e alla zampa posteriore sinistra per il monitoraggio ECG.
5. Collegare gli elettrodi ECG a filo d'argento all'amplificatore ECG.
6. Monitorare la frequenza cardiaca e le onde ECG su un oscilloscopio (vedi Tabella dei materiali) durante l'esperimento.
   NOTA: Durante un'adeguata anestesia con ketamina/xilazina, la frequenza cardiaca può variare tra 160-250 bpm^32,33. La frequenza cardiaca può variare a seconda del ceppo del topo, dell'età e dello stato fisiologico.
7. Controlla il riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi e i segni vitali. L'assenza della risposta riflessa del pizzicamento delle dita dei piedi indica un livello sufficiente di anestesia.
8. Monitora attentamente lo stato e la qualità degli occhi durante la procedura e applica gocce oftalmiche o gel.
9. Monitorare i livelli di anestesia adeguati controllando regolarmente i parametri fisiologici, la frequenza cardiaca, i riflessi e l'attività EEG.
10. Se il livello di anestesia generale diventa troppo basso, applicare una dose aggiuntiva di ketamina/xilazina (i.p.).
11. Procedere rapidamente con le fasi sperimentali per ridurre al minimo la durata dell'anestesia generale e il numero di dosi successive di ketamina/xilazina aggiuntiva utilizzate per mantenere l'anestesia generale.

4. Posizionamento degli elettrodi e configurazione della registrazione

1. Nel sito di registrazione, rivalutare l'adeguata profondità dell'anestesia controllando il riflesso di pizzicamento delle dita.
2. Radere la parte superiore della testina con un rasoio elettrico.
3. Per consentire un campo visivo libero, non fissare i topi in una cornice stereotassica durante l'esperimento.
4. Applicare la lidocaina (se richiesto dalle linee guida istituzionali locali per la cura degli animali).
5. Praticare un'incisione di 1 cm sulla linea mediana del cuoio capelluto.
6. Ritrarre la pelle su entrambi i lati utilizzando piccoli morsetti per vasi per tenere la pelle in posizione ed esporre il cranio.
7. Pulire la superficie del cranio con un batuffolo di cotone e soluzione salina NaCl (0,9%).
8. Collegare un elettrodo di riferimento a filo d'argento (diametro 0,2 mm) per l'EEG per via sottocutanea sopra il naso (riferimento nasale) o dietro l'orecchio (mastoide).
9. Collegare il riferimento del naso tramite il connettore della sonda all'uscita di riferimento dell'headstage (vedere Tabella dei materiali).
10. Quindi, collegare l'elettrodo EEG all'headstage utilizzando un adattatore collegato all'headstage tramite un connettore per sonda e collegato a un portaelettrodo (vedere la tabella dei materiali).
11. Posizionare l'elettrodo EEG multicanale a film sottile (vedi Tabella dei materiali) sul cranio con bregma come posizione di riferimento per garantire una posizione standardizzata dell'elettrodo per ogni esperimento.
12. Utilizzare una goccia di soluzione fisiologica per regolare la posizione dell'elettrodo. Mentre la superficie del cranio è ancora bagnata, l'elettrodo è facilmente spostabile. Quindi, asciugare accuratamente il cranio con un batuffolo di cotone.
13. Attendere che la soluzione salina si asciughi e che l'elettrodo si attacchi saldamente al cranio.
14. Coprire l'elettrodo con una piccola goccia di olio siliconico per evitare l'adesione dell'elettrodo alla pelle sovrastante. Questo passaggio aiuta a rimuovere facilmente l'elettrodo dopo la registrazione.
    NOTA: Fare attenzione a non applicare troppo olio siliconico per evitare di deteriorare il contatto dell'elettrodo con il cranio.
15. Chiudere la pelle sopra l'elettrodo per proteggerlo e ridurre al minimo il rumore elettrico.
16. Applicare una piccola goccia di adesivo per tessuti (vedere la Tabella dei materiali) sulla pelle per evitare la riapertura dell'incisione cutanea.

5. Registrazione EEG e misurazione VEP

1. Filtra i segnali EEG durante l'acquisizione con un filtro ampio tra 1-9000 Hz. Utilizza le impostazioni del filtro ampio per il controllo degli artefatti. Eseguire il rumore e il filtraggio adeguato in un secondo momento durante l'elaborazione offline.
2. Controllare la qualità del segnale dell'attività EEG in corso verificando la presenza di rumore elettrico ad alta frequenza, artefatti a 50/60 Hz e artefatti ECG. Applicare adeguati collegamenti di terra e di riferimento all'animale e all'attrezzatura o applicare un'adeguata schermatura.
3. Controllare la profondità dell'anestesia osservando l'attività EEG. Cerca di evitare uno stato di anestesia "troppo profondo" che è caratterizzato dal verificarsi di attività EEG di soppressione dello scoppio. Considerare il decorso temporale dell'esperimento e assicurarsi che l'anestesia non diventi troppo leggera durante la registrazione.
4. Utilizzare uno stroboscopio a LED (o altri tipi di stimolazione visiva) per produrre lampi ultra-brevi (vedi Tabella dei materiali) (Figura 1).
5. Posizionare lo stroboscopio a una distanza di 30 cm per la stimolazione visiva binoculare davanti al mouse.
   NOTA: Il mouse e lo stroboscopio vengono collocati in una camera buia e insonorizzata durante l'esperimento.
6. Adattare i topi al buio per 5 minuti prima della stimolazione.
7. Lo stroboscopio elicita lampeggia attivando lo stroboscopio con un impulso TTL.
   NOTA: Può verificarsi un artefatto di stimolazione a causa dell'alta tensione dello stroboscopio. Questo può essere attenuato aumentando la distanza o schermando l'elettrodo.
8. Genera trigger TTL hardware con un dispositivo I/O multifunzione (vedi Tabella dei materiali) controllato da un PC di stimolazione per attivare la sorgente luminosa (ad esempio, lo stroboscopio).
9. Invio del segnale TTL in parallelo al sistema di acquisizione per fornire timestamp ad alta precisione per l'insorgenza dello stimolo.
10. Invia l'uscita TTL, che è sincronizzata con il flash, dallo stroboscopio a LED come feedback e come secondo controllo per timestamp accurati dell'innesco dell'insorgenza dello stimolo. Registralo insieme alle registrazioni.
11. Impostare la velocità di stimolo (ad esempio, intervallo interstimolo = 2 s). Imposta il numero di ripetizioni dello stimolo (ad esempio, n = 150 ripetizioni)
12. Regolare manualmente le intensità sullo stroboscopio (ad es. durata del flash di 512 μs con un valore fisso di 3000 lm).
    NOTA: Questo, tuttavia, deve essere adattato alla specifica domanda sperimentale.
13. Avviare la presentazione dello stimolo, registrare i segnali EEG con il software di registrazione (vedere Tabella dei materiali) e salvare i dati sul PC di registrazione.

6. Completamento dell'esperimento, rimozione dell'elettrodo e pulizia dell'elettrodo

1. Se la registrazione fa parte di un protocollo più lungo, continuare con ulteriori passaggi sperimentali.
2. Al termine dell'esperimento, sopprimere l'animale secondo le linee guida istituzionali^23,34.
3. Rimuovere gli elettrodi EEG con cura (poiché possono essere riutilizzati).
4. Lentamente, con l'applicazione del fluido, rimuovere l'elettrodo dal cranio.
   NOTA: Gli elettrodi possono aderire alla superficie del cranio; Evitare danni ai siti di platino durante la rimozione.
5. Pulire l'elettrodo dopo l'esperimento con soluzione salina isotonica NaCl (0,9%) e immergerlo in una soluzione disinfettante e disidratante per proteine (vedere la Tabella dei materiali) per 30 minuti.
6. Conservare l'array di elettrodi in un luogo asciutto e protetto.

7. Elaborazione del segnale VEP di base: dominio del tempo e della frequenza

1. Importare i file di dati grezzi nel software di analisi (vedere la tabella dei materiali).
2. Filtra i segnali EEG con un filtro a fase zero passa-banda Butterworth tra 1 e 100 Hz.
   NOTA: Selezionare i tipi di filtro e i parametri adeguati in base alla rispettiva domanda di ricerca 27,35,36.
3. Downsampling dei segnali a 1000 Hz.
4. Segmentare i segnali EEG in prove e fare la media delle prove per ottenere potenziali evocati visivi e determinare la latenza di picco di N1.
   NOTA: Se necessario, è possibile eseguire la rireferenziazione offline (ad esempio, riferimento alla media comune, riferimento bipolare, riferimento "laplaciano" alla media locale)²³.
5. Determinare i valori di tensione in specifici punti di interesse e tracciare le mappe di distribuzione della tensione utilizzando il software di analisi.
6. Calcola la potenza di campo globale³⁷ calcolando la deviazione standard spaziale di tutti i canali degli elettrodi.
7. Calcola uno spettrogramma tempo-frequenza multi-taper con Chronux Toolbox^28,31. Utilizzare un prodotto di larghezza di banda TW = 3 e K = 5 conicità con una dimensione della finestra di 300 ms e una dimensione del passo di 30 ms.

Risultati

La registrazione dei potenziali evocati visivi con l'EEG multicanale consente la valutazione della topografia delle ampiezze, delle latenze o delle componenti di frequenza VEP nei topi. La Figura 2A mostra un esempio di una topografia VEP evocata da flash registrata con un EEG epicraniale a 32 canali da un topo maschio C57BL/6J di 3 mesi. La più forte attività evocata visiva si verifica nella regione occipitale sopra la corteccia visiva.

Discussione

Questo articolo descrive un metodo per la registrazione dell'EEG multicanale epicranico con elettrodi a film sottile e come acquisire una rappresentazione topografica coerente dei potenziali evocati visivi nel topo. Qui, abbiamo mostrato in modo esemplare la stimolazione binoculare del flash, ma questo approccio può essere applicato anche con altri tipi di stimoli visivi (ad esempio, monoculare, reticoli spaziali, campo visivo focale) utilizzando, ad esempio, un display più grande.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bepanthen 5% Dexpantheol	Bayer		Ophtamic gel
Cheetah software 5.11	Neuralnyx	Version 5.11	Recording software for neurophysiologcal signals
Digital Lynx SX	Neuralynx	Digital Lynx 16SX	Recording system
ECG differential amplifier	Otoconsult	WDA2 V1.0
Electric shaver	Aesculap	GT420
Electrode Holder	TSE Systems	430005-HE
Examination light	Heine	HL 5000	Cold light source lamp
Heating Pad + Temperature Control system	CWE	TC-1000 Mouse
Histoacryl 0.5 mL	B.Braun		Tissue adhesive
Infrared heat lamp	Sanitas	SIL 06
Ketamine 10%	WDT		Ketaminhydrochlorid
LED stroboscope	Monarch	Nova Strobe PBL	Visual stimulation
Matlab 2021a	The Mathworks	2021a	Stimulus control and analysis
Moria Vessel Clamp	Fine Science Tools	18320-11
Mouse EEG electrode	NeuroNexus	H32 (Reticular)	32-channel EEG electrode. Thickness: 20 μm; length: 8.6 mm; width 6.8 mm. Platinum sites: 500 μm diameter
Mouse Frame	custom made		Information available on request
Multifunction I/O device	National Instruments	PCIe-6353 with BNC 2090A	Analog stimulus generation, output, and trigger
NaCl 0.9%	B.Braun		Isotonic, sterile, nonpyrogenic
Neuralynx HS36	Neuralynx	HS-36	Headstage
Neuronexus probe connector	Neuralynx	ADPT-HS36-N2T-32A	Electrode connector
Oscilloscope	Tektronix	TDS 2014B
Progent Intensive Cleaner	Menicon		Protein remover and disinfecting solution for rigid gas permeable lenses
Recording PC	HP	HP Z800	Recording PC
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis		Carprofen
Silicon Oil M 1000	Carl Roth	4045.1
Silver wire	Science Products	AG-8W	Diameter 203 µm; ECG and reference electrode
Sound proof chamber	IAC acoustics
Stereotactic Micromanipulator	TSE Systems	430005-M/P	For EEG electrode placement
Stimulation PC	Dell	Dell Precision T5810	Stimulation PC
Surgical microscope	Zeiss	Op-Mi Focus
Surgical tape	3M	1527-0	1.25 cm x 9.1 m
Thilo-Tears 3 mg/g	Alcon Pharma GmbH		Ophtamic gel
Vaselin Lichtenstein	Winthrop		White vaselin ointment
Xylazin 2%	Bernburg		Xylazinehydrochlorid
Xylocaine Spray (10 mg/puff)	Aspen		Lidocaine