Registros topográficos de EEG de potenciais evocados visuais em camundongos usando eletrodos de filme fino multicanal

Resumo

O presente protocolo descreve um procedimento simples para adquirir e analisar a topografia dos potenciais evocados visuais epicranianos com eletrodos de filme fino de 32 multicanais no camundongo.

Resumo

Os potenciais evocados visuais (VEP) permitem a caracterização da função visual em modelos pré-clínicos de camundongos. Existem vários métodos para medir VEPs em camundongos, desde EEG não invasivo, eletrodos únicos subcutâneos e ECoG até gravações multicanal multicanal intracortical totalmente invasivas do córtex visual. Pode ser útil adquirir uma caracterização global e topográfica em nível de EEG das respostas visuais antes das medições locais de microeletrodos intracorticais em ambientes experimentais agudos. Por exemplo, um caso de uso é avaliar mudanças intermodais globais na topografia VEP em modelos de surdez antes de estudar seus efeitos em um nível intracortical local. O EEG epicraniano multicanal é um método robusto para adquirir uma medida geral da atividade visual cortical. O EEG epicraniano multicanal fornece resultados comparáveis por meio de uma abordagem padronizada e consistente para, por exemplo, identificar alterações multimodais, patológicas ou relacionadas à idade na função visual cortical. O presente estudo apresenta um método para obter a distribuição topográfica de VEPs evocados por flash com um feixe de eletrodos de EEG de filme fino de 32 canais em camundongos anestesiados. Combinada com a análise no domínio do tempo e da frequência, essa abordagem permite a rápida caracterização e triagem da topografia e das propriedades visuais básicas da função visual cortical do camundongo, que podem ser combinadas com várias configurações experimentais agudas.

Introdução

Os camundongos são um modelo pré-clínico de processos degenerativos da visão e doenças oftalmológicas 1,2,3,4. Os potenciais evocados visuais (VEPs) são comumente usados para medir a função visual cortical e, por exemplo, para avaliar a degeneração visual em modelos patológicos ^5,6. A latência do VEP, o tempo de condução, a amplitude, as características multifocais ou a acuidade espacial dos potenciais evocados visuais corticais fornecem informações diagnósticas sobre a integridade funcional do sistema visual ^7,8,9.

Em camundongos, os potenciais evocados visuais corticais podem ser medidos em várias escalas espaciais com métodos de diferentes complexidades, desde EEG não invasivo, eletrodos de agulha subdérmica e parafusos implantados no crânio, até abordagens intracranianas totalmente invasivas com ECoG epicortical, até registros de eletrodos intracorticais 10,11,12,13,14,15,16,17 . Esses métodos têm diferentes pontos fortes e fracos. Por exemplo, um baixo número de eletrodos fornece apenas informações limitadas sobre a distribuição cortical do VEP, enquanto os eletrodos de agulha subcutâneos geralmente não garantem locais de registro consistentes. Além disso, parafusos implantados ou métodos totalmente invasivos requerem danos, penetração ou remoção do crânio e geralmente fornecem apenas informações locais.

Em experimentos agudos, uma primeira visão geral global da função visual cortical é frequentemente desejada, que é eventualmente seguida por outras etapas experimentais e comparada a registros intracorticais locais. Por exemplo, um caso de uso potencial é utilizado primeiro para investigar os efeitos no nível do EEG da reorganização visual intermodal da surdez ou perda auditiva na topografia do VEP e na atividade visual cortical^18,19 antes de estudar os impactos em um nível intracortical local.

Gravações de EEG multicanal com matrizes de múltiplos eletrodos de filme fino podem fornecer uma topografia VEP sistematizada do crânio do camundongo 20,21,22,23,24. Tais registros epicranianos podem ter vantagens sobre os registros ECoG, deixando a integridade do crânio intacta e evitando a manipulação direta da superfície cortical. Além disso, os multieletrodos de filme fino fornecem uma configuração padronizada de eletrodos, permitindo a comparação da atividade cerebral espaço-temporal evocada visual entre experimentos semelhantes a um sistema de EEG padronizado em humanos²⁵. Uma estrutura padronizada também facilita o uso de caixas de ferramentas comuns de análise de EEG (por exemplo, Fieldtrip, Chronux, EEGLAB e ERPLAB) para analisar o EEG de camundongos no domínio do tempo e da frequência ou em termos de conectividade 26,27,28,29,30,31.

O presente protocolo descreve um procedimento para registros topográficos de VEP em camundongos usando um eletrodo de filme fino de 32 canais. Isso pode ser usado como parte de experimentos agudos seguidos por etapas experimentais adicionais, como gravações de microeletrodos intracorticais de áreas cerebrais específicas. É demonstrado aqui como registrar de forma confiável VEPs evocados por flash epicraniano com eletrodos de filme fino de 32 canais do camundongo. Além disso, é apresentada uma análise exemplar dos registros topográficos do VEP no domínio do tempo e da frequência.

Protocolo

Todos os animais foram manuseados e alojados de acordo com as normas alemã (TierSchG, BGBl. I S. 1206, 1313) e da União Europeia (ETS 123; Diretiva 2010/63/UE) para a investigação em animais. Os experimentos com animais foram aprovados pelas autoridades estatais alemãs (Escritório Estadual de Proteção ao Consumidor e Segurança Alimentar da Baixa Saxônia, LAVES) e foram monitorados pelo oficial de bem-estar animal da universidade. Um camundongo C57BL/6J macho de 3 meses de idade foi usado para o presente estudo.

1. Detalhes do animal

1. Realize as medidas de VEP em camundongos adequadas para a questão de pesquisa específica.
2. Esteja ciente das peculiaridades da cepa de camundongo na fisiologia que podem afetar o experimento por sensibilidades anestésicas alteradas, suscetibilidade a convulsões, idade ou antecedentes genéticos.
   NOTA: Cepas de camundongos com diferentes origens genéticas podem frequentemente desenvolver outras deficiências sensoriais (por exemplo, perda auditiva progressiva C57BL / 6), que podem passar despercebidas, mas afetam indiretamente o processamento visual (por exemplo, influências intermodais¹⁹).

2. Indução de anestesia geral

1. Prepare um campo cirúrgico no local de gravação. Determine o peso pré-cirúrgico do mouse.
2. Induza a anestesia com cetamina / xilazina, ip, com uma dosagem de 100 mg / kg de cloridrato de cetamina, 4 mg / kg de cloridrato de xilazina e 5 mg / kg de carprofeno (ver Tabela de Materiais).
3. Imediatamente após a injeção, coloque o mouse de volta na gaiola.
4. Coloque uma lâmpada de aquecimento infravermelho (consulte a Tabela de Materiais) a uma distância adequada e aguarde a indução completa da anestesia geral por pelo menos 5 min.
5. Observe a parada dos movimentos espontâneos e a perda do reflexo de endireitamento. Verifique se há perda do reflexo de pinça do dedo do pé.

3. Monitoramento fisiológico e manutenção da anestesia geral

1. Transfira o mouse para o local de gravação em uma almofada de aquecimento.
2. Use uma sonda de temperatura retal conectada a um sistema de controle de temperatura para manter a temperatura corporal central em 37.6-37.8 °C.
3. Garanta a temperatura corporal ideal do mouse. Além da almofada de aquecimento, minimize a perda de calor aumentando a temperatura ambiente, se necessário.
4. Coloque dois eletrodos subcutâneos de fio de prata (0.2 mm de diâmetro, consulte a Tabela de Materiais) perto do ombro direito e da perna traseira esquerda para monitoramento de ECG.
5. Conecte os eletrodos de ECG de fio prateado ao amplificador de ECG.
6. Monitore a frequência cardíaca e as ondas de ECG em um osciloscópio (consulte a Tabela de Materiais) durante o experimento.
   NOTA: Durante a anestesia adequada com cetamina/xilazina, a frequência cardíaca pode variar entre 160-250 bpm ^32,33. A frequência cardíaca pode variar dependendo da cepa, idade e estado fisiológico do camundongo.
7. Verifique o reflexo de beliscar os dedos dos pés e os sinais vitais. A ausência da resposta reflexa de pinça do dedo do pé indica um nível suficiente de anestesia.
8. Monitore de perto o estado e a qualidade dos olhos durante o procedimento e aplique gotas ou gel oftálmico.
9. Monitore os níveis adequados de anestesia verificando regularmente os parâmetros fisiológicos, frequência cardíaca, reflexos e atividade do EEG.
10. Se o nível de anestesia geral ficar muito leve, aplique uma dose adicional de cetamina/xilazina (i.p.).
11. Prossiga rapidamente com as etapas experimentais para minimizar a duração da anestesia geral e o número de doses subsequentes de cetamina / xilazina adicionais usadas para manter a anestesia geral.

4. Colocação do eletrodo e configuração de gravação

1. No local de registro, reavalie a profundidade anestésica adequada verificando o reflexo de pinça do dedo do pé.
2. Raspe o topo da cabeça com um barbeador elétrico.
3. Para permitir um campo visual livre, não fixe os camundongos em um quadro estereotáxico durante o experimento.
4. Aplique lidocaína (se exigido adicionalmente pelas diretrizes institucionais locais para cuidados com animais).
5. Faça uma incisão na linha média de 1 cm do couro cabeludo.
6. Retraia a pele para ambos os lados usando grampos de pequenos vasos para manter a pele no lugar e expor o crânio.
7. Limpe a superfície do crânio com um cotonete e solução salina NaCl (0,9%).
8. Conecte um eletrodo de referência de fio de prata (diâmetro de 0,2 mm) para o EEG por via subcutânea acima do nariz (referência do nariz) ou atrás da orelha (mastóide).
9. Conecte a referência do nariz através do conector da sonda à saída de referência do headstage (consulte Tabela de materiais).
10. Em seguida, conecte o eletrodo de EEG ao headstage usando um adaptador conectado ao headstage por meio de um conector de sonda e conectado a um suporte de eletrodo (consulte a Tabela de Materiais).
11. Coloque o eletrodo de EEG de filme fino multicanal (consulte a Tabela de Materiais) no crânio com bregma como posição de referência para garantir uma posição padronizada do eletrodo para cada experimento.
12. Use uma gota de solução salina para ajustar a posição do eletrodo. Enquanto a superfície do crânio ainda está molhada, o eletrodo é facilmente móvel. Em seguida, seque o crânio cuidadosamente com um cotonete.
13. Espere até que a solução salina seque e o eletrodo se prenda firmemente ao crânio.
14. Cubra o eletrodo com uma pequena gota de óleo de silicone para evitar a aderência do eletrodo à pele sobrejacente. Esta etapa ajuda a remover facilmente o eletrodo após a gravação.
    NOTA: Tenha cuidado para não aplicar muito óleo de silicone para evitar deteriorar o contato do eletrodo com o crânio.
15. Feche a pele sobre o eletrodo para proteção e minimização do ruído elétrico.
16. Aplique uma pequena gota de adesivo tecidual (consulte a Tabela de Materiais) na pele para evitar a reabertura da incisão na pele.

5. Registro de EEG e medição de VEP

1. Filtre os sinais de EEG durante a aquisição com um filtro amplo entre 1-9000 Hz. Use configurações de filtro amplo para o controle de artefatos. Execute ruído e filtragem adequada posteriormente durante o processamento offline.
2. Verifique a qualidade do sinal da atividade de EEG em andamento verificando se há ruído elétrico de alta frequência, artefatos de 50/60 Hz e artefatos de ECG. Aplique conexões adequadas de aterramento e referência ao animal e ao equipamento ou aplique blindagem adequada.
3. Verifique a profundidade da anestesia observando a atividade do EEG. Tente evitar um estado de anestesia "muito profundo", caracterizado pela ocorrência de atividade de EEG de supressão de explosão. Considere o curso de tempo do experimento e certifique-se de que a anestesia não fique muito leve durante a gravação.
4. Use um estroboscópio de LED (ou outros tipos de estimulação visual) para produzir flashes ultracurtos (consulte a Tabela de Materiais) (Figura 1).
5. Coloque o estroboscópio a uma distância de 30 cm para estimulação visual binocular na frente do mouse.
   NOTA: O mouse e o estroboscópio são colocados em uma câmara escura e à prova de som durante o experimento.
6. Adapte os camundongos ao escuro por 5 minutos antes da estimulação.
7. Elimine o estroboscópio piscando acionando o estroboscópio com um pulso TTL.
   NOTA: Um artefato de estimulação pode ocorrer devido ao alto voltage do estroboscópio. Isso pode ser atenuado aumentando a distância ou protegendo o eletrodo.
8. Gere gatilhos TTL de hardware com um dispositivo de E/S multifuncional (consulte a Tabela de Materiais) controlado por um PC de estimulação para acionar a fonte de luz (ou seja, estroboscópio).
9. Envie o sinal TTL em paralelo ao sistema de aquisição para fornecer carimbos de data/hora de alta precisão para o início do estímulo.
10. Envie a saída TTL, que é sincronizada com o flash, do estroboscópio LED como feedback e como um segundo controle para carimbos de data/hora precisos do início do estímulo. Registre isso junto com as gravações.
11. Defina a taxa de estímulo (por exemplo, intervalo entre estímulos = 2 s). Defina o número de repetições de estímulo (por exemplo, n = 150 repetições)
12. Ajuste as intensidades manualmente no estroboscópio (por exemplo, duração do flash de 512 μs a um valor fixo de 3000 lm).
    NOTA: Isso, no entanto, deve ser adaptado à questão experimental específica.
13. Inicie a apresentação do estímulo, registre os sinais de EEG com o software de gravação (consulte a Tabela de Materiais) e salve os dados no PC de gravação.

6. Conclusão do experimento, remoção do eletrodo e limpeza do eletrodo

1. Se a gravação fizer parte de um protocolo mais longo, continue com outras etapas experimentais.
2. Ao final do experimento, eutanasiar o animal de acordo com as diretrizes institucionais^23,34.
3. Remova o eletrodo de EEG com cuidado (pois eles podem ser reutilizados).
4. Lentamente, com a aplicação de fluido, remova o eletrodo do crânio.
   NOTA: Os eletrodos podem grudar na superfície do crânio; Evite danos aos locais de platina durante a remoção.
5. Limpe o eletrodo após o experimento com solução salina isotônica NaCl (0,9%) e mergulhe-o em uma solução removedora de proteínas e desinfetante (ver Tabela de Materiais) por 30 min.
6. Armazene o feixe de eletrodos em local seco e protegido.

7. Processamento básico de sinal VEP: Domínio do tempo e da frequência

1. Importe os arquivos de dados brutos para o software de análise (consulte Tabela de materiais).
2. Filtre os sinais de EEG com um filtro de fase zero passa-banda Butterworth entre 1-100 Hz.
   NOTA: Selecione os tipos e parâmetros de filtro adequados, dependendo da respectiva questão de pesquisa 27,35,36.
3. Reduza a resolução dos sinais para 1000 Hz.
4. Segmente os sinais de EEG em tentativas e calcule a média das tentativas para produzir potenciais evocados visuais e determinar a latência de pico N1.
   NOTA: A re-referência pode ser realizada offline, se necessário (por exemplo, referência de média comum, referência bipolar, referência "laplaciana" de média local)²³.
5. Determine os valores de tensão em pontos de interesse específicos e trace mapas de distribuição de tensão usando o software de análise.
6. Calcule a potência de campo global³⁷ calculando o desvio padrão espacial de todos os canais do eletrodo.
7. Calcule um espectrograma de tempo-frequência multi-conicidade com Chronux Toolbox ^28,31. Use um produto de largura de banda TW = 3 e K = 5 confunde com um tamanho de janela de 300 ms e um tamanho de passo de 30 ms.

Resultados

O registro de potenciais evocados visuais com EEG multicanal permite a avaliação da topografia de amplitudes, latências ou componentes de frequência do VEP em camundongos. A Figura 2A mostra um exemplo de uma topografia VEP evocada por flash registrada com um EEG epicraniano de 32 canais de um camundongo C57BL / 6J macho de 3 meses. A atividade evocada visual mais forte ocorre na região occipital acima do córtex visual.

Discussão

Este artigo descreve um método para registrar EEG multicanal epicraniano com eletrodos de filme fino e como adquirir uma representação topográfica consistente de potenciais evocados visuais no camundongo. Aqui, mostramos exemplarmente a estimulação do flash binocular, mas essa abordagem também pode ser aplicada com outros tipos de estímulos visuais (ou seja, monocular, grades espaciais, campo visual focal) usando, por exemplo, uma tela maior.

Uma etapa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bepanthen 5% Dexpantheol	Bayer		Ophtamic gel
Cheetah software 5.11	Neuralnyx	Version 5.11	Recording software for neurophysiologcal signals
Digital Lynx SX	Neuralynx	Digital Lynx 16SX	Recording system
ECG differential amplifier	Otoconsult	WDA2 V1.0
Electric shaver	Aesculap	GT420
Electrode Holder	TSE Systems	430005-HE
Examination light	Heine	HL 5000	Cold light source lamp
Heating Pad + Temperature Control system	CWE	TC-1000 Mouse
Histoacryl 0.5 mL	B.Braun		Tissue adhesive
Infrared heat lamp	Sanitas	SIL 06
Ketamine 10%	WDT		Ketaminhydrochlorid
LED stroboscope	Monarch	Nova Strobe PBL	Visual stimulation
Matlab 2021a	The Mathworks	2021a	Stimulus control and analysis
Moria Vessel Clamp	Fine Science Tools	18320-11
Mouse EEG electrode	NeuroNexus	H32 (Reticular)	32-channel EEG electrode. Thickness: 20 μm; length: 8.6 mm; width 6.8 mm. Platinum sites: 500 μm diameter
Mouse Frame	custom made		Information available on request
Multifunction I/O device	National Instruments	PCIe-6353 with BNC 2090A	Analog stimulus generation, output, and trigger
NaCl 0.9%	B.Braun		Isotonic, sterile, nonpyrogenic
Neuralynx HS36	Neuralynx	HS-36	Headstage
Neuronexus probe connector	Neuralynx	ADPT-HS36-N2T-32A	Electrode connector
Oscilloscope	Tektronix	TDS 2014B
Progent Intensive Cleaner	Menicon		Protein remover and disinfecting solution for rigid gas permeable lenses
Recording PC	HP	HP Z800	Recording PC
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis		Carprofen
Silicon Oil M 1000	Carl Roth	4045.1
Silver wire	Science Products	AG-8W	Diameter 203 µm; ECG and reference electrode
Sound proof chamber	IAC acoustics
Stereotactic Micromanipulator	TSE Systems	430005-M/P	For EEG electrode placement
Stimulation PC	Dell	Dell Precision T5810	Stimulation PC
Surgical microscope	Zeiss	Op-Mi Focus
Surgical tape	3M	1527-0	1.25 cm x 9.1 m
Thilo-Tears 3 mg/g	Alcon Pharma GmbH		Ophtamic gel
Vaselin Lichtenstein	Winthrop		White vaselin ointment
Xylazin 2%	Bernburg		Xylazinehydrochlorid
Xylocaine Spray (10 mg/puff)	Aspen		Lidocaine