Expresión de transgenes virales en corazones de roedores y la evaluación del riesgo de arritmia cardíaca

Resumen

El presente protocolo describe métodos para la expresión transgénica en corazones de rata y ratón mediante inyección intramiocárdica directa del virus bajo guía ecocardiográfica. Los métodos para la evaluación de la susceptibilidad de los corazones a las arritmias ventriculares mediante la estimulación eléctrica programada de corazones aislados, perfundidos con Langendorff, también se explican aquí.

Resumen

La enfermedad cardíaca es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Debido a la facilidad de manejo y abundancia de cepas transgénicas, los roedores se han convertido en modelos esenciales para la investigación cardiovascular. Sin embargo, las arritmias cardíacas letales espontáneas que a menudo causan mortalidad en pacientes con enfermedades cardíacas son raras en modelos roedores de enfermedad cardíaca. Esto se debe principalmente a las diferencias de especies en las propiedades eléctricas cardíacas entre humanos y roedores y plantea un desafío para el estudio de las arritmias cardíacas utilizando roedores. Este protocolo describe un enfoque para permitir la expresión transgénica eficiente en miocardio ventricular de ratón y rata utilizando inyecciones intramusculares guiadas por ecocardiografía de virus recombinantes (adenovirus y virus adenoasociados). Este trabajo también describe un método para permitir una evaluación confiable de la susceptibilidad cardíaca a las arritmias utilizando corazones aislados de ratón y rata perfundidos por Langendorff con estimulaciones eléctricas adrenérgicas y programadas. Estas técnicas son críticas para estudiar los trastornos del ritmo cardíaco asociados con la remodelación cardíaca adversa después de lesiones, como el infarto de miocardio.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo, cobrando la vida de 18 millones de personas solo en 2017¹. Los roedores, especialmente ratones y ratas, se han convertido en el modelo más utilizado en la investigación cardiovascular debido a la facilidad de manejo y la disponibilidad de varias líneas de sobreexpresión o knockout transgénicas. Los modelos de roedores han sido fundamentales para comprender los mecanismos de la enfermedad y para identificar posibles nuevas dianas terapéuticas en el infarto de miocardio², la hipertensión³, la insuficiencia cardíaca⁴ y la aterosclerosis⁵. Sin embargo, el uso de roedores en estudios de arritmias cardíacas está limitado por su pequeño tamaño cardíaco y frecuencia cardíaca más rápida en comparación con los modelos humanos o animales grandes. Por lo tanto, las arritmias letales espontáneas en ratones o ratas después del infarto de miocardio son raras². Los investigadores se ven obligados a centrarse en cambios secundarios indirectos que podrían reflejar un sustrato pro-arrítmico, como la fibrosis o la expresión génica, sin mostrar cambios significativos en la carga de arritmias o tendencias pro-arrítmicas. Para superar esta limitación, en el presente protocolo se describe un método que permite una evaluación fiable de la susceptibilidad de los corazones de ratón y rata a las taquiarritmias ventriculares después de la modificación genética ^6,7 o del infarto de miocardio 2. Este método combina la estimulación del receptor adrenérgico con la estimulación eléctrica programada para inducir taquiarritmias ventriculares en corazones aislados de⁸ ratones y ratas perfundidos por Langendorff.

Los enfoques estándar para la transferencia de genes virales en el tejido miocárdico de roedores a menudo implican la exposición del corazón por toracotomía 9,10,11^, que es un procedimiento invasivo y se asocia con retraso en la recuperación de los animales después del procedimiento. Este artículo describe un método de inyección intramiocárdica directa de virus bajo guía de imágenes de ultrasonido para la sobreexpresión de transgenes. Este procedimiento menos invasivo permite una recuperación más rápida del animal después de la inyección viral y menos lesiones tisulares, en comparación con la toracotomía, reduce el dolor postoperatorio y la inflamación en el animal y, por lo tanto, permite una mejor evaluación de los efectos de los genes transgénicos en la función cardíaca.

Protocolo

Todos los métodos y procedimientos descritos fueron aprobados por la junta de revisión ética de investigación animal de la Universidad de Ottawa y el comité de revisión de bioseguridad del Instituto del Corazón de la Universidad de Ottawa. Los protocolos de seguridad desarrollados incluyen que todos los procedimientos relacionados con adenovirus recombinante o virus adenoasociado (AAV) se realizaron en un gabinete de bioseguridad de nivel II. Todos los elementos en contacto con el virus fueron completamente descontaminados después del experimento. Para el presente estudio se utilizaron ratones Ctnnb1 flox^/flox y αMHC-MerCreMer (8-12 semanas de edad, de ambos sexos) y ratas Sprague-Dawley (200-250 g, macho). Los animales fueron obtenidos de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). Todos los procedimientos relacionados con los animales fueron realizados por personal que ha sido capacitado y aprobado por los comités reguladores institucionales. Se utilizó equipo de protección personal adecuado durante todos los procedimientos.

1. Expresión transgénica viral en tejidos ventriculares de roedores

NOTA: Almacene el adenovirus recombinante o AAV que expresa el gen diana y el virus de control correspondiente, como Ad-GFP (título de 1 x 10¹⁰ PFU/ml) o AAV9-GFP (título de 1 x 10¹³ GC/ml) (ver Tabla de materiales), en un congelador de -80 °C.

1. El día de la inyección del virus, descongele el virus en hielo. Aspirar el virus que expresa el gen diana y el virus control en dos jeringas separadas (volumen = 50 μL) con 30 G 1/2 agujas y mantener en hielo hasta su uso.
   NOTA: Cualquier burbuja en la jeringa y la aguja debe retirarse cuidadosamente.
2. Administrar buprenorfina a ratas o ratones (0,05 mg/kg para ratas, 0,1 mg/kg para ratones, subcutáneos), 1 h más tarde inducir la anestesia con isoflurano al 3%, y mantener el isoflurano al 2% (en oxígeno al 100% a un caudal de 0,5-1,0 L/min) para el procedimiento posterior.
3. Pellizque suavemente el cuerpo del animal (por ejemplo, la cola) con un par de fórceps, y si el animal no responde al pellizco con ningún movimiento corporal, se confirma la anestesia adecuada.
4. Mantenga la temperatura corporal a 37 °C utilizando una almohadilla térmica eléctrica. Afeite el cabello en la región del pecho con un cortapelos.
   NOTA: Se debe tener cuidado al usar una almohadilla térmica eléctrica debido a la posible distribución desigual del calor.
5. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar el secado de la córnea.
6. Mantenga al animal en posición supina y use un sistema de imágenes preclínicas (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes por ultrasonido del corazón del animal en la orientación del eje corto.
   NOTA: Los siguientes pasos se realizan en un gabinete de bioseguridad de nivel II que proporciona un ambiente estéril. Se emplean procedimientos de seguridad estándar, incluidos aquellos con manejo seguro de la aguja.
7. Esterilice la región inferior izquierda del pecho del animal con rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina y alcohol tres veces en un movimiento circular.
8. Bajo la guía de imágenes por ultrasonido, inserte la aguja de 30 G 1/2 de la jeringa que contiene el virus tal como se preparó en el paso 1.1. en el pecho del animal a través del lado inferior izquierdo del pecho del cuerpo.
9. Acerque la punta de la aguja a la pared libre frontal del ventrículo izquierdo e inyecte lentamente 10-15 μL del virus. Verifique la inyección exitosa en imágenes de ultrasonido por el brillo mejorado cerca de la punta de la aguja.
   NOTA: La cantidad de virus inyectado en cada sitio no es más de 15 μL para prevenir el daño físico a los tejidos del miocardio.
10. Extraiga la aguja del corazón e insértela en otras regiones del ventrículo izquierdo para una segunda y tercera inyección de la misma cantidad de virus.
    NOTA: El número total de sitios de inyección está determinado por el diseño experimental. Si se requiere expresión transgénica focal, solo se necesita una inyección; Si se requiere una expresión transgénica más difusa, generalmente se necesitan múltiples sitios de inyección (de tres a cinco).
11. Después de completar las inyecciones, devuelva al animal a su jaula.
12. Vigile cuidadosamente al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y devuélvalo a su habitación de alojamiento.
13. Administrar buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, dos veces al día para ratones, 0,05 mg/kg, dos veces al día para ratas, subcutánea) al animal durante los 2 días siguientes. Devuelva a los animales al vivero y monitoree diariamente cualquier signo inusual de dolor o angustia, y si los encuentra, trate a los animales según los protocolos del comité institucional de cuidado animal.

2. Evaluación de la susceptibilidad a la arritmia cardíaca

NOTA: A los 4-6 días después de la inyección de adenovirus y 1-2 semanas después de la inyección de AAV, evalúe la susceptibilidad de los corazones de los animales a las arritmias cardíacas siguiendo los pasos 2.1.-2.2.

1. Realizar la perfusión de Langendorff del corazón de rata o ratón.
   1. Preparar la solución de Tyrode añadiendo lo siguiente a 1 L de agua: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl₂, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (_1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); y glucosa, 1,8 g (10 mM). Ajuste el pH a 7.40 con NaOH (ver Tabla de materiales).
   2. Filtrar la solución con un filtro de 0,2 μm y burbujear con 100%_O2 continuamente durante los pasos 2.1.6.-2.2.8.
   3. Administrar heparina a la rata o ratón (500 U/kg, inyección intraperitoneal) y 10 min después anestesiar al animal con isoflurano al 3%. Asegurar una anestesia adecuada con un suave pellizco en el cuerpo.
   4. Use un bisturí para hacer una incisión vertical de 1-1.5 cm en la línea clavicular media para una toracotomía izquierda y exponga el corazón.
   5. Recoger el corazón cortando con un par de tijeras a nivel del arco aórtico e inmediatamente poner el corazón en una solución Tyrode helada.
      NOTA: Se tiene precaución de no dañar el corazón durante la recolección del corazón.
   6. Canular la aorta del corazón con una aguja roma (18 G para ratas; 23 G para ratones) conectada a un sistema de perfusión de Langendorff modificado (ver Tabla de materiales) en el modo de caudal constante. Ajuste el caudal para mantener la presión de perfusión en 70-80 mmHg.
      NOTA: Cualquier burbuja en la aguja de perfusión debe eliminarse antes de la canulación aórtica. El uso de un microscopio de disección facilita la canulación .
   7. Colocar el corazón canulado en un plato de plástico de 9,10 cm recubierto de elastómero de silicona con el ventrículo izquierdo hacia arriba y perfundir el corazón ^9,12 con solución Tyrode de burbujas de ^O2 a 37 °C.
   8. Verifique la canulación aórtica correcta al comienzo de la perfusión observando el lavado de sangre del corazón durante los primeros dos o tres latidos del corazón y el cambio del color del corazón de rojo a pálido.
   9. Coloque los electrodos de un sistema de ECG de un animal pequeño (consulte la Tabla de materiales) alrededor del corazón insertándolos en el recubrimiento de elastómero de silicona en el plato (Figura 1). Registre ECG utilizando un software compatible.
2. Realizar estimulación de receptores adrenérgicos y estimulación eléctrica programada para inducir taquiarritmias ventriculares.
   1. Después de una canulación aórtica exitosa, continúe perfundiendo el corazón con la solución de Tyrode durante 20 minutos para estabilizar la preparación del corazón.
   2. Añadir 1 μM de isoproterenol (ver Tabla de materiales) a la solución de Tyrode utilizada para la perfusión cardíaca en los pasos 2.2.3.-2.2.8.
   3. Después de 10 minutos de perfusión de isoproterenol, estimule el corazón en el ápice con dos electrodos de platino conectados a un estimulador eléctrico (consulte la Tabla de materiales).
   4. Comience con el procedimiento de estimulación (Figura 2), que incluye 10 estímulos consecutivos (intervalos S1, 5 V, 100 ms) que son seguidos por un estímulo adicional (S2) con un intervalo inicial de 80 ms. Reducir repetidamente el intervalo S2 en 2 ms cada vez hasta que el latido del corazón ya no pueda ser capturado (es decir, alcanzar el período refractario efectivo del corazón, ERP)¹³.
   5. Monitorizar cualquier taquiarritmia ventricular inducida (incluyendo taquicardia ventricular y fibrilación) mediante ECG.
   6. Si el procedimiento anterior no induce arritmias, agregue otro estímulo adicional (S3) después de S2 con los mismos intervalos inicial (80 ms) y decremento (en 2 ms) hasta que se alcance el ERP.
   7. Si las taquiarritmias ventriculares aún no son inducidas, agregue un estímulo adicional más (S4) después de S3 con los mismos intervalos iniciales y decrecientes hasta que se alcance el ERP.
   8. Si las taquiarritmias ventriculares aún no se inducen (como se espera en los corazones sanos de control), detenga el protocolo de estimulación eléctrica y considere que el corazón no es inducible.

Resultados

Cuando se perfunde siguiendo el protocolo descrito aquí (Figura 1), un corazón aislado de rata o ratón late rítmica y establemente durante al menos 4 h. Si el diseño experimental requiere un período más largo de perfusión cardíaca, es útil agregar albúmina a la solución de perfusión para reducir la aparición de edema miocárdico después de la perfusión prolongada¹⁴. La inclusión de isoproterenol en la solución de perfusión imita la activación del s...

Discusión

Varios pasos son críticos para el éxito de la preparación cardíaca aislada perfundida por Langendorff. En primer lugar, es importante evitar cualquier daño al corazón durante la recolección del corazón (por ejemplo, debido a apretar o cortar accidentalmente con las tijeras). En segundo lugar, es fundamental poner el corazón recogido en una solución fría de Tyrode lo antes posible, ya que esto detendrá los latidos del corazón y reducirá el consumo de oxígeno del corazón. En tercer lugar, la inserción de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson (BD)	305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)	Vector Biolabs	7007
adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)	Vector Biolabs	ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)	Microzone Corporation	N/A	Model #: BK-2-4
Buprenorphine	Vetergesic	DIN 02342510
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	102378
D-Glucose	Fisher Chemical	D16-1
Hair clipper	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volume 50 μL
Heating pad	Life Brand	E12107
Heparin	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Isoflurane	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 software	ADInstruments Inc.	Version 8.1.5	for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mice (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Microscope	Leica	S9i	for Langendorff system
MS400 transducer	VisualSonic Inc.	N/A
Ophthalmic ointment	Systane	DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Pressure meter	NETECH	DigiMano 1000	for Langendorff system
Pump	Cole-Parmer	UZ-77924-65	for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)	Charles River	400
Scalpel blades	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10007-12
Silicone elastomer	Down Inc.	Sylgard 184	for Langendorff system
Small animal ECG system	ADInstruments Inc.	N/A	Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	567530
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System	VisualSonic Inc.	N/A