설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가

요약

본 프로토콜은 심초음파유도 하에 바이러스의 직접 심내내 주사에 의해 래트 및 마우스 심장에서 전이유전자 발현을 위한 방법을 기술한다. 격리 된 Langendorff 관류 심장의 프로그램 된 전기 자극에 의한 심실 부정맥에 대한 심장의 감수성을 평가하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다.

초록

심장병은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 취급의 용이성과 형질 전환 균주의 풍부함으로 인해 설치류는 심혈관 연구의 필수 모델이되었습니다. 그러나 심장병 환자에서 종종 사망을 유발하는 자발적인 치명적인 심장 부정맥은 설치류 심장 질환 모델에서 드뭅니다. 이것은 주로 인간과 설치류 사이의 심장 전기적 특성의 종 차이 때문이며 설치류를 이용한 심장 부정맥 연구에 도전을 제기합니다. 이 프로토콜은 재조합 바이러스 (아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)의 심초음파-유도 근육내 주사를 사용하여 마우스 및 래트 심실 심근에서 효율적인 전이유전자 발현을 가능하게 하는 접근법을 설명한다. 이 연구는 또한 아드레날린 성 및 프로그램 된 전기 자극을 모두 사용하여 분리 된 Langendorff 관류 마우스 및 쥐 심장을 사용하여 부정맥에 대한 심장 감수성을 신뢰할 수있는 평가를 가능하게하는 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 심근 경색과 같은 부상 후 불리한 심장 리모델링과 관련된 심장 리듬 장애를 연구하는 데 중요합니다.

서문

심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 2017^년에만 1,800만 명의 목숨을 앗아갔습니다1. 설치류, 특히 마우스와 쥐는 취급의 용이성과 다양한 형질전환 과발현 또는 녹아웃 라인의 가용성으로 인해 심혈관 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델이 되었습니다. 설치류 모델은 질병 메커니즘을 이해하고 심근 경색², 고혈압³, 심부전⁴ 및 죽상 동맥 경화증⁵에서 잠재적 인 새로운 치료 표적을 식별하는 데 기본이되었습니다. 그러나 심장 부정맥 연구에서 설치류의 사용은 인간 또는 대형 동물 모델에 비해 작은 심장 크기와 빠른 심박수로 인해 제한됩니다. 따라서 심근 경색 후 생쥐 또는 쥐의 자발적인 치명적인 부정맥은 드물다². 연구자들은 부정맥 부담이나 부정맥 경향의 의미있는 변화를 보여주지 않고 섬유증이나 유전자 발현과 같은 친 부정맥 기질을 반영 할 수있는 간접적 인 2 차 변화에 집중해야합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 변형 ^6,7 또는 심근 경색² 후에 심실 성 빈맥에 대한 마우스 및 래트 심장의 감수성을 신뢰성있게 평가할 수있는 방법이 본 프로토콜에 기재되어있다. 이 방법은 아드레날린 수용체 자극과 프로그램 된 전기 자극을 결합하여 분리 된 Langendorff 관류⁸ 마우스 및 쥐 심장에서 심실 성 빈맥을 유도합니다.

설치류 심근 조직에서 바이러스 유전자 전달을위한 표준 접근법은 종종 침습적 절차이며 절차 후 동물의 회복 지연과 관련된 개흉술 9,10,11에 의한 심장 노출을 포함합니다. 이 논문은 전이유전자의 과발현에 대한 초음파 영상 유도 하에 바이러스를 직접 심근내 주사하는 방법을 설명한다. 이 덜 침습적 인 절차는 개흉술에 비해 바이러스 주사 후 더 빠른 동물 회복과 조직 손상을 허용하고 동물의 수술 후 통증과 염증을 줄여 심장 기능에 대한 형질 전환 유전자의 효과를 더 잘 평가할 수 있습니다.

프로토콜

설명 된 모든 방법과 절차는 오타와 대학의 동물 연구 윤리 검토위원회와 오타와 대학 심장 연구소의 생물 안전성 검토위원회의 승인을 받았습니다. 개발된 안전성 프로토콜에는 재조합 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 다루는 모든 절차가 레벨 II 생물안전 캐비닛에서 수행되었다는 것이 포함됩니다. 바이러스와 접촉 한 모든 항목은 실험 후 철저히 오염 제거되었습니다. Ctnnb1 플록스^/플록스 및 αMHC-MerCreMer 마우스(8-12주령, 성별) 및 Sprague-Dawley 쥐(200-250g, 수컷)를 본 연구에 사용했습니다. 동물은 상업적 출처로부터 수득하였다(재료 표 참조). 동물을 다루는 모든 절차는 기관 규제위원회에서 훈련되고 승인 된 직원이 수행했습니다. 모든 절차 중에 적절한 개인 보호 장비가 사용되었습니다.

1. 설치류 심실 조직에서의 바이러스 전이 유전자 발현

참고: 표적 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 또는 AAV(역가 1 x 10¹⁰ PFU/mL) 또는 AAV9-GFP(역가 1 x 10¹³ GC/mL)( 재료 표 참조)와 같은 해당 대조군 바이러스를 -80°C 냉동고에 보관하십시오.

1. 바이러스 주입 당일에 얼음에서 바이러스를 해동하십시오. 표적 유전자를 발현하는 바이러스와 대조군 바이러스를 30G 1/2 바늘로 두 개의 별도 주사기(부피=50μL)에 흡인하고 사용할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
   알림: 주사기와 바늘의 기포는 조심스럽게 제거해야합니다.
2. 부프레노르핀을 쥐 또는 생쥐에게 투여하고(쥐의 경우 0.05mg/kg, 생쥐의 경우 0.1mg/kg, 피하), 1시간 후 3% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하고, 후속 절차를 위해 이소플루란을 2%(0.5-1.0L/min의 유속으로 100% 산소에서)로 유지합니다.
3. 한 쌍의 집게로 동물의 몸 (예 : 꼬리)을 부드럽게 꼬집고 동물이 몸의 움직임으로 꼬집음에 반응하지 않으면 적절한 마취가 확인됩니다.
4. 전기 가열 패드를 사용하여 체온을 37 ° C로 유지하십시오. 머리 깎기를 사용하여 가슴 부위의 머리카락을 면도하십시오.
   알림: 전기 가열 패드를 사용하는 동안 잠재적인 고르지 않은 열 분포 때문에 주의해야 합니다.
5. 각막의 건조를 막기 위해 양쪽 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
6. 동물을 앙와위 자세로 유지하고 전임상 영상 시스템 ( 재료 표 참조)을 사용하여 단축 방향으로 동물의 심장을 초음파 영상화하십시오.
   알림: 다음 단계는 멸균 환경을 제공하는 레벨 II 생물안전 캐비닛에서 수행됩니다. 안전한 바늘 취급을 포함한 표준 안전 절차가 사용됩니다.
7. 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽과 알코올을 원형 운동으로 3 번 번갈아 가며 동물의 왼쪽 가슴 아래 부위를 소독하십시오.
8. 초음파 영상 유도에 따라 30단계에서 준비한 바이러스가 포함된 주사기의 1/2G 바늘을 1.1G 삽입합니다. 몸의 왼쪽 가슴 아래쪽을 통해 동물의 가슴으로.
9. 바늘 끝을 좌심실 전면 자유 벽에 접근하고 10-15 μL의 바이러스를 천천히 주입합니다. 바늘 끝 근처의 향상된 밝기로 초음파 이미지에서 성공적인 주입을 확인하십시오.
   참고: 각 부위에 주입되는 바이러스의 양은 심근 조직의 물리적 손상을 방지하기 위해 15μL 이하입니다.
10. 심장에서 바늘을 빼내고 좌심실의 다른 부위에 삽입하여 같은 양의 바이러스를 두 번째 및 세 번째로 주사합니다.
    참고: 총 주사 부위 수는 실험 설계에 의해 결정됩니다. 국소 전이 유전자 발현이 필요한 경우 한 번의 주사 만 필요합니다. 더 확산 성 전이 유전자 발현이 필요한 경우 일반적으로 여러 주사 부위 (3-5 개)가 필요합니다.
11. 주사가 끝나면 동물을 새장으로 되돌립니다.
12. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하고 수용실로 되돌릴 수있는 충분한 의식을 회복 할 때까지주의 깊게 모니터링하십시오.
13. 다음 2 일 동안 부 프레 노르 핀 HCl (0.1 mg / kg, 마우스의 경우 하루에 두 번, 0.05 mg / kg, 쥐의 경우 하루에 두 번, 피하)을 동물에게 투여하십시오. 동물을 사육장으로 돌려보내고 통증이나 고통의 비정상적인 징후가 있는지 매일 모니터링하고, 발견되면 기관 동물 관리 위원회 프로토콜에 따라 동물을 치료합니다.

2. 심장 부정맥 감수성 평가

참고: 아데노바이러스 주사 후 4-6일 및 AAV 주사 후 1-2주에 2.1.-2.2단계에 따라 심장 부정맥에 대한 동물 심장의 감수성을 평가합니다.

1. 쥐 또는 마우스 심장의 Langendorff 관류를 수행하십시오.
   1. 1 L의 물에 다음을 첨가하여 티로드 용액을 제조한다: NaCl, 7.9 g (최종 = 135 mM); KCl, 0.37 g (5.0 mM); _CaCl2, 0.27 g (1.8 mM); _MgCl2, 0.24 g (1.2 mM); 헤페스, 2.38 g (10 mM); 및 포도당, 1.8 g (10 mM). NaOH로 pH를 7.40으로 조정합니다 ( 재료 표 참조).
   2. 0.2μm 필터로 용액을 여과하고 2.1.6.-2.2.8 단계에서 연속적으로 100%_O2 로 버블링합니다.
   3. 쥐 또는 마우스에 헤파린을 투여하고 (500 U / kg, 복강 내 주사) 10 분 후에 3 % 이소 플루 란으로 동물을 마취시킵니다. 몸에 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 보장하십시오.
   4. 메스를 사용하여 왼쪽 쇄골 절개술을 위해 쇄골 중간 선에 1-1.5cm의 수직 절개를하고 심장을 노출시킵니다.
   5. 대동맥 궁 수준에서 가위로 절단하여 심장을 모으고 즉시 얼음처럼 차가운 Tyrode 용액에 심장을 넣으십시오.
      알림: 심장 수집 중에 심장을 손상시키지 않도록주의하십시오.
   6. 일정한 유속 모드에서 수정 된 Langendorff 관류 시스템 ( 재료 표 참조)에 연결된 무딘 바늘 (쥐의 경우 18G, 생쥐의 경우 23G)로 심장의 대동맥을 캐뉼러합니다. 관류 압력을 70-80 mmHg로 유지하기 위해 유량을 조정하십시오.
      알림: 관류 바늘의 모든 기포는 대동맥 캐뉼러 형성 전에 제거해야 합니다. 해부 현미경을 사용하면 캐뉼러가 용이합니다.
   7. 캐뉼러 된 심장을 실리콘 엘라스토머로 코팅 된 9, 10cm 플라스틱 접시에 놓고 좌심실이 위를 향하게하고 심장 ^9,12를 O ₂ 버블 Tyrode 용액으로 37 ° C에서 관류합니다.
   8. 처음 2-3 번의 심장 박동 동안 심장에서 혈액이 씻겨 나가고 심장 색이 빨간색에서 창백함으로 변하는 것을 관찰하여 관류 시작시 올바른 대동맥 캐뉼러를 확인하십시오.
   9. 작은 동물 ECG 시스템의 전극( 재료 표 참조)을 접시의 실리콘 엘라스토머 코팅에 삽입하여 심장 주위에 놓습니다(그림 1). 호환되는 소프트웨어를 사용하여 ECG를 기록합니다.
2. 아드레날린 수용체 자극과 프로그램 된 전기 자극을 수행하여 심실 빈맥을 유도합니다.
   1. 성공적인 대동맥 캐뉼러 후, 심장 준비를 안정화하기 위해 20 분 동안 Tyrode 용액으로 심장을 계속 관류하십시오.
   2. 1 단계에서 심장 관류에 사용되는 Tyrode 용액에 2.2.3.2.8μM 이소 프로 테레 놀 ( 재료 표 참조)을 추가합니다.
   3. 이소프로테레놀 관류 10분 후, 전기 자극기에 연결된 두 개의 백금 전극으로 정점에서 심장을 자극합니다( 재료 표 참조).
   4. 10개의 연속 자극(S1, 5V, 100ms 간격)과 초기 간격이 80ms인 추가 자극(S2)을 포함하는 자극 절차(그림 2)로 시작합니다. 심장 박동을 더 이상 캡처할 수 없을 때까지(즉, 심장의 유효 불응 기간인 ERP에 도달할 때까지) 매번 S2 간격을 2ms씩 반복적으로 줄입니다.¹³.
   5. ECG에 의한 유도 된 심실 빈맥 (심실 빈맥 및 세동 포함)을 모니터링하십시오.
   6. 위의 절차로 부정맥이 유발되지 않으면 ERP에 도달할 때까지 동일한 초기(80ms) 및 감소(2ms) 간격으로 S2 뒤에 또 다른 추가 자극(S3)을 추가합니다.
   7. 심실 빈맥이 여전히 유도되지 않으면 ERP에 도달 할 때까지 동일한 초기 및 감소 간격으로 S3 후에 추가 자극 (S4)을 하나 더 추가하십시오.
   8. 심실 빈맥이 여전히 유도되지 않으면 (건강한 심장 조절에서 예상되는대로) 전기 자극 프로토콜을 중단하고 심장을 유도하지 않는 것으로 간주하십시오.

결과

여기에 설명된 프로토콜(그림 1)에 따라 관류되면 분리된 쥐 또는 마우스의 심장이 최소 4시간 동안 리드미컬하고 안정적으로 박동합니다. 실험 설계가 더 긴 기간의 심장 관류를 요구하는 경우, 장기간 관류 후 심근 부종의 발생을 줄이기 위해 관류 용액에 알부민을 첨가하는 것이 도움이됩니다¹⁴. 관류 용액에 이소 프로 테레 놀을 포함시키는 것은 심근 경...

토론

Langendorff-관류 및 격리 된 심장 준비의 성공을 위해서는 몇 가지 단계가 중요합니다. 첫째, 심장 수집 중 심장 손상을 피하는 것이 중요합니다 (예 : 실수로 짜내거나 가위로 자르는 경우). 둘째, 수집 된 심장을 가능한 한 빨리 차가운 Tyrode 용액에 넣는 것이 심장 박동을 멈추고 심장의 산소 소비를 줄이기 때문에 중요합니다. 셋째, 대동맥에 삽입하는 바늘이 너무 깊어서는 안되며, 이상적으로는 바...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson (BD)	305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)	Vector Biolabs	7007
adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)	Vector Biolabs	ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)	Microzone Corporation	N/A	Model #: BK-2-4
Buprenorphine	Vetergesic	DIN 02342510
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	102378
D-Glucose	Fisher Chemical	D16-1
Hair clipper	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volume 50 μL
Heating pad	Life Brand	E12107
Heparin	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Isoflurane	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 software	ADInstruments Inc.	Version 8.1.5	for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mice (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Microscope	Leica	S9i	for Langendorff system
MS400 transducer	VisualSonic Inc.	N/A
Ophthalmic ointment	Systane	DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Pressure meter	NETECH	DigiMano 1000	for Langendorff system
Pump	Cole-Parmer	UZ-77924-65	for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)	Charles River	400
Scalpel blades	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10007-12
Silicone elastomer	Down Inc.	Sylgard 184	for Langendorff system
Small animal ECG system	ADInstruments Inc.	N/A	Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	567530
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System	VisualSonic Inc.	N/A