Expression de transgènes viraux dans les cœurs de rongeurs et évaluation du risque d’arythmie cardiaque

Résumé

Le présent protocole décrit des méthodes d’expression transgénique dans le cœur de rats et de souris par injection intramyocardique directe du virus sous guidage échocardiographique. Les méthodes d’évaluation de la susceptibilité des cœurs aux arythmies ventriculaires par la stimulation électrique programmée de cœurs isolés perfusés par Langendorff sont également expliquées ici.

Résumé

Les maladies cardiaques sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. En raison de la facilité de manipulation et de l’abondance des souches transgéniques, les rongeurs sont devenus des modèles essentiels pour la recherche cardiovasculaire. Cependant, les arythmies cardiaques létales spontanées qui causent souvent la mortalité chez les patients atteints de maladies cardiaques sont rares chez les modèles de maladies cardiaques chez les rongeurs. Cela est principalement dû aux différences entre les espèces dans les propriétés électriques cardiaques entre les humains et les rongeurs et pose un défi à l’étude des arythmies cardiaques chez les rongeurs. Ce protocole décrit une approche permettant une expression transgénique efficace dans le myocarde ventriculaire de souris et de rat en utilisant des injections intramusculaires guidées par échocardiographie de virus recombinant (adénovirus et virus adéno-associé). Ce travail décrit également une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité cardiaque aux arythmies à l’aide de cœurs de souris et de rats isolés, perfusés par Langendorff, avec des stimulations électriques adrénergiques et programmées. Ces techniques sont essentielles pour étudier les troubles du rythme cardiaque associés à un remodelage cardiaque indésirable après des blessures, telles que l’infarctus du myocarde.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, coûtant la vie à 18 millions de personnes rien qu’en 2017¹. Les rongeurs, en particulier les souris et les rats, sont devenus le modèle le plus couramment utilisé dans la recherche cardiovasculaire en raison de la facilité de manipulation et de la disponibilité de diverses surexpressions transgéniques ou de lignes knockout. Les modèles de rongeurs ont été fondamentaux pour comprendre les mécanismes de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’infarctus du myocarde², l’hypertension³....

Protocole

Toutes les méthodes et procédures décrites ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche animale de l’Université d’Ottawa et le comité d’examen de la biosécurité de l’Institut de cardiologie de l’Université d’Ottawa. Les protocoles de sécurité élaborés comprennent que toutes les procédures relatives à l’adénovirus recombinant ou au virus adéno-associé (AAV) ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité de niveau II. Tous les objets en contact avec le virus ont été soigneusement décontaminés après l’expérience. Des souris Ctnnb1 flox^/flox et αMHC-MerCreMer (âgées de 8 à 12 semaines, des deux sexes) et des rats Sprague-Dawley (200 ....

Résultats

Lorsqu’il est perfusé suivant le protocole décrit ici (Figure 1), un cœur de rat ou de souris isolé bat de manière rythmique et stable pendant au moins 4 heures. Si la conception expérimentale nécessite une période plus longue de perfusion cardiaque, il est utile d’ajouter de l’albumine dans la solution de perfusion pour réduire l’apparition d’un œdème myocardique après une perfusion de longue durée¹⁴. L’inclusion d’isoprotérénol dans la s.......

Discussion

Plusieurs étapes sont essentielles au succès de la préparation cardiaque isolée perfusée par Langendorff. Tout d’abord, il est important d’éviter tout dommage au cœur pendant la collecte du cœur (par exemple, en raison d’une compression accidentelle ou d’une coupure avec les ciseaux). Deuxièmement, il est essentiel de mettre le cœur recueilli dans une solution froide de Tyrode dès que possible, car cela arrêtera le rythme cardiaque et réduira la consommation d’oxygène du cœur. Troisièmement, l?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson (BD)	305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)	Vector Biolabs	7007
adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)	Vector Biolabs	ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)	Microzone Corporation	N/A	Model #: BK-2-4
Buprenorphine	Vetergesic	DIN 02342510
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	102378
D-Glucose	Fisher Chemical	D16-1
Hair clipper	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volume 50 μL
Heating pad	Life Brand	E12107
Heparin	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Isoflurane	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 software	ADInstruments Inc.	Version 8.1.5	for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mice (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Microscope	Leica	S9i	for Langendorff system
MS400 transducer	VisualSonic Inc.	N/A
Ophthalmic ointment	Systane	DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Pressure meter	NETECH	DigiMano 1000	for Langendorff system
Pump	Cole-Parmer	UZ-77924-65	for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)	Charles River	400
Scalpel blades	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10007-12
Silicone elastomer	Down Inc.	Sylgard 184	for Langendorff system
Small animal ECG system	ADInstruments Inc.	N/A	Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	567530
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System	VisualSonic Inc.	N/A