Expression de transgènes viraux dans les cœurs de rongeurs et évaluation du risque d’arythmie cardiaque

Résumé

Le présent protocole décrit des méthodes d’expression transgénique dans le cœur de rats et de souris par injection intramyocardique directe du virus sous guidage échocardiographique. Les méthodes d’évaluation de la susceptibilité des cœurs aux arythmies ventriculaires par la stimulation électrique programmée de cœurs isolés perfusés par Langendorff sont également expliquées ici.

Résumé

Les maladies cardiaques sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. En raison de la facilité de manipulation et de l’abondance des souches transgéniques, les rongeurs sont devenus des modèles essentiels pour la recherche cardiovasculaire. Cependant, les arythmies cardiaques létales spontanées qui causent souvent la mortalité chez les patients atteints de maladies cardiaques sont rares chez les modèles de maladies cardiaques chez les rongeurs. Cela est principalement dû aux différences entre les espèces dans les propriétés électriques cardiaques entre les humains et les rongeurs et pose un défi à l’étude des arythmies cardiaques chez les rongeurs. Ce protocole décrit une approche permettant une expression transgénique efficace dans le myocarde ventriculaire de souris et de rat en utilisant des injections intramusculaires guidées par échocardiographie de virus recombinant (adénovirus et virus adéno-associé). Ce travail décrit également une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité cardiaque aux arythmies à l’aide de cœurs de souris et de rats isolés, perfusés par Langendorff, avec des stimulations électriques adrénergiques et programmées. Ces techniques sont essentielles pour étudier les troubles du rythme cardiaque associés à un remodelage cardiaque indésirable après des blessures, telles que l’infarctus du myocarde.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, coûtant la vie à 18 millions de personnes rien qu’en 2017¹. Les rongeurs, en particulier les souris et les rats, sont devenus le modèle le plus couramment utilisé dans la recherche cardiovasculaire en raison de la facilité de manipulation et de la disponibilité de diverses surexpressions transgéniques ou de lignes knockout. Les modèles de rongeurs ont été fondamentaux pour comprendre les mécanismes de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’infarctus du myocarde², l’hypertension³, l’insuffisance cardiaque⁴ et l’athérosclérose⁵. Cependant, l’utilisation de rongeurs dans les études sur les arythmies cardiaques est limitée par leur petite taille cardiaque et leur fréquence cardiaque plus rapide par rapport aux modèles humains ou aux grands animaux. Par conséquent, les arythmies létales spontanées chez la souris ou le rat après un infarctus du myocarde sont rares². Les chercheurs sont obligés de se concentrer sur les changements secondaires indirects qui pourraient refléter un substrat pro-arythmique, tels que la fibrose ou l’expression génique, sans montrer de changements significatifs dans la charge de l’arythmie ou les tendances pro-arythmiques. Pour surmonter cette limitation, une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité des cœurs de souris et de rats aux tachyarythmies ventriculaires après modification génétique ^6,7 ou infarctus du myocarde² est décrite dans le présent protocole. Cette méthode combine la stimulation des récepteurs adrénergiques avec la stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires dans des cœurs isolés de souris et de rats perfusés^par Langendorff.

Les approches standard pour le transfert de gènes viraux dans le tissu myocardique des rongeurs impliquent souvent l’exposition du cœur par thoracotomie 9,10,11^, qui est une procédure invasive et est associée à une récupération retardée des animaux après la procédure. Cet article décrit une méthode d’injection intramyocardique directe de virus sous guidage d’imagerie par ultrasons pour la surexpression de transgènes. Cette procédure moins invasive permet une récupération plus rapide de l’animal après une injection virale et moins de lésions tissulaires, par rapport à la thoracotomie, réduit la douleur postopératoire et l’inflammation chez l’animal et, ainsi, permet une meilleure évaluation des effets des gènes transgéniques sur la fonction cardiaque.

Protocole

Toutes les méthodes et procédures décrites ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche animale de l’Université d’Ottawa et le comité d’examen de la biosécurité de l’Institut de cardiologie de l’Université d’Ottawa. Les protocoles de sécurité élaborés comprennent que toutes les procédures relatives à l’adénovirus recombinant ou au virus adéno-associé (AAV) ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité de niveau II. Tous les objets en contact avec le virus ont été soigneusement décontaminés après l’expérience. Des souris Ctnnb1 flox^/flox et αMHC-MerCreMer (âgées de 8 à 12 semaines, des deux sexes) et des rats Sprague-Dawley (200 à 250 g, mâles) ont été utilisés pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). Toutes les procédures concernant les animaux ont été effectuées par du personnel formé et approuvé par les comités de réglementation de l’établissement. Un équipement de protection individuelle approprié a été utilisé pendant toutes les procédures.

1. Expression d’un transgène viral dans les tissus ventriculaires de rongeurs

REMARQUE : Conserver l’adénovirus recombinant ou l’AAV qui exprime le gène cible et le virus témoin correspondant, tel que Ad-GFP (titre de 1 x 10 10 UFP/mL) ou AAV9-GFP (titre de 1 x 10¹³ GC/mL) (voir le tableau des matières), dans un congélateur à −⁸⁰ °C.

1. Le jour de l’injection du virus, décongelez le virus sur la glace. Aspirer le virus exprimant le gène cible et le virus témoin dans deux seringues distinctes (volume = 50 μL) avec des aiguilles de 30 G 1/2 et conserver sur la glace jusqu’à utilisation.
   REMARQUE: Toutes les bulles dans la seringue et l’aiguille doivent être soigneusement enlevées.
2. Administrer de la buprénorphine à des rats ou des souris (0,05 mg/kg pour les rats, 0,1 mg/kg pour les souris, sous-cutanée), induire une anesthésie 1 h plus tard en utilisant 3 % d’isoflurane, et maintenir l’isoflurane à 2 % (dans 100 % d’oxygène à un débit de 0,5 à 1,0 L/min) pour la procédure suivante.
3. Pincez doucement le corps de l’animal (p. ex., la queue) avec une paire de pinces, et si l’animal ne répond pas au pincement par des mouvements du corps, une anesthésie appropriée est confirmée.
4. Maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant électrique. Rasez les cheveux dans la région de la poitrine à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
   REMARQUE: Des précautions doivent être prises lors de l’utilisation d’un coussin chauffant électrique en raison de la répartition inégale potentielle de la chaleur.
5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
6. Gardez l’animal en décubitus dorsal et utilisez un système d’imagerie préclinique (voir le tableau des matériaux) pour l’imagerie échographique du cœur de l’animal dans l’orientation à axe court.
   REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées dans une enceinte de biosécurité de niveau II qui fournit un environnement stérile. Les procédures de sécurité standard, y compris celles qui prévoient la manipulation sécuritaire des aiguilles, sont utilisées.
7. Stérilisez la région inférieure gauche de la poitrine de l’animal avec des rondes alternées d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et d’alcool trois fois dans un mouvement circulaire.
8. Sous guidage d’imagerie par ultrasons, insérer l’aiguille de 30 G 1/2 de la seringue contenant le virus telle que préparée à l’étape 1.1. dans la poitrine de l’animal par le côté inférieur gauche de la poitrine du corps.
9. Approchez l’extrémité de l’aiguille dans la paroi libre avant ventriculaire gauche et injectez lentement 10-15 μL du virus. Vérifier la réussite de l’injection dans les images échographiques par la luminosité améliorée près de la pointe de l’aiguille.
   REMARQUE : La quantité de virus injectée à chaque site ne dépasse pas 15 μL pour prévenir les dommages physiques aux tissus myocardiques.
10. Retirez l’aiguille du cœur et insérez-la dans d’autres régions du ventricule gauche pour une deuxième et une troisième injection de la même quantité de virus.
    REMARQUE : Le nombre total de sites d’injection est déterminé par le plan expérimental. Si l’expression du transgène focal est nécessaire, une seule injection est nécessaire; Si une expression transgénique plus diffuse est nécessaire, plusieurs sites d’injection (trois à cinq) sont généralement nécessaires.
11. Une fois les injections terminées, remettez l’animal dans sa cage.
12. Surveillez attentivement l’animal jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale et le ramener dans sa chambre de logement.
13. Administrer de la buprénorphine HCl (0,1 mg/kg, deux fois par jour pour les souris, 0,05 mg/kg, deux fois par jour pour les rats, sous-cutanée) à l’animal pendant les 2 jours suivants. Retourner les animaux au vivarium et surveiller quotidiennement tout signe inhabituel de douleur ou de détresse et, s’ils sont trouvés, traiter les animaux conformément aux protocoles du comité de protection des animaux de l’établissement.

2. Évaluation de la susceptibilité à l’arythmie cardiaque

NOTE: 4-6 jours après l’injection de l’adénovirus et 1-2 semaines après l’injection d’AAV, évaluer la sensibilité du cœur de l’animal aux arythmies cardiaques en suivant les étapes 2.1.-2.2.

1. Effectuer une perfusion Langendorff du cœur de rat ou de souris.
   1. Préparer la solution Tyrode en ajoutant ce qui suit à 1 L d’eau: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl₂, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (_1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); et glucose, 1,8 g (10 mM). Ajustez le pH à 7,40 avec NaOH (voir le tableau des matériaux).
   2. Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm et faire des bulles avec 100% O 2 en continu pendant les étapes 2.1.6.-_2.2.8 .
   3. Administrer de l’héparine au rat ou à la souris (500 U/kg, injection intrapéritonéale) et anesthésier l’animal 10 min plus tard avec de l’isoflurane à 3%. Assurez-vous d’une anesthésie adéquate avec une légère pincement sur le corps.
   4. Utilisez un scalpel pour faire une incision verticale de 1 à 1,5 cm dans la ligne mi-claviculaire pour une thoracotomie gauche et exposer le cœur.
   5. Recueillir le cœur en coupant avec une paire de ciseaux au niveau de l’arc aortique et mettre immédiatement le cœur dans une solution de Tyrode glacée.
      REMARQUE: Des précautions sont prises pour ne pas endommager le cœur pendant la collecte cardiaque.
   6. Canuler l’aorte du cœur avec une aiguille émoussée (18 G pour les rats; 23 G pour les souris) reliée à un système de perfusion de Langendorff modifié (voir Tableau des matériaux) en mode débit constant. Ajustez le débit pour maintenir la pression de perfusion à 70-80 mmHg.
      REMARQUE: Toutes les bulles dans l’aiguille de perfusion doivent être enlevées avant la canulation aortique. L’utilisation d’un microscope à dissection facilite la canulation.
   7. Placer le cœur canulé dans une capsule en plastique de 9,10 cm recouverte d’élastomère de silicone, le ventricule gauche tourné vers le haut et perfuser le cœur ^9,12 avec une solution de Tyrode à bulles d’O2 à 37 °C.
   8. Vérifiez la bonne canulation aortique au début de la perfusion en observant le lavage du sang du cœur pendant les deux ou trois premiers battements cardiaques et le changement de couleur du cœur du rouge au pâle.
   9. Placez les électrodes d’un système ECG pour petit animal (voir le tableau des matériaux) autour du cœur en les insérant dans le revêtement en élastomère de silicone de la capsule (Figure 1). Enregistrez l’ECG à l’aide d’un logiciel compatible.
2. Effectuer une stimulation des récepteurs adrénergiques et une stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires.
   1. Après une canulation aortique réussie, continuez à perfuser le cœur avec la solution Tyrode pendant 20 minutes pour stabiliser la préparation cardiaque.
   2. Ajouter 1 μM d’isoprotérénol (voir le tableau des matériaux) à la solution Tyrode utilisée pour la perfusion cardiaque aux étapes 2.2.3.-2.2.8.
   3. Après 10 min de perfusion d’isoprotérenol, stimuler le cœur à l’apex avec deux électrodes de platine reliées à un stimulateur électrique (voir Tableau des matériaux).
   4. Commencez par la procédure de stimulation (Figure 2), qui comprend 10 stimuli consécutifs (intervalles S1, 5 V, 100 ms) suivis d’un stimulus supplémentaire (S2) avec un intervalle initial de 80 ms. Réduisez à plusieurs reprises l’intervalle S2 de 2 ms à chaque fois jusqu’à ce que le rythme cardiaque ne puisse plus être capturé (c.-à-d. atteindre la période réfractaire effective du cœur, ERP)¹³.
   5. Surveiller toute tachyarythmie ventriculaire induite (y compris la tachycardie ventriculaire et la fibrillation) par ECG.
   6. Si aucune arythmie n’est induite par la procédure ci-dessus, ajoutez un autre stimulus supplémentaire (S3) après S2 avec les mêmes intervalles initiaux (80 ms) et décrémentés (de 2 ms) jusqu’à ce que l’ERP soit atteint.
   7. Si les tachyarythmies ventriculaires ne sont toujours pas induites, ajoutez un stimulus supplémentaire (S4) après S3 avec les mêmes intervalles initiaux et décrémentaires jusqu’à ce que l’ERP soit atteint.
   8. Si les tachyarythmies ventriculaires ne sont toujours pas induites (comme prévu chez les cœurs sains de contrôle), arrêtez le protocole de stimulation électrique et considérez que le cœur n’est pas inductible.

Résultats

Lorsqu’il est perfusé suivant le protocole décrit ici (Figure 1), un cœur de rat ou de souris isolé bat de manière rythmique et stable pendant au moins 4 heures. Si la conception expérimentale nécessite une période plus longue de perfusion cardiaque, il est utile d’ajouter de l’albumine dans la solution de perfusion pour réduire l’apparition d’un œdème myocardique après une perfusion de longue durée¹⁴. L’inclusion d’isoprotérénol dans la s...

Discussion

Plusieurs étapes sont essentielles au succès de la préparation cardiaque isolée perfusée par Langendorff. Tout d’abord, il est important d’éviter tout dommage au cœur pendant la collecte du cœur (par exemple, en raison d’une compression accidentelle ou d’une coupure avec les ciseaux). Deuxièmement, il est essentiel de mettre le cœur recueilli dans une solution froide de Tyrode dès que possible, car cela arrêtera le rythme cardiaque et réduira la consommation d’oxygène du cœur. Troisièmement, l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson (BD)	305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)	Vector Biolabs	7007
adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)	Vector Biolabs	ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)	Microzone Corporation	N/A	Model #: BK-2-4
Buprenorphine	Vetergesic	DIN 02342510
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	102378
D-Glucose	Fisher Chemical	D16-1
Hair clipper	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volume 50 μL
Heating pad	Life Brand	E12107
Heparin	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Isoflurane	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 software	ADInstruments Inc.	Version 8.1.5	for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mice (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Microscope	Leica	S9i	for Langendorff system
MS400 transducer	VisualSonic Inc.	N/A
Ophthalmic ointment	Systane	DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Pressure meter	NETECH	DigiMano 1000	for Langendorff system
Pump	Cole-Parmer	UZ-77924-65	for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)	Charles River	400
Scalpel blades	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10007-12
Silicone elastomer	Down Inc.	Sylgard 184	for Langendorff system
Small animal ECG system	ADInstruments Inc.	N/A	Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	567530
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System	VisualSonic Inc.	N/A