JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает методы экспрессии трансгенов в сердцах крыс и мышей путем прямой интрамиокардиальной инъекции вируса под руководством эхокардиографии. Здесь также объясняются методы оценки восприимчивости сердца к желудочковым аритмиям путем запрограммированной электрической стимуляции изолированных, перфузированных Лангендорфом сердец.

Аннотация

Болезни сердца являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Благодаря простоте обращения и обилию трансгенных штаммов, грызуны стали важными моделями для сердечно-сосудистых исследований. Тем не менее, спонтанные летальные сердечные аритмии, которые часто вызывают смертность у пациентов с сердечными заболеваниями, редко встречаются у грызунов. Это в первую очередь связано с видовыми различиями в электрических свойствах сердца между человеком и грызунами и представляет собой проблему для изучения сердечных аритмий с использованием грызунов. Этот протокол описывает подход, обеспечивающий эффективную экспрессию трансгенов в желудочковом миокарде мышей и крыс с использованием внутримышечных инъекций рекомбинантного вируса (аденовируса и аденоассоциированного вируса) под управлением эхокардиографии). В этой работе также излагается метод, позволяющий достоверно оценить сердечную восприимчивость к аритмиям с использованием изолированных, перфузированных Лангендорфом мышечных и крысиных сердец как с адренергической, так и с запрограммированной электрической стимуляцией. Эти методы имеют решающее значение для изучения нарушений сердечного ритма, связанных с неблагоприятным ремоделированием сердца после травм, таких как инфаркт миокарда.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире, унося жизни 18 миллионов человек только в 2017 году1. Грызуны, особенно мыши и крысы, стали наиболее часто используемой моделью в сердечно-сосудистых исследованиях из-за простоты обращения и наличия различных трансгенных гиперэкспрессий или нокаутирующих линий. Модели грызунов были фундаментальными для понимания механизмов заболевания и для выявления потенциальных новых терапевтических целей при инфаркте миокарда2, гипертонии3,сердечной недостаточности 4 и атеросклерозе5. Однако использование грызунов в исследованиях сердечных аритмий ограничено их небольшим размером сердца и более быстрым сердечным ритмом по сравнению с человеческими или крупными животными моделями. Поэтому спонтанные летальные аритмии у мышей или крыс после инфаркта миокарда встречаютсяредко2. Исследователи вынуждены сосредоточиться на косвенных вторичных изменениях, которые могут отражать проаритмический субстрат, такой как фиброз или экспрессия генов, не показывая значимых изменений в бремени аритмии или проаритмических тенденциях. Для преодоления этого ограничения в настоящем протоколе описан метод, позволяющий достоверно оценить восприимчивость мышечных и крысиных сердец к желудочковым тахиаритмиям после генетической модификации 6,7 или инфаркта миокарда2. Этот метод сочетает в себе стимуляцию адренергических рецепторов с запрограммированной электрической стимуляцией для индуцирования желудочковых тахиаритмий в изолированных, перфузированных Лангендорфом8 мышечных и крысиных сердцах.

Стандартные подходы к переносу вирусных генов в ткани миокарда грызунов часто включают облучение сердца методом торакотомии 9,10,11, которая является инвазивной процедурой и связана с задержкой восстановления животных после процедуры. В данной статье описан метод прямой интрамиокардиальной инъекции вируса под руководством ультразвуковой визуализации для гиперэкспрессии трансгенов. Эта менее инвазивная процедура позволяет быстрее восстанавливаться животным после вирусной инъекции и меньше травмировать ткани, по сравнению с торакотомией, уменьшает послеоперационную боль и воспаление у животного и, таким образом, позволяет лучше оценить влияние трансгенных генов на функцию сердца.

протокол

Все описанные методы и процедуры были одобрены советом по этическому обзору исследований на животных в Университете Оттавы и комитетом по обзору биобезопасности в Институте сердца Университета Оттавы. Разработанные протоколы безопасности включают в себя то, что все процедуры, связанные с рекомбинантным аденовирусом или аденоассоциированным вирусом (AAV), выполнялись в кабинете биобезопасности уровня II. Все предметы, контактирующие с вирусом, были тщательно обеззаражены после эксперимента. Для настоящего исследования использовались мыши Ctnnb1flox/flox и αMHC-MerCreMer (8-12 недель, любого пола) и крысы Sprague-Dawley (200-250 г, самцы). Животные были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). Все процедуры, касающиеся животных, были выполнены персоналом, который был обучен и одобрен институциональными регулирующими комитетами. Во время всех процедур использовались соответствующие средства индивидуальной защиты.

1. Экспрессия вирусных трансгенов в желудочковых тканях грызунов

ПРИМЕЧАНИЕ: Храните рекомбинантный аденовирус или AAV, экспрессирующий ген-мишень и соответствующий контрольный вирус, такой как Ad-GFP (титр 1 x 1010 PFU/мл) или AAV9-GFP (титр 1 x 1013 GC/mL) (см. Таблицу материалов), в морозильной камере с температурой −80 °C.

  1. В день инъекции вируса разморозьте вирус на льду. Аспирировать вирус, экспрессирующий ген-мишень и контрольный вирус, в два отдельных шприца (объем = 50 мкл) с 30 г 1/2 игл и держать на льду до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые пузырьки в шприце и игле должны быть аккуратно удалены.
  2. Вводят бупренорфин крысам или мышам (0,05 мг/кг для крыс, 0,1 мг/кг для мышей, подкожно), через 1 ч индуцируют анестезию с использованием 3% изофлурана и поддерживают изофлуран на уровне 2% (в 100% кислорода при скорости потока 0,5-1,0 л/мин) для последующей процедуры.
  3. Осторожно ущипните тело животного (например, хвост) парой щипцов, и если животное не реагирует на ущемление какими-либо движениями тела, правильное обезболивание подтверждается.
  4. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C с помощью электрической грелки. Сбрить волосы в области груди с помощью машинки для стрижки волос.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при использовании электрической грелки из-за потенциального неравномерного распределения тепла.
  5. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы.
  6. Держите животное в лежачем положении и используйте доклиническую систему визуализации (см. Таблицу материалов) для ультразвуковой визуализации сердца животного в короткоосевой ориентации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы выполняются в шкафу биобезопасности уровня II, который обеспечивает стерильную среду. Применяются стандартные процедуры безопасности, в том числе с безопасным обращением с иглами.
  7. Стерилизуйте левую нижнюю часть грудной клетки животного чередующимися раундами скраба на основе йода или хлоргексидина и спирта три раза круговыми движениями.
  8. Под руководством ультразвуковой визуализации вставьте иглу 30 г 1/2 шприца, содержащего вирус, как это было подготовлено на этапе 1.1. в грудь животного через левую нижнюю часть груди тела.
  9. Подойдите кончиком иглы к левой передней свободной стенке желудочка и медленно введите 10-15 мкл вируса. Убедитесь в успешной инъекции в ультразвуковых изображениях по усиленной яркости возле кончика иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество вируса, вводимого в каждый участок, составляет не более 15 мкл для предотвращения физического повреждения тканей миокарда.
  10. Извлеките иглу из сердца и вставьте ее в другие области левого желудочка для второй и третьей инъекции того же количества вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество мест инъекций определяется экспериментальным проектом. Если требуется фокальная трансгенная экспрессия, необходима только одна инъекция; если требуется более диффузионная трансгенная экспрессия, обычно требуется несколько мест инъекции (от трех до пяти).
  11. После завершения инъекций верните животное в клетку.
  12. Внимательно следите за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание, чтобы сохранить стернальное лежание и вернуть его в свою комнату.
  13. Вводят бупренорфин HCl (0,1 мг/кг, два раза в день для мышей, 0,05 мг/кг, два раза в день для крыс, подкожно) животному в течение следующих 2 дней. Верните животных в виварий и ежедневно следите за любыми необычными признаками боли или дистресса, и, если они обнаружены, лечите животных в соответствии с протоколами институционального комитета по уходу за животными.

2. Оценка восприимчивости к сердечной аритмии

ПРИМЕЧАНИЕ: Через 4-6 дней после инъекции аденовируса и через 1-2 недели после инъекции AAV оцените восприимчивость сердца животных к сердечным аритмиям, следуя шагам 2.1.-2.2.

  1. Выполняют перфузию Лангендорфа сердца крысы или мыши.
    1. Готовят раствор Тирода, добавляя в 1 л воды следующее: NaCl, 7,9 г (конечная = 135 мМ); KCl, 0,37 г (5,0 мМ); CaCl2, 0,27 г (1,8 мМ); MgCl2 - 0,24 г (1,2 мМ); HEPES, 2,38 г (10 мМ); и глюкозы , 1,8 г (10 мМ). Отрегулируйте pH до 7,40 с NaOH (см. Таблицу материалов).
    2. Фильтруйте раствор фильтром 0,2 мкм и пузырьком со 100% O2 непрерывно на этапах 2.1.6.-2.2.8.
    3. Вводят гепарин крысе или мыши (500 Ед/кг, внутрибрюшинная инъекция) и через 10 мин обезболивают животное 3% изофлураном. Обеспечьте адекватную анестезию с помощью мягкого защемления тела.
    4. С помощью скальпеля сделать вертикальный разрез 1-1,5 см по средней ключичной линии для левой торакотомии и обнажить сердце.
    5. Соберите сердце, разрезав ножницами на уровне дуги аорты, и сразу же поместите сердце в ледяной раствор Тирода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдается осторожность, чтобы не повредить сердце во время сбора сердца.
    6. Каннулировать аорту сердца тупой иглой (18 г для крыс; 23 г для мышей), подключенной к модифицированной перфузионной системе Лангендорфа (см. Таблицу материалов) в режиме постоянного расхода. Отрегулируйте расход, чтобы поддерживать давление перфузии на уровне 70-80 мм рт.ст.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любые пузырьки в перфузионной игле должны быть удалены до канюляции аорты. Использование рассекающего микроскопа облегчает канюляцию.
    7. Поместите канюлированное сердце в силиконовую пластиковую тарелку с покрытием эластомерами9, 10 см левой желудочкой вверх и перфузируйте сердце 9,12 раствором Тирода O2 при 37 °C.
    8. Проверьте правильность канюляции аорты в начале перфузии, наблюдая за вымыванием крови из сердца в течение первых двух-трех сердечных сокращений и изменением цвета сердца с красного на бледный.
    9. Поместите электроды системы ЭКГ маленького животного (см. Таблицу материалов) вокруг сердца, вставив их в силиконовое эластомерное покрытие в чашке (рисунок 1). Запись ЭКГ с помощью совместимого программного обеспечения.
  2. Выполняйте стимуляцию адренергических рецепторов и запрограммированную электрическую стимуляцию, чтобы вызвать желудочковые тахиаритмии.
    1. После успешной канюляции аорты продолжайте перфузить сердце раствором Тирода в течение 20 мин для стабилизации сердечного препарата.
    2. Добавьте 1 мкМ изопротеренола (см. Таблицу материалов) в раствор тирода, используемый для перфузии сердца на этапах 2.2.3.-2.2.8.
    3. После 10 мин перфузии изопротеренола стимулируют сердце на вершине двумя платиновыми электродами, подключенными к электростимулятору (см. Таблицу материалов).
    4. Начните с процедуры стимуляции (рисунок 2), которая включает в себя 10 последовательных стимулов (интервалы S1, 5 В, 100 мс), за которыми следует дополнительный стимул (S2) с начальным интервалом 80 мс. Многократно уменьшайте интервал S2 на 2 мс каждый раз, пока сердцебиение больше не может быть захвачено (т. Е. Достигнув эффективного рефрактерного периода сердца, ERP)13.
    5. Контролировать любые индуцированные желудочковые тахиаритмии (включая желудочковую тахикардию и фибрилляцию) с помощью ЭКГ.
    6. Если аритмии не вызваны вышеуказанной процедурой, добавьте еще один дополнительный стимул (S3) после S2 с теми же начальными (80 мс) и декрементными (на 2 мс) интервалами до тех пор, пока не будет достигнут ERP.
    7. Если желудочковые тахиаритмии все еще не индуцированы, добавьте еще один дополнительный стимул (S4) после S3 с теми же начальными и декрементными интервалами до тех пор, пока не будет достигнут ERP.
    8. Если желудочковые тахиаритмии все еще не вызваны (как ожидается в контроле здоровых сердец), прекратите протокол электрической стимуляции и считайте сердце неиндуцируемым.

Результаты

При перфузии в соответствии с протоколом, описанным здесь (рисунок 1), изолированное сердце крысы или мыши бьется ритмично и стабильно в течение не менее 4 ч. Если экспериментальная конструкция требует более длительного периода перфузии сердца, полезно добавить альбумин...

Обсуждение

Несколько шагов имеют решающее значение для успеха перфузионного, изолированного сердечного препарата Лангендорфа. Во-первых, важно избегать любого повреждения сердца во время сбора сердца (например, из-за случайного сдавливания или разрезания ножницами). Во-вторых, очень важно как мо...

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами проекта Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) (PJT-148918 и PJT-180533, для WL), премией CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, для WL), стипендией Макдональда Фонда сердца и инсульта Канады (HSFC) и премией Нового исследователя (S-17-LI-0866, для WL), студенческими стипендиями (для JW и YX) и постдокторской стипендией (для AL) от Фондов кардиологического фонда Университета Оттавы в Институте сердца. Авторы благодарят г-на Ричарда Сеймура за его техническую поддержку. Рисунок 2 был создан с Biorender.com с утвержденными лицензиями.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
30 G 1/2 PrecisionGlide NeedleBecton Dickinson (BD)305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)Vector Biolabs7007
adenovirus (Ad-GFP)Vector Biolabs1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)Vector BiolabsADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)Microzone CorporationN/AModel #: BK-2-4
BuprenorphineVetergesicDIN 02342510
Calcium ChlorideSigma-Aldrich102378
D-GlucoseFisher ChemicalD16-1
Hair clipperWAHL Clipper Corporation78001
Hamilton syringeSigma-Aldrich20701705 LT, volume 50 μL
Heating padLife BrandE12107
HeparinFresenius KabiDIN 02264315
HEPESSigma-AldrichH4034
IsofluraneFresenius Kabi Ltd.M60303
Isoproterenol hydrochlorideSigma-Aldrich1351005
LabChart 8 softwareADInstruments Inc.Version 8.1.5for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)Jackson Labs4152
Mice (αMHC-MerCreMer)Jackson Labs5650
MicroscopeLeicaS9ifor Langendorff system
MS400 transducerVisualSonic Inc.N/A
Ophthalmic ointmentSystaneDIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541
Pressure meterNETECHDigiMano 1000for Langendorff system
PumpCole-ParmerUZ-77924-65for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)Charles River400
Scalpel bladesFine Science Tools10010-00
Scalpel handleFine Science Tools10007-12
Silicone elastomerDown Inc.Sylgard 184for Langendorff system
Small animal ECG systemADInstruments Inc.N/APowerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653
Sodium HydroxideSigma-Aldrich567530
StimulatorIonOptixMyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging SystemVisualSonic Inc.N/A

Ссылки

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
  2. Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
  3. Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
  4. Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
  5. Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
  6. Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
  7. Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
  8. Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
  9. Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
  10. Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
  11. Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
  12. Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
  13. Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
  14. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
  15. Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
  16. Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
  17. Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
  18. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  19. Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
  20. Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
  21. Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
  22. McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
  23. Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
  24. Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены