Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

Resumo

O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.

Resumo

A doença cardíaca é a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Devido à facilidade de manuseio e abundância de cepas transgênicas, os roedores tornaram-se modelos essenciais para a pesquisa cardiovascular. No entanto, arritmias cardíacas letais espontâneas que muitas vezes causam mortalidade em pacientes com doença cardíaca são raras em modelos de roedores de doença cardíaca. Isto é principalmente devido às diferenças de espécies nas propriedades elétricas cardíacas entre humanos e roedores e representa um desafio para o estudo de arritmias cardíacas usando roedores. Este protocolo descreve uma abordagem para permitir a expressão transgênica eficiente no miocárdio ventricular de camundongos e ratos usando injeções intramusculares guiadas por ecocardiografia de vírus recombinante (adenovírus e vírus adenoassociado). Este trabalho também descreve um método para permitir uma avaliação confiável da suscetibilidade cardíaca a arritmias usando corações isolados de camundongos e ratos perfundidos por Langendorff com estímulos elétricos adrenérgicos e programados. Essas técnicas são fundamentais para o estudo de distúrbios do ritmo cardíaco associados ao remodelamento cardíaco adverso após lesões, como o infarto do miocárdio.

Introdução

A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo, ceifando a vida de 18 milhões de pessoas apenas em 2017¹. Roedores, especialmente camundongos e ratos, tornaram-se o modelo mais comumente usado em pesquisas cardiovasculares devido à facilidade de manuseio e à disponibilidade de várias linhas de superexpressão ou knockout transgênicas. Modelos de roedores têm sido fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença e para a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos no infarto do miocárdio², hipertensão^{arterial 3}, insuficiência cardíaca⁴ e aterosclerose⁵. No entanto, o uso de roedores em estudos de arritmias cardíacas é limitado pelo seu pequeno tamanho cardíaco e frequência cardíaca mais rápida em comparação com modelos humanos ou animais de grande porte. Portanto, arritmias letais espontâneas em camundongos ou ratos após infarto do miocárdio são raras². Os pesquisadores são forçados a se concentrar em alterações secundárias indiretas que possam refletir um substrato pró-arrítmico, como fibrose ou expressão gênica, sem mostrar mudanças significativas na carga de arritmia ou tendências pró-arrítmicas. Para superar essa limitação, um método que permite uma avaliação confiável da suscetibilidade de corações de camundongos e ratos a taquiarritmias ventriculares após modificação genética ^6,7 ou infarto do miocárdio² é descrito no presente protocolo. Este método combina a estimulação do receptor adrenérgico com a estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares em⁸ corações isolados, perfundidos por Langendorff e camundongos.

As abordagens padrão para a transferência de genes virais no tecido miocárdico de roedores geralmente envolvem a exposição do coração por toracotomia ^9,10,11, que é um procedimento invasivo e está associado ao atraso na recuperação dos animais após o procedimento. Este artigo descreve um método de injeção intramiocárdica direta de vírus sob orientação por ultrassonografia para a superexpressão de transgenes. Este procedimento menos invasivo permite uma recuperação animal mais rápida após a injeção viral e menos lesão tecidual, em comparação com a toracotomia, reduz a dor pós-operatória e a inflamação no animal e, assim, permite uma melhor avaliação dos efeitos dos genes transgênicos na função cardíaca.

Protocolo

Todos os métodos e procedimentos descritos foram aprovados pelo conselho de revisão ética de pesquisa animal da Universidade de Ottawa e pelo comitê de revisão de biossegurança do Instituto do Coração da Universidade de Ottawa. Os protocolos de segurança desenvolvidos incluem que todos os procedimentos que lidam com adenovírus recombinante ou vírus adenoassociado (AAV) foram realizados em um gabinete de biossegurança de nível II. Todos os itens em contato com o vírus foram completamente descontaminados após o experimento. Para o presente estudo, foram utilizados camundongos Ctnnb1 flox^/flox e αMHC-MerCreMer (8-12 semanas de idade, de ambos os sexos) e ratos Sprague-Dawley (200-250g, macho). Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados por pessoal treinado e aprovado por comités institucionais de regulamentação. Foram utilizados equipamentos de proteção individual adequados durante todos os procedimentos.

1. Expressão transgênica viral em tecidos ventriculares de roedores

NOTA: Armazenar adenovírus recombinante ou AAV que expresse o gene alvo e o vírus de controle correspondente, como Ad-GFP (título de 1 x 10 10 PFU/mL) ou AAV9-GFP (título de 1 x 10¹³ GC/mL) (ver Tabela de Materiais), em um freezer de -⁸⁰ °C.

1. No dia da injeção do vírus, descongele o vírus no gelo. Aspirar o vírus que expressa o gene alvo e o vírus de controlo em duas seringas separadas (volume = 50 μL) com 30 G 1/2 agulhas e manter no gelo até à sua utilização.
   NOTA: Quaisquer bolhas na seringa e na agulha devem ser cuidadosamente removidas.
2. Administrar buprenorfina a ratos ou camundongos (0,05 mg/kg para ratos, 0,1 mg/kg para camundongos subcutâneos), 1 h depois induzir anestesia com isoflurano a 3% e manter o isoflurano a 2% (em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5-1,0 L/min) para o procedimento subsequente.
3. Aperte suavemente o corpo do animal (por exemplo, a cauda) com um par de pinças e, se o animal não responder ao beliscão com nenhum movimento do corpo, a anestesia adequada é confirmada.
4. Mantenha a temperatura corporal a 37 °C usando uma almofada de aquecimento elétrica. Raspe o cabelo na região do peito usando um cortador de cabelo.
   NOTA: Deve-se ter cuidado ao usar uma almofada de aquecimento elétrico devido à potencial distribuição de calor desigual.
5. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
6. Mantenha o animal em decúbito dorsal e utilize um sistema de imagiologia pré-clínica (ver Tabela de Materiais) para a realização de imagens de ecografia do coração do animal na orientação de eixo curto.
   NOTA: As etapas a seguir são executadas em um gabinete de biossegurança de nível II que fornece um ambiente estéril. Procedimentos de segurança padrão, incluindo aqueles com manuseio seguro de agulhas, são empregados.
7. Esterilizar a região inferior esquerda do tórax do animal com rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool três vezes em um movimento circular.
8. Sob orientação de imagem de ultrassom, insira a agulha 30 G 1/2 da seringa que contém o vírus, conforme preparado na etapa 1.1. no peito do animal através do lado inferior esquerdo do peito do corpo.
9. Aproxime-se da ponta da agulha na parede livre frontal do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10-15 μL do vírus. Verifique se a injeção bem-sucedida em imagens de ultrassom pelo brilho aprimorado perto da ponta da agulha.
   NOTA: A quantidade de vírus injetada em cada local não é superior a 15 μL para evitar danos físicos aos tecidos miocárdicos.
10. Retire a agulha do coração e insira-a em outras regiões do ventrículo esquerdo para uma segunda e terceira injeção da mesma quantidade de vírus.
    NOTA: O número total de locais de injeção é determinado pelo desenho experimental. Se for necessária expressão transgênica focal, apenas uma injeção é necessária; se for necessária uma expressão transgénica mais difusiva, são geralmente necessários múltiplos locais de injeção (três a cinco).
11. Após a conclusão das injeções, devolva o animal à sua gaiola.
12. Monitore cuidadosamente o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e devolvê-lo à sua sala de alojamento.
13. Administrar buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, duas vezes por dia para ratinhos, 0,05 mg/kg, duas vezes por dia para ratos, subcutâneo) ao animal durante os 2 dias seguintes. Devolva os animais ao biotério e monitore diariamente quaisquer sinais incomuns de dor ou angústia e, se encontrados, trate os animais de acordo com os protocolos do comitê institucional de cuidados com os animais.

2. Avaliação da suscetibilidade à arritmia cardíaca

NOTA: Em 4-6 dias após a injeção de adenovírus e 1-2 semanas após a injeção de AAV, avalie a suscetibilidade dos corações dos animais a arritmias cardíacas seguindo os passos 2.1.-2.2.

1. Realizar perfusão Langendorff do coração de rato ou rato.
   1. Preparar a solução de Tyrode adicionando o seguinte a 1 L de água: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl₂, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (_1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); e glicose, 1,8 g (10 mM). Ajuste o pH para 7,40 com NaOH (ver Tabela de Materiais).
   2. Filtrar a solução com um filtro de 0,2 μm e borbulhar com 100% de O 2 continuamente durante os passos 2.1.6.-_2.2.8 .
   3. Administrar heparina no rato ou rato (500 U/kg, injeção intraperitoneal) e 10 minutos depois anestesiar o animal com isoflurano a 3%. Garanta a anestesia adequada com uma pitada suave no corpo.
   4. Use um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1-1,5 cm na linha clavicular média para uma toracotomia esquerda e expor o coração.
   5. Colete o coração cortando com uma tesoura no nível do arco aórtico e coloque imediatamente o coração em solução gelada de Tyrode.
      NOTA: Recomenda-se cautela para não danificar o coração durante a coleta do coração.
   6. Canular a aorta do coração com uma agulha contundente (18 G para ratos; 23 G para camundongos) conectada a um sistema de perfusão Langendorff modificado (ver Tabela de Materiais) no modo de fluxo constante. Ajuste a taxa de fluxo para manter a pressão de perfusão em 70-80 mmHg.
      NOTA: Quaisquer bolhas na agulha de perfusão devem ser removidas antes da canulação aórtica. O uso de um microscópio de dissecação facilita a canulação.
   7. Colocar o coração canulado num prato de plástico de 9,10 cm revestido de elastómero de silicone com o ventrículo esquerdo virado para cima e perfundir o coração ^9,12 com uma solução de Tyrode de ₂ bolhas A 37 °C.
   8. Verifique a canulação aórtica correta no início da perfusão, observando a lavagem do sangue do coração durante os primeiros dois a três batimentos cardíacos e a mudança da cor do coração de vermelho para pálido.
   9. Coloque os eletrodos de um sistema de ECG de animais de pequeno porte (ver Tabela de Materiais) ao redor do coração, inserindo-os no revestimento de elastômero de silicone no prato (Figura 1). Grave o ECG usando software compatível.
2. Realizar estimulação do receptor adrenérgico e estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares.
   1. Após a canulação aórtica bem-sucedida, continue a perfundir o coração com solução de Tyrode por 20 minutos para estabilizar a preparação do coração.
   2. Adicionar 1 μM de isoproterenol (ver Tabela de Materiais) à solução de Tyrode utilizada para perfusão cardíaca nos passos 2.2.3.-2.2.8.
   3. Após 10 min de perfusão de isoproterenol, estimular o coração no ápice com dois eletrodos de platina conectados a um estimulador elétrico (ver Tabela de Materiais).
   4. Comece com o procedimento de estimulação (Figura 2), que inclui 10 estímulos consecutivos (intervalos S1, 5 V, 100 ms) que são seguidos por um estímulo extra (S2) com intervalo inicial de 80 ms. Reduza repetidamente o intervalo S2 em 2 ms de cada vez até que o batimento cardíaco não possa mais ser capturado (ou seja, atingindo o período refratário efetivo do coração, ERP)¹³.
   5. Monitore quaisquer taquiarritmias ventriculares induzidas (incluindo taquicardia ventricular e fibrilação) por ECG.
   6. Se nenhuma arritmia for induzida pelo procedimento acima, adicione outro estímulo extra (S3) após S2 com os mesmos intervalos iniciais (80 ms) e decréscimo (por 2 ms) até que o ERP seja atingido.
   7. Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas, adicione mais um estímulo extra (S4) após S3 com os mesmos intervalos inicial e de decréscimo até que o ERP seja atingido.
   8. Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas (como esperado no controle de corações saudáveis), interrompa o protocolo de estimulação elétrica e considere o coração não induzível.

Resultados

Quando perfundido seguindo o protocolo descrito aqui (Figura 1), um coração isolado de rato ou rato bate rítmica e de forma estável por pelo menos 4 h. Se o delineamento experimental requer um período mais longo de perfusão cardíaca, é útil adicionar albumina à solução de perfusão para reduzir a ocorrência de edema miocárdico após perfusão de longa duração¹⁴. A inclusão de isoproterenol na solução de perfusão imita a ativação do sistema nervos...

Discussão

Várias etapas são críticas para o sucesso da preparação cardíaca isolada e perfundida por Langendorff. Em primeiro lugar, é importante evitar qualquer dano ao coração durante a coleta do coração (por exemplo, devido a espremer ou cortar acidentalmente com a tesoura). Em segundo lugar, é fundamental colocar o coração coletado em solução de Tyrode frio o mais rápido possível, porque isso interromperá os batimentos cardíacos e reduzirá o consumo de oxigênio do coração. Em terceiro lugar, a inserção...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson (BD)	305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)	Vector Biolabs	7007
adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)	Vector Biolabs	ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)	Microzone Corporation	N/A	Model #: BK-2-4
Buprenorphine	Vetergesic	DIN 02342510
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	102378
D-Glucose	Fisher Chemical	D16-1
Hair clipper	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volume 50 μL
Heating pad	Life Brand	E12107
Heparin	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Isoflurane	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 software	ADInstruments Inc.	Version 8.1.5	for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mice (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Microscope	Leica	S9i	for Langendorff system
MS400 transducer	VisualSonic Inc.	N/A
Ophthalmic ointment	Systane	DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Pressure meter	NETECH	DigiMano 1000	for Langendorff system
Pump	Cole-Parmer	UZ-77924-65	for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)	Charles River	400
Scalpel blades	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10007-12
Silicone elastomer	Down Inc.	Sylgard 184	for Langendorff system
Small animal ECG system	ADInstruments Inc.	N/A	Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	567530
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System	VisualSonic Inc.	N/A