Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.

Zusammenfassung

Herzerkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität. Aufgrund der einfachen Handhabung und des Reichtums an transgenen Stämmen sind Nagetiere zu unverzichtbaren Modellen für die kardiovaskuläre Forschung geworden. Spontane letale Herzrhythmusstörungen, die bei Patienten mit Herzerkrankungen häufig zum Tod führen, sind jedoch in Nagetiermodellen für Herzerkrankungen selten. Dies ist in erster Linie auf die Unterschiede in den elektrischen Eigenschaften des Herzens zwischen Menschen und Nagetieren zurückzuführen und stellt eine Herausforderung für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen an Nagetieren dar. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um eine effiziente Transgenexpression im ventrikulären Myokard von Maus und Ratte unter Verwendung von echokardiografischen intramuskulären Injektionen von rekombinantem Virus (Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus) zu ermöglichen. Diese Arbeit skizziert auch eine Methode, die eine zuverlässige Beurteilung der kardialen Anfälligkeit für Arrhythmien unter Verwendung isolierter, Langendorff-perfundierter Maus- und Rattenherzen mit sowohl adrenergen als auch programmierten elektrischen Stimulationen ermöglicht. Diese Techniken sind entscheidend für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen, die mit einem nachteiligen kardialen Umbau nach Verletzungen wie Myokardinfarkt verbunden sind.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache und kosteten^{allein im} Jahr 2017 18 Millionen Menschen das Leben1. Nagetiere, insbesondere Mäuse und Ratten, sind aufgrund der einfachen Handhabung und der Verfügbarkeit verschiedener transgener Überexpressions- oder Knockout-Linien zum am häufigsten verwendeten Modell in der kardiovaskulären Forschung geworden. Nagetiermodelle waren von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und für die Identifizierung potenzieller neuer therapeutischer Ziele bei Myokardinfarkt², Bluthochdruck³, Herzinsuffizienz⁴ und Atherosklerose⁵. Die Verwendung von Nagetieren in Studien zu Herzrhythmusstörungen ist jedoch durch ihre geringe Herzgröße und schnellere Herzfrequenz im Vergleich zu menschlichen oder großen Tiermodellen begrenzt. Daher sind spontane letale Arrhythmien bei Mäusen oder Ratten nach Myokardinfarkt selten². Die Forscher sind gezwungen, sich auf indirekte sekundäre Veränderungen zu konzentrieren, die ein pro-arrhythmisches Substrat wie Fibrose oder Genexpression widerspiegeln könnten, ohne signifikante Veränderungen der Arrhythmiebelastung oder pro-arrhythmischer Tendenzen zu zeigen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird im vorliegenden Protokoll eine Methode beschrieben, die eine zuverlässige Beurteilung der Anfälligkeit von Mäuse- und Rattenherzen für ventrikuläre Tachyarrhythmien nach genetischer Veränderung ^6,7 oder Myokardinfarkt² ermöglicht. Diese Methode kombiniert die adrenerge Rezeptorstimulation mit der programmierten elektrischen Stimulation, um ventrikuläre Tachyarrhythmien in isolierten, Langendorff-perfundierten⁸ Maus- und Rattenherzen zu induzieren.

Standardansätze für den viralen Gentransfer in Nagetier-Myokardgewebe beinhalten häufig die Exposition des Herzens durch die Thorakotomie 9,10,11^, die ein invasives Verfahren ist und mit einer verzögerten Genesung der Tiere nach dem Eingriff verbunden ist. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur direkten intramyokardialen Injektion von Viren unter Ultraschallbildgebung zur Überexpression von Transgenen. Dieses weniger invasive Verfahren ermöglicht im Vergleich zur Thorakotomie eine schnellere Genesung der Tiere nach der Virusinjektion und weniger Gewebeverletzungen, reduziert postoperative Schmerzen und Entzündungen beim Tier und ermöglicht somit eine bessere Beurteilung der Auswirkungen transgener Gene auf die Herzfunktion.

Protokoll

Alle beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom Animal Research Ethics Review Board an der University of Ottawa und dem Biosafety Review Committee am University of Ottawa Heart Institute genehmigt. Die entwickelten Sicherheitsprotokolle beinhalten, dass alle Verfahren, die sich mit rekombinantem Adenovirus oder Adeno-assoziiertem Virus (AAV) befassen, in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe II durchgeführt wurden. Alle Gegenstände, die mit dem Virus in Berührung kamen, wurden nach dem Experiment gründlich dekontaminiert. Für die vorliegende Studie wurden Ctnnb1 flox^/flox und αMHC-MerCreMer Mäuse (8-12 Wochen alt, beiderlei Geschlechts) und Sprague-Dawley-Ratten (200-250g, männlich) verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren, die mit Tieren zu tun haben, wurden von Mitarbeitern durchgeführt, die von den institutionellen Regelungsausschüssen geschult und genehmigt wurden. Bei allen Eingriffen wurde eine angemessene persönliche Schutzausrüstung verwendet.

1. Virale Transgenexpression in ventrikulären Geweben von Nagetieren

HINWEIS: Lagern Sie rekombinantes Adenovirus oder AAV, das das Zielgen und das entsprechende Kontrollvirus exprimiert, wie z. B. Ad-GFP (Titer von 1 x 10 10 PFU/ml) oder AAV9-GFP (Titer von 1 x 10¹³ GC/ml) (siehe Materialtabelle), in einem Gefrierschrank von -⁸⁰ °C.

1. Am Tag der Virusinjektion tauen Sie das Virus auf Eis auf. Das Virus, das das Zielgen exprimiert, und das Kontrollvirus werden in zwei separate Spritzen (Volumen = 50 μL) mit 30 G 1/2 Nadeln abgesaugt und bis zur Verwendung auf Eis gehalten.
   HINWEIS: Alle Blasen in der Spritze und Nadel müssen sorgfältig entfernt werden.
2. Verabreichung von Buprenorphin an Ratten oder Mäuse (0,05 mg/kg für Ratten, 0,1 mg/kg für Mäuse, subkutan), 1 h später eine Anästhesie mit 3% Isofluran induzieren und Isofluran bei 2% (in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,5-1,0 l/min) für das nachfolgende Verfahren halten.
3. Kneifen Sie den Körper des Tieres (z. B. den Schwanz) vorsichtig mit einer Pinzette zusammen, und wenn das Tier nicht mit Körperbewegungen auf die Zwicke reagiert, wird eine ordnungsgemäße Anästhesie bestätigt.
4. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem elektrischen Heizkissen auf 37 °C. Rasieren Sie die Haare im Brustbereich mit einer Haarschneidemaschine.
   HINWEIS: Bei der Verwendung eines elektrischen Heizkissens ist Vorsicht geboten, da die Wärmeverteilung ungleichmäßig sein kann.
5. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
6. Halten Sie das Tier in Rückenlage und verwenden Sie ein präklinisches Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) für die Ultraschallbildgebung des Herzens des Tieres in der Kurzachsenausrichtung.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe II durchgeführt, die eine sterile Umgebung bietet. Es werden Standard-Sicherheitsverfahren, einschließlich solcher mit sicherer Nadelhandhabung, angewendet.
7. Sterilisieren Sie den linken unteren Brustbereich des Tieres mit abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis und Alkohol dreimal in kreisenden Bewegungen.
8. Führen Sie unter Anleitung der Ultraschallbildgebung die 30 g 1/2 Nadel der Spritze mit dem Virus ein, wie in Schritt 1.1 hergestellt. über die linke untere Brustseite des Körpers in die Brust des Tieres.
9. Nähern Sie sich der Nadelspitze in die linksventrikuläre vordere freie Wand und injizieren Sie langsam 10-15 μL des Virus. Überprüfen Sie die erfolgreiche Injektion in Ultraschallbildern durch die erhöhte Helligkeit in der Nähe der Nadelspitze.
   HINWEIS: Die Menge an Virus, die an jeder Stelle injiziert wird, beträgt nicht mehr als 15 μl, um eine physische Schädigung des Myokardgewebes zu verhindern.
10. Ziehen Sie die Nadel aus dem Herzen und führen Sie sie in andere Regionen des linken Ventrikels ein, um eine zweite und dritte Injektion der gleichen Virusmenge zu erhalten.
    ANMERKUNG: Die Gesamtzahl der Injektionsstellen wird durch das Versuchsdesign bestimmt. Wenn eine fokale Transgenexpression erforderlich ist, ist nur eine Injektion erforderlich. Wenn eine diffusivere Transgenexpression erforderlich ist, sind in der Regel mehrere Injektionsstellen (drei bis fünf) erforderlich.
11. Nach Abschluss der Injektionen ist das Tier wieder in seinen Käfig zu bringen.
12. Überwachen Sie das Tier sorgfältig, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brusthöhlenliegen aufrechtzuerhalten, und bringen Sie es in seinen Aufenthaltsraum zurück.
13. Verabreichen Sie dem Tier in den folgenden 2 Tagen Buprenorphin HCl (0,1 mg/kg, zweimal täglich bei Mäusen, 0,05 mg/kg, zweimal täglich bei Ratten, subkutan). Bringen Sie die Tiere in das Vivarium zurück und überwachen Sie sie täglich auf ungewöhnliche Anzeichen von Schmerzen oder Leiden, und wenn sie gefunden werden, behandeln Sie die Tiere gemäß den Protokollen des Institutional Animal Care Committee.

2. Beurteilung der Anfälligkeit für Herzrhythmusstörungen

HINWEIS: 4-6 Tage nach der Adenovirus-Injektion und 1-2 Wochen nach der AAV-Injektion ist die Anfälligkeit der Tierherzen für Herzrhythmusstörungen gemäß den Schritten 2.1.-2.2 zu beurteilen.

1. Führen Sie eine Langendorff-Perfusion des Ratten- oder Mausherzens durch.
   1. Bereiten Sie Tyrode-Lösung vor, indem Sie Folgendes in 1 l Wasser geben: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl₂, 0,27 g (1,8 mM); _MgCl2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); und Glukose, 1,8 g (10 mM). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein (siehe Materialtabelle).
   2. Die Lösung wird in den Schritten 2.1.6.-2.2.8 kontinuierlich mit einem 0,2-μm-Filter filtriert und mit 100%_O2 aufgeblasen.
   3. Verabreichen Sie der Ratte oder Maus Heparin (500 E/kg, intraperitoneale Injektion) und betäuben Sie das Tier 10 Minuten später mit 3% Isofluran. Sorgen Sie für eine ausreichende Anästhesie mit einer sanften Prise auf den Körper.
   4. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen vertikalen Schnitt von 1-1,5 cm in der Mitte des Schlüsselbeins für eine linke Thorakotomie zu machen und das Herz freizulegen.
   5. Sammeln Sie das Herz, indem Sie mit einer Schere auf Höhe des Aortenbogens schneiden und geben Sie das Herz sofort in eiskalte Tyrode-Lösung.
      HINWEIS: Es ist Vorsicht geboten, das Herz während der Herzentnahme nicht zu schädigen.
   6. Die Aorta des Herzens wird mit einer stumpfen Nadel (18 g für Ratten; 23 g für Mäuse) kantiert, die mit einem modifizierten Langendorff-Perfusionssystem (siehe Materialtabelle) im Modus mit konstanter Durchflussrate verbunden ist. Stellen Sie die Durchflussrate ein, um den Perfusionsdruck bei 70-80 mmHg zu halten.
      HINWEIS: Eventuelle Blasen in der Perfusionsnadel müssen vor der Aortenkanüle entfernt werden. Die Verwendung eines Präpariermikroskops erleichtert die Kanülierung.
   7. Das kanülierte Herz wird mit dem linken Ventrikel nach oben in eine^mit Silikonelastomer beschichtete 9,10 cm Kunststoffschale gegeben und das Herz ^9,12 mit ^{O2-Bubbled-Tyrode-Lösung} bei 37 °C durchblutet.
   8. Überprüfen Sie die korrekte Aortenkanülation zu Beginn der Perfusion, indem Sie das Auswaschen von Blut aus dem Herzen während der ersten zwei bis drei Herzschläge und die Veränderung der Herzfarbe von rot zu blass beobachten.
   9. Platzieren Sie die Elektroden eines Kleintier-EKG-Systems (siehe Materialtabelle) um das Herz herum, indem Sie sie in die Silikonelastomerbeschichtung in der Schale einführen (Abbildung 1). Zeichnen Sie das EKG mit einer kompatiblen Software auf.
2. Führen Sie eine adrenerge Rezeptorstimulation und eine programmierte elektrische Stimulation durch, um ventrikuläre Tachyarrhythmien zu induzieren.
   1. Nach erfolgreicher Aortenkanüle wird das Herz 20 Minuten lang mit Tyrode-Lösung durchblutet, um das Herzpräparat zu stabilisieren.
   2. 1 μM Isoproterenol (siehe Materialtabelle) zu der Tyrode-Lösung geben, die in den Schritten 2.2.3.-2.2.8 für die Herzperfusion verwendet wird.
   3. Nach 10 Minuten Isoproterenol-Perfusion stimulieren Sie das Herz an der Spitze mit zwei Platinelektroden, die mit einem elektrischen Stimulator verbunden sind (siehe Materialtabelle).
   4. Beginnen Sie mit dem Stimulationsverfahren (Abbildung 2), das 10 aufeinanderfolgende Stimuli (S1, 5 V, 100 ms-Intervalle) umfasst, denen ein zusätzlicher Stimulus (S2) mit einem Anfangsintervall von 80 ms folgt. Reduzieren Sie das S2-Intervall jedes Mal wiederholt um 2 ms, bis der Herzschlag nicht mehr erfasst werden kann (d. h. die effektive Refraktärperiode des Herzens erreicht wird, ERP)¹³.
   5. Überwachen Sie alle induzierten ventrikulären Tachyarrhythmien (einschließlich ventrikulärer Tachykardie und Flimmern) durch EKG.
   6. Wenn durch das obige Verfahren keine Arrhythmien induziert werden, fügen Sie nach S2 einen weiteren zusätzlichen Stimulus (S3) mit den gleichen Anfangs- (80 ms) und Dekrementintervallen (um 2 ms) hinzu, bis das ERP erreicht ist.
   7. Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden, fügen Sie nach S3 einen weiteren zusätzlichen Stimulus (S4) mit den gleichen Anfangs- und Dekrementintervallen hinzu, bis das ERP erreicht ist.
   8. Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden (wie es bei gesunden Kontrollherzen zu erwarten ist), stoppen Sie das elektrische Stimulationsprotokoll und betrachten Sie das Herz als nicht induzierbar.

Ergebnisse

Bei Perfusion nach dem hier beschriebenen Protokoll (Abbildung 1) schlägt ein isoliertes Ratten- oder Mausherz mindestens 4 Stunden lang rhythmisch und stabil. Wenn das Versuchsdesign eine längere Dauer der Herzdurchblutung erfordert, ist es hilfreich, Albumin in die Perfusionslösung zu geben, um das Auftreten von Myokardödemen nach längerer Perfusion^{zu reduzieren 14}. Die Aufnahme von Isoproterenol in die Perfusionslösung ahmt die Aktivierung des sympathischen N...

Diskussion

Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Langendorff-durchbluteten, isolierten Herzpräparation. Erstens ist es wichtig, eine Schädigung des Herzens während der Herzentnahme zu vermeiden (z.B. durch versehentliches Quetschen oder Schneiden mit der Schere). Zweitens ist es wichtig, das gesammelte Herz so schnell wie möglich in kalte Tyrode-Lösung zu geben, da dies den Herzschlag stoppt und den Sauerstoffverbrauch des Herzens reduziert. Drittens darf das Einführen der Nadel in die Aorta nicht zu tief sei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson (BD)	305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)	Vector Biolabs	7007
adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)	Vector Biolabs	ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)	Microzone Corporation	N/A	Model #: BK-2-4
Buprenorphine	Vetergesic	DIN 02342510
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	102378
D-Glucose	Fisher Chemical	D16-1
Hair clipper	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volume 50 μL
Heating pad	Life Brand	E12107
Heparin	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Isoflurane	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 software	ADInstruments Inc.	Version 8.1.5	for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mice (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Microscope	Leica	S9i	for Langendorff system
MS400 transducer	VisualSonic Inc.	N/A
Ophthalmic ointment	Systane	DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Pressure meter	NETECH	DigiMano 1000	for Langendorff system
Pump	Cole-Parmer	UZ-77924-65	for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)	Charles River	400
Scalpel blades	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10007-12
Silicone elastomer	Down Inc.	Sylgard 184	for Langendorff system
Small animal ECG system	ADInstruments Inc.	N/A	Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	567530
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System	VisualSonic Inc.	N/A