ביטוי טרנסגני נגיפי בלבבות מכרסמים והערכת הסיכון להפרעות קצב לב

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לביטוי טרנסגני בלבבות חולדות ועכברים על ידי הזרקה ישירה של הנגיף בהנחיית אקוקרדיוגרפיה. שיטות להערכת הרגישות של לבבות להפרעות קצב חדריות על ידי גירוי חשמלי מתוכנת של לבבות מבודדים, Langendorff-perfused מוסברים גם כאן.

Abstract

מחלות לב הן הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. בשל קלות הטיפול והשפע של זנים מהונדסים, מכרסמים הפכו למודלים חיוניים למחקר לב וכלי דם. עם זאת, הפרעות קצב לב קטלניות ספונטניות שלעתים קרובות גורמות לתמותה בחולי מחלות לב הן נדירות במודלים של מכרסמים של מחלות לב. הסיבה העיקרית לכך היא ההבדלים בין המינים בתכונות החשמליות של הלב בין בני אדם למכרסמים ומהווה אתגר לחקר הפרעות קצב לב באמצעות מכרסמים. פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת ביטוי טרנסגני יעיל בשריר הלב של עכברים וחולדות באמצעות זריקות תוך-שריריות מונחות אקוקרדיוגרפיה של נגיף רקומביננטי (אדנו-וירוס ונגיף הקשור לאדנו). עבודה זו גם מתווה שיטה המאפשרת הערכה אמינה של רגישות הלב להפרעות קצב באמצעות עכברים ולבבות עכברים וחולדות מבודדים, לנגנדורף, עם גירויים חשמליים אדרנרגיים ומתוכנתים. טכניקות אלה הן קריטיות לחקר הפרעות בקצב הלב הקשורות לשיפוץ לב שלילי לאחר פציעות, כגון אוטם שריר הלב.

Introduction

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, וגבו את חייהם של 18 מיליון אנשים בשנת 2017 לבדה¹. מכרסמים, במיוחד עכברים וחולדות, הפכו למודל הנפוץ ביותר במחקר קרדיווסקולרי בשל קלות הטיפול והזמינות של ביטויי יתר מהונדסים שונים או קווי נוקאאוט. מודלים של מכרסמים היו בסיסיים להבנת מנגנוני המחלה ולזיהוי מטרות טיפוליות חדשות פוטנציאליות באוטם שריר הלב², יתר לחץ דם³, אי ספיקת לב⁴ וטרשת עורקים⁵. עם זאת, השימוש במכרסמים במחקרים על הפרעות קצב לב מוגבל על ידי גודל הלב הקטן שלהם וקצב הלב המהיר יותר בהשוואה למודלים אנושיים או בעלי חיים גדולים. לכן, הפרעות קצב קטלניות ספונטניות בעכברים או בחולדות לאחר אוטם שריר הלב הן נדירות². החוקרים נאלצים להתמקד בשינויים משניים עקיפים שעשויים לשקף מצע פרו-אריתמי, כגון פיברוזיס או ביטוי גנים, מבלי להראות שינויים משמעותיים בעומס הפרעות קצב או נטיות פרו-קצביות. כדי להתגבר על מגבלה זו, שיטה המאפשרת הערכה אמינה של הרגישות של לבבות עכברים וחולדות לטכיאריתמיות חדריות לאחר שינוי גנטי ^6,7 או אוטם שריר הלב² מתוארת בפרוטוקול הנוכחי. שיטה זו משלבת גירוי קולטן אדרנרגי עם גירוי חשמלי מתוכנת כדי לגרום לטכיאריתמיות חדריות בלבבות עכברים וחולדות^{מבודדים}, מסוג Langendorff-perfused.

גישות סטנדרטיות להעברת גנים נגיפיים ברקמת שריר הלב של מכרסמים כרוכות לעתים קרובות בחשיפת הלב על ידי בית החזה 9,10,11^, שהוא הליך פולשני וקשור להתאוששות מאוחרת של בעלי החיים לאחר ההליך. מאמר זה מתאר שיטה של הזרקה ישירה של וירוס בהזרקה ישירה של הנגיף תחת הדרכת הדמיה אולטרסאונד לביטוי יתר של טרנסגנים. הליך פחות פולשני זה מאפשר התאוששות מהירה יותר של בעלי החיים לאחר הזרקה נגיפית ופחות פגיעה ברקמות, בהשוואה לבית החזה, מפחית כאב ודלקת לאחר הניתוח בבעל החיים, ובכך מאפשר הערכה טובה יותר של ההשפעות של גנים מהונדסים על תפקוד הלב.

Protocol

כל השיטות והנהלים המתוארים אושרו על ידי הוועדה לביקורת אתית של מחקר בבעלי חיים באוניברסיטת אוטווה והוועדה לבדיקת בטיחות ביולוגית במכון הלב של אוניברסיטת אוטווה. פרוטוקולי הבטיחות שפותחו כוללים כי כל ההליכים העוסקים באדנווירוס רקומביננטי או בווירוס הקשור לאדנו (AAV) בוצעו בארון בטיחות ביולוגית ברמה II. כל הפריטים שהיו במגע עם הנגיף פורקו לחלוטין לאחר הניסוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי Ctnnb1 flox^/flox ו-αMHC-MerCreMer (בני 8-12 שבועות, משני המינים) ובחולדות ספראג-דאולי (200-250 גרם, זכר). החיות התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). כל ההליכים העוסקים בבעלי חיים בוצעו על ידי אנשי צוות שהוכשרו ואושרו על ידי ועדות רגולטוריות מוסדיות. ציוד מגן אישי מתאים שימש במהלך כל ההליכים.

1. ביטוי טרנסגנים ויראליים ברקמות חדריות מכרסמים

הערה: אחסן אדנו-וירוס רקומביננטי או AAV המבטא את גן היעד ואת וירוס הבקרה המתאים, כגון Ad-GFP (טיטר של 1 x 10 10 PFU/mL) או AAV9-GFP (טיטר של 1 x 10¹³ GC/mL) (ראה טבלת חומרים), במקפיא של −⁸⁰ מעלות צלזיוס.

1. ביום הזרקת הנגיף, הפשירו את הנגיף על הקרח. שאפו את הנגיף המבטא את גן המטרה ואת נגיף הבקרה לשני מזרקים נפרדים (נפח = 50 μL) עם 30 G 1/2 מחטים ושמרו על קרח עד לשימוש.
   הערה: יש להסיר בזהירות את כל הבועות במזרק ובמחט.
2. מתן בופרנורפין לחולדות או עכברים (0.05 מ"ג/ק"ג לחולדות, 0.1 מ"ג/ק"ג לעכברים, תת-עוריים), שעה אחת לאחר מכן לגרום להרדמה באמצעות 3% איזופלורן, ולשמור על איזופלורן ב-2% (ב-100% חמצן בקצב זרימה של 0.5-1.0 ליטר/דקה) לצורך ההליך הבא.
3. צובטים בעדינות את גוף החיה (למשל, הזנב) עם זוג מלקחיים, ואם החיה אינה מגיבה לצביטה בתנועות גוף כלשהן, מאושר הרדמה נכונה.
4. יש לשמור על טמפרטורת הגוף ב-37°C באמצעות כרית חימום חשמלית. לגלח את השיער באזור החזה באמצעות גוזז שיער.
   הערה: יש להקפיד על שימוש בכרית חימום חשמלית עקב פיזור חום לא אחיד פוטנציאלי.
5. יש למרוח משחה אופטלמית על שתי העיניים כדי למנוע את התייבשות הקרנית.
6. השאירו את בעל החיים במצב שכיבה והשתמשו במערכת הדמיה פרה-קלינית (ראו טבלת חומרים) להדמיית אולטרסאונד של לב החיה בכיוון הציר הקצר.
   הערה: השלבים הבאים מבוצעים בארון בטיחות ביולוגית ברמה II המספק סביבה סטרילית. נהלי בטיחות סטנדרטיים, כולל אלה עם טיפול בטוח במחט, מיושמים.
7. לעקר את אזור החזה התחתון השמאלי של החיה עם סיבובים מתחלפים של קרצוף מבוסס יוד או על בסיס כלורהקסידין ואלכוהול שלוש פעמים בתנועה מעגלית.
8. בהנחיית הדמיית אולטרסאונד, יש להחדיר את המחט 30 G 1/2 של המזרק המכיל את הנגיף כפי שהוכן בשלב 1.1. לתוך החזה של החיה דרך צד החזה התחתון השמאלי של הגוף.
9. מתקרבים לקצה המחט לתוך הקיר החופשי הקדמי של החדר השמאלי ומזריקים באיטיות 10-15 μL של הנגיף. ודא הזרקה מוצלחת בתמונות אולטרסאונד על ידי הבהירות המשופרת ליד קצה המחט.
   הערה: כמות הנגיף המוזרק בכל אתר אינה עולה על 15 μL כדי למנוע נזק פיזי לרקמות שריר הלב.
10. למשוך את המחט מהלב ולהחדיר אותו לאזורים אחרים של החדר השמאלי עבור זריקה שנייה ושלישית של אותה כמות של הנגיף.
    הערה: המספר הכולל של אתרי ההזרקה נקבע על ידי תכנון הניסוי. אם נדרש ביטוי טרנסגני מוקדי, יש צורך בזריקה אחת בלבד; אם נדרש ביטוי טרנסגני מפוזר יותר, יש צורך בדרך כלל באתרי הזרקה מרובים (שלושה עד חמישה).
11. לאחר השלמת הזריקות, להחזיר את החיה לכלוב שלה.
12. עקוב בזהירות אחר החיה עד שהיא חזרה להכרה מספקת כדי לשמור על משענת החזה ולהחזיר אותה לחדר המגורים שלה.
13. יש לתת בופרנורפין הידרוכלוריד (0.1 מ"ג/ק"ג, פעמיים ביום לעכברים, 0.05 מ"ג/ק"ג, פעמיים ביום לחולדות, תת-עוריות) לבעל החיים במשך היומיים הבאים. החזירו בעלי חיים לוויבריום ועקבו מדי יום אחר כל סימן חריג של כאב או מצוקה, ואם נמצאו, טפלו בבעלי חיים בהתאם לפרוטוקולים של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.

2. הערכה של רגישות להפרעות קצב לב

הערה: ב 4-6 ימים לאחר הזרקת אדנווירוס ו 1-2 שבועות לאחר הזרקת AAV, להעריך את הרגישות של לבבות בעלי חיים להפרעות קצב לב בעקבות שלבים 2.1.-2.2.

1. בצע זלוף לנגנדורף של לב החולדה או העכבר.
   1. הכן תמיסת טירודה על ידי הוספת הדברים הבאים ל 1 ליטר מים: NaCl, 7.9 גרם (סופי = 135 mM); KCl, 0.37 גרם (5.0 מ"מ); CaCl₂, 0.27 גרם (1.8 mM); MgCl 2, 0.24 גרם (_1.2 מ"מ); HEPES, 2.38 גרם (10 מ"מ); וגלוקוז, 1.8 גרם (10 מ"מ). התאם את ה-pH ל-7.40 באמצעות NaOH (ראו טבלת חומרים).
   2. סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ובועה עם 100% O 2 ברציפות בשלבים 2.1.6.-2.2.8.
   3. לתת הפרין לחולדה או לעכבר (500 U/kg, הזרקה תוך-צפקית) וכעבור 10 דקות להרדים את החיה עם 3% איזופלורן. הקפידו על הרדמה מספקת עם צביטה עדינה על הגוף.
   4. השתמש באזמל כדי לבצע חתך אנכי של 1-1.5 ס"מ בקו אמצע עצם הבריח לכריתת בית החזה השמאלית ולחשוף את הלב.
   5. לאסוף את הלב על ידי חיתוך עם זוג מספריים ברמת קשת אבי העורקים ומיד לשים את הלב לתוך תמיסת טירוד קר כקרח.
      הערה: יש להיזהר שלא לגרום נזק ללב במהלך איסוף הלב.
   6. ניתן למצות את אבי העורקים של הלב באמצעות מחט קהה (18 גרם לחולדות; 23 גרם לעכברים) המחוברת למערכת פרפוזיה שונה של לנגנדורף (ראו טבלת חומרים) במצב קצב זרימה קבוע. התאם את קצב הזרימה כדי לשמור על לחץ הזלוף על 70-80 מ"מ כספית.
      הערה: יש להסיר את כל הבועות במחט הזלוף לפני ביצוע קנולציה של אבי העורקים. שימוש במיקרוסקופ חיתוך מקל על הצינור.
   7. מניחים את הלב המשומר בצלחת פלסטיק^מצופה סיליקון 9, 10 ס"מ עם החדר השמאלי פונה כלפי מעלה ומחלחלים ללב ^9,12 עם תמיסת טירודה O_2-bubbled ב 37 מעלות צלזיוס.
   8. ודא את cannulation אבי העורקים הנכון בתחילת perfusion על ידי התבוננות שטיפת הדם מהלב במהלך שתיים עד שלוש פעימות הלב הראשונות ואת שינוי צבע הלב מאדום חיוור.
   9. הניחו את האלקטרודות של מערכת א.ק.ג. של בעלי חיים קטנים (ראו טבלת חומרים) סביב הלב על ידי החדרתן לציפוי הסיליקון אלסטומר בצלחת (איור 1). הקלט אק"ג באמצעות תוכנה תואמת.
2. בצע גירוי קולטן אדרנרגי וגירוי חשמלי מתוכנת כדי לגרום לטכיאריתמיות חדריות.
   1. לאחר קנולציה מוצלחת של אבי העורקים, ממשיכים לחדור ללב עם תמיסת טירוד למשך 20 דקות כדי לייצב את הכנת הלב.
   2. הוסף איזופרוטרנול 1 μM (ראה טבלת חומרים) לתמיסת הטירודה המשמשת לזילוף לב בשלבים 2.2.3.-2.2.8.
   3. לאחר 10 דקות של זליגת איזופרוטארנול, עוררו את הלב בנקודת השיא באמצעות שתי אלקטרודות פלטינה המחוברות לממריץ חשמלי (ראו טבלת חומרים).
   4. התחילו עם הליך הגירוי (איור 2), הכולל 10 גירויים עוקבים (מרווחים של S1, 5 V, 100 אלפיות השנייה) שלאחריהם גירוי נוסף (S2) עם מרווח ראשוני של 80 אלפיות השנייה. הפחת שוב ושוב את מרווח S2 ב-2 אלפיות השנייה בכל פעם עד שלא ניתן עוד ללכוד את פעימות הלב (כלומר, להגיע לתקופת העקשנות היעילה של הלב, ERP)¹³.
   5. עקוב אחר כל טכיאריתמיות חדריות המושרות (כולל טכיקרדיה חדרית ופרפור חדרי) על ידי אק"ג.
   6. אם לא מושרות הפרעות קצב על ידי ההליך הנ"ל, הוסף גירוי נוסף נוסף (S3) לאחר S2 עם אותם מרווחים ראשוניים (80 אלפיות השנייה) וגזירה (על ידי 2 אלפיות השנייה) עד להגעה ל- ERP.
   7. אם עדיין לא מושרות טאכיאריתמיות חדריות, הוסיפו עוד גירוי אחד נוסף (S4) לאחר S3 עם אותם מרווחים ראשוניים ומרווחים עד להגעה ל-ERP.
   8. אם עדיין לא מושרות טאכיאריתמיות חדריות (כצפוי בבקרה על לבבות בריאים), הפסיקו את פרוטוקול הגירוי החשמלי וחשבו שהלב אינו ניתן להשראה.

תוצאות

כאשר עוקבים אחר הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1), לב של חולדה או עכבר מבודד פועם בקצב וביציבות במשך 4 שעות לפחות. אם התכנון הניסיוני דורש תקופה ארוכה יותר של זלוף לב, כדאי להוסיף אלבומין לתמיסת הזלוף כדי להפחית את המופע של בצקת שריר הלב לאחר זלוף^{ארוך 14}. הכללת איזופרו...

Discussion

מספר שלבים הם קריטיים להצלחת הכנת הלב המבודד והמבודד של לנגנדורף. ראשית, חשוב להימנע מכל נזק ללב במהלך איסוף הלב (למשל, עקב סחיטה או חיתוך בשוגג עם המספריים). שנית, זה קריטי לשים את הלב שנאסף לתוך פתרון טירוד קר בהקדם האפשרי כי זה יעצור את פעימות הלב ולהפחית את צריכת החמצן של הלב. שלישית, אסור ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson (BD)	305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP)	Vector Biolabs	7007
adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
adenovirus (Ad-Wnt3a)	Vector Biolabs	ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II)	Microzone Corporation	N/A	Model #: BK-2-4
Buprenorphine	Vetergesic	DIN 02342510
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	102378
D-Glucose	Fisher Chemical	D16-1
Hair clipper	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volume 50 μL
Heating pad	Life Brand	E12107
Heparin	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Isoflurane	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 software	ADInstruments Inc.	Version 8.1.5	for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mice (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Microscope	Leica	S9i	for Langendorff system
MS400 transducer	VisualSonic Inc.	N/A
Ophthalmic ointment	Systane	DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Pressure meter	NETECH	DigiMano 1000	for Langendorff system
Pump	Cole-Parmer	UZ-77924-65	for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male)	Charles River	400
Scalpel blades	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10007-12
Silicone elastomer	Down Inc.	Sylgard 184	for Langendorff system
Small animal ECG system	ADInstruments Inc.	N/A	Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	567530
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System	VisualSonic Inc.	N/A