Generación de un modelo reproducible de activación inmune materna a mediados de la gestación utilizando Poly(I: C) para estudiar la susceptibilidad y la resiliencia en la descendencia

Resumen

La infección materna es un factor de riesgo para los trastornos del desarrollo neurológico. Los modelos de ratón de activación inmune materna (MIA) pueden dilucidar el impacto de la infección en el desarrollo y la función del cerebro. Aquí, se proporcionan pautas generales y un procedimiento para producir crías confiablemente resistentes y susceptibles expuestas a MIA.

Resumen

La activación inmune materna (MIA) durante el embarazo está constantemente relacionada con un mayor riesgo de trastornos del desarrollo neurológico y neuropsiquiátricos en la descendencia. Los modelos animales de MIA se utilizan para probar la causalidad, investigar mecanismos y desarrollar diagnósticos y tratamientos para estos trastornos. A pesar de su uso generalizado, muchos modelos MIA sufren de una falta de reproducibilidad y casi todos ignoran dos aspectos importantes de este factor de riesgo: (i) muchos descendientes son resistentes a MIA, y (ii) los descendientes susceptibles pueden exhibir distintas combinaciones de fenotipos. Para aumentar la reproducibilidad y modelar tanto la susceptibilidad como la resistencia a la MIA, la inmunorreactividad basal (BIR) de ratones hembra antes del embarazo se utiliza para predecir qué embarazos darán lugar a una descendencia resistente o descendencia con anomalías moleculares y de comportamiento definidas después de la exposición a la MIA. Aquí, se proporciona un método detallado para inducir MIA a través de la inyección intraperitoneal (i.p.) del poli (I: C) imitador viral de ARN bicatenario (dsRNA) a los 12,5 días de gestación. Este método induce una respuesta inflamatoria aguda en la madre, lo que resulta en perturbaciones en el desarrollo del cerebro en ratones que se asignan a dominios impactados de manera similar en los trastornos psiquiátricos y del neurodesarrollo humano (NDD).

Introducción

La evidencia epidemiológica vincula la infección materna con un mayor riesgo de NDD psiquiátrica, incluida la esquizofrenia (SZ) y el trastorno del espectro autista (TEA)1,2,3,4,5,6,7. El modelo de ratón MIA fue desarrollado para probar la causalidad y el papel mecanicista de MIA en la etiología de estos trastornos, así como para identificar biomarcadores moleculares y desarrollar herramientas diagnósticas y terapéuticas ^4,6. A pesar de la utilidad de este modelo y su creciente popularidad, existe una variabilidad considerable en los protocolos de inducción de MIA dentro del campo, lo que dificulta la comparación de los resultados entre los estudios y la replicación de los hallazgos ^8,9. Además, la mayoría de las iteraciones del modelo no investigan dos aspectos traslacionales importantes de la MIA: (i) muchos descendientes son resistentes a la MIA, y (ii) los descendientes susceptibles pueden exhibir distintas combinaciones de fenotipos⁸.

Para generar un modelo de MIA reproducible, los investigadores deben informar al menos una medida cuantitativa de la magnitud de MIA inducida en presas. Para inducir MIA durante la gestación, nuestro laboratorio realiza inyecciones intraperitoneales (i.p.) del poliinositítico imitador viral de ARN bicatenario: ácido policitidílico [poli(I:C)]. Poly(I:C) induce una cascada inmune similar a los virus de la influenza, ya que es reconocido por el receptor tipo toll 3 (TLR3)¹⁰. Como resultado, poli(I:C) activa la respuesta de fase aguda que resulta en una rápida elevación de citoquinas proinflamatorias 8,11,12. Estudios previos han demostrado que la elevación de citoquinas proinflamatorias, incluyendo la interleucina-6 (IL-6), es necesaria para producir anomalías conductuales y neuropatología en la descendencia como resultado de MIA^11,12,13. Por lo tanto, el nivel de IL-6 en el suero materno recolectado durante su pico a las 2,5 h después de la inyección de poli(I: C) es una medida cuantitativa convincente de MIA que se puede utilizar para comparar los resultados entre laboratorios dentro del campo.

Con el fin de generar un modelo MIA que aborde los elementos traslacionalmente esenciales de resiliencia y susceptibilidad con un solo protocolo de inducción ^8,14, los investigadores pueden combinar enfoques típicos de inducción con la caracterización de la inmunorreactividad basal (BIR) de la madre antes del embarazo⁸. Recientemente, se descubrió que los ratones hembra vírgenes C57BL / 6 muestran una amplia gama de respuestas IL-6 a una exposición a dosis bajas a poli(I: C) antes del embarazo⁸. Es sólo un subconjunto de estas hembras que llegan a producir descendencia susceptible, y sólo a ciertas magnitudes de activación inmune según lo dictado por la combinación de BIR y poli(I:C) dosis⁸. MIA induce fenotipos en un patrón de U invertida; La descendencia muestra las mayores aberraciones conductuales y moleculares cuando las madres son moderadamente inmunorreactivas, y la magnitud de la inflamación materna alcanza, pero no supera, un rango crítico⁸. Aquí, se proporciona un método detallado de cómo crear de manera confiable descendientes resistentes y susceptibles con fenotipos conductuales divergentes como resultado de la inyección gestacional media de poli (I: C).

Protocolo

Todos los protocolos se realizan bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California-Davis (IACUC).

1. Preparación de animales

1. Al adquirir animales, mantenga los siguientes parámetros consistentes para garantizar la máxima reproducibilidad.
   1. Ubicación del proveedor y del proveedor: como se informó anteriormente, los ratones salvajes tipo C57BL / 6J exhiben diferentes respuestas a la misma dosis de poli (I: C) dependiendo del proveedor⁸. Elija un proveedor y una cepa de ratón que muestren una respuesta consistente. Para los experimentos aquí, los ratones C57BL / 6 obtenidos de Charles River exhibieron cambios consistentes en el comportamiento después de la exposición a MIA gestacional media, mientras que los comprados a Taconic muestran una respuesta de mayor magnitud, con algunas diferencias entre los grupos de tratamiento en comparación con los ratones Charles River⁸.
   2. Cepa: Los ratones C57BL / 6J son los más utilizados, pero los ratones BTBR y otras cepas^{muestran respuestas} diferenciales a la MIA 9 gestacional media. Tenga en cuenta estas respuestas diferenciales, ya que mejoran la reproducibilidad del método y pueden ser una variable potencial para contribuir a los resultados diferenciales en la descendencia.
   3. Para garantizar una variabilidad mínima, use solo hembras vírgenes para los estudios de MIA⁸ y anote claramente los detalles en los métodos.
   4. Edad en el momento del embarque y período de aclimatación: los ratones enviados antes de las 7 semanas muestran sistemas endocrinos desregulados¹⁵. Dejar que los animales se aclimaten durante un mínimo de 48 h^16,17. Ordene que los ratones se envíen a las 7 semanas (± 2 días) e inyecte BIR a las 8 semanas (± 2 días).
   5. Edad en el momento del apareamiento: el sistema inmunológico de los animales es dinámico a lo largo de su vida. Tenga cuidado de minimizar la variabilidad manteniendo la edad de apareamiento/inyección lo más consistente posible^18,19,20. Aparearse ratones hembra a las 9 semanas (± 2 días). No use machos mayores de 6 meses de edad para aparearse.

2. Prueba y preparación de lotes de poli(I:C)

1. Prepare poli(I:C) de alto peso molecular como se describe a continuación.
   1. Tubos de microcentrífuga de autoclave de 1,5 mL para almacenamiento. El poli(I:C) resuspendido se puede almacenar a -20 °C, pero los deshielos por congelación repetidos pueden afectar la potencia. Caliente el baño maría a 70 °C.
   2. Usando la técnica estéril, agregue 10 ml de solución salina fisiológica estéril (NaCl 0.9%) al poli(I: C) liofilizado usando una jeringa. Calentar al baño maría a 70 °C durante 15 min para permitir el recocido completo. Retirar y dejar enfriar a temperatura ambiente.
   3. En una campana estéril, agregue 40 ml adicionales de solución salina fisiológica al frasco e invierta varias veces para mezclar. Retire la parte superior del frasco de poli(I:C) o utilice una jeringa para alícuota en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Conservar a -20 °C.
2. Prepare poli(I:C) de peso molecular mixto como se describe a continuación.
   1. Tubos de microcentrífuga de autoclave de 1,5 mL para almacenamiento. El poli(I:C) resuspendido se puede almacenar a -20 °C, pero los deshielos por congelación repetidos pueden afectar la potencia. Ajuste el baño maría a 50 °C.
   2. Usando la técnica estéril, agregue 10 ml de NaCl estéril al 0,9% al poli liofilizado (I: C) y asegure la tapa. Calentar al baño maría a 50 °C durante 25 min para permitir el recocido completo. Retirar y dejar enfriar a temperatura ambiente.
   3. Utilizando la técnica estéril, alícuota en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -20 °C.
3. Administrar poli(I:C) a través de inyecciones intraperitoneales (i.p.) como se describe a continuación.
   1. Pese el ratón para determinar la dosificación exacta. Utilizando una aguja de insulina de 0,5 cc, extraiga poli (I: C) resuspendido. Limpie el ratón y voltee para que el abdomen quede expuesto.
   2. Con la otra mano, inserte la aguja a una profundidad de aproximadamente 0,5 cm entre los dos pezones anteriores en un ángulo de aproximadamente 45°.
   3. Elaborar para determinar que no entre sangre ni orina en la jeringa antes de inyectarla. Si ocurre alguna de las dos, vuelva a colocar la aguja e inténtelo de nuevo. Inyecte lentamente. Si el poli(I:C) burbujea, la inyección probablemente fue subcutánea. Una colocación exitosa de la inyección dará como resultado que no se dibuje nada una vez que se inserte la aguja, y no se gotee una vez que se retire.
4. Pruebe la potencia del lote de poli (I: C) MMW como se describe a continuación⁸.
   1. Obtenga la forma deseada de poli (I: C). Algunos fabricantes permitirán a los investigadores colocar una retención en un lote completo o parcial mientras se prueba la potencia para que se puedan obtener múltiples botellas más tarde simultáneamente. Por lo general, estos pueden almacenarse liofilizados a -20 ° C durante varios años si se evita la congelación-descongelación.
   2. Obtener o criar 30 madres preñadas para su análisis. En E12.5, realizar inyecciones i.p. de 20, 30 y 40 mg/kg en un mínimo de 10 ratones por dosis.
   3. A las 2,5 h después de la inyección, recoger la sangre a través de la hemorragia de la cola. Tenga en cuenta que la sangre periférica y la sangre del tronco pueden diferir en los niveles de citoquinas, así que mantenga el método de recolección consistente dentro de un estudio.
   4. Permita que la sangre se coagule durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12-24 h, centrifugar las muestras de sangre a 3.768 x g a 4 °C durante 8 min. Recoger el suero y almacenar a -80 °C hasta su análisis.
   5. Aísle el suero y mida los niveles de IL-6 a través de ELISA o Luminex. Mantenga las herramientas de medición consistentes ya que existe una variabilidad significativa en la concentración total medida con diferentes modalidades y fabricantes. Determinar la magnitud de la respuesta a IL-6 necesaria para inducir fenotipos utilizando una cohorte piloto.

3. Prueba de inmunorreactividad basal (BIR)

NOTA: La figura 1 muestra el esquema de los pasos. Use un poli (I: C) de peso molecular diferente para la prueba BIR en comparación con la gestacional para reducir la probabilidad de respuestas inmunes adaptativas al compuesto.

1. Ordene que los ratones hembra vírgenes se envíen a las 7 semanas de edad. A su llegada, agrupe y albergue de cuatro a cinco ratones en una jaula y mantenga el grupo alojado hasta que se aparee. Use muesca en la oreja o cualquier otro sistema de identificación.
2. Inyecte a las hembras por vía intraperitoneal 5 mg/kg de poli(I:C) 1 semana después de la llegada. A las 2,5 h después de la inyección, cuando la IL-6 circulante es más alta⁶, recoger la sangre entera de los animales inyectados a través del corte de cola.
3. Permita que la sangre se coagule durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12-24 h, centrifugar las muestras de sangre a 3.768 x g a 4 °C durante 8 min.
4. Recoger un mínimo de 32 μL de suero de cada muestra. Congelar a -80 °C hasta que esté listo para detectar citoquinas. Para medir los niveles de IL-6 de manera más consistente, utilice un ensayo múltiplex como Luminex. Mantenga las herramientas de medición consistentes ya que existe una variabilidad significativa en la concentración total medida con diferentes modalidades y fabricantes.
   1. Para el protocolo de ensayo de Luminex, consulte Bruce et ^al.21.
5. Usando niveles relativos de IL-6, divida a los animales en grupos BIR bajo (cuartil inferior), medio (dos cuartiles medios) y alto (cuartil más alto).

4. Método de sangrado de cola para la recolección de sangre

NOTA: Para evitar el uso de sedantes potencialmente inmunomoduladores, use el método de extracción de sangre para el sangrado de la cola.

1. Para configurarlo, coloque un soporte de soldadura y una copa de sujeción en una superficie en el lado de la mano no dominante. En una placa de Petri de 35 mm, agregue 1-2 ml de aceite comestible de grado alimenticio. Retire la tapa del tapón de sangre rápido y colóquela cerca de la configuración.
2. Coloque algunas capas de toalla de papel en el soporte de soldadura y el primer tubo capilar en un clip, colóquelo cerca de donde se sostendrá la punta de la cola del ratón y manténgalo paralelo a la superficie de la mesa. Tenga una hoja de afeitar a mano.
3. Para recolectar la sangre, realice los siguientes pasos.
   1. En el momento requerido, retire el mouse de la jaula y colóquelo debajo de la copa con la cola saliendo de la muesca en la base. Con una cuchilla de afeitar nueva, recorte el extremo (1-2 mm) de la cola y recoja la primera gota de sangre en el tubo capilar enganchado al soporte de soldadura.
   2. Sumerja los dedos de la mano dominante en el aceite comestible y úselo para apretar desde la base de la cola hasta la punta, guiando la punta de la cola hacia el tubo capilar para recoger las gotas de sangre resultantes. Continúe hasta que se hayan recogido ~200 μL de sangre.
   3. Coloque una pequeña tapa en el extremo cónico del tubo capilar antes de la tapa superior. Si primero se coloca la tapa superior, la muestra se expulsará del extremo cónico del tubo. Coloque el tubo en la cubierta exterior protectora.
   4. Dejar coagular durante la noche a temperatura ambiente. Enfriar una microcentrífuga a 4 °C y reducir la sangre como se indica en el paso 3.3.

Figura 1. La línea de tiempo para probar la inmunorreactividad y el apareamiento de referencia de las hembras vírgenes. Ordene a los ratones que lleguen a las 7 semanas de edad y permita aclimatarse a las instalaciones durante 1 semana. Inyectar a los animales con 5 mg/kg de poli(I:C) y 2,5 h más tarde extraer sangre. Deje que la sangre se coagule durante la noche, luego centrifugar a 3,768 x g, 4 ° C durante 8 min. Recolectar suero y evaluar los niveles relativos de IL-6 a través de ELISA o Multiplex. A las 9 semanas de edad, establezca parejas de apareamiento. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Método basado en el peso para el apareamiento y la inyección gestacional de E12.5

NOTA: La figura 2 muestra el esquema de los pasos. Se pueden usar dos métodos para configurar pares de apareamiento y determinar el punto de tiempo E12.5. El primero, el apareamiento cronometrado, se describe en otra parte²². Los cálculos basados en el peso también se pueden utilizar para evaluar un embarazo E12.5²³. El beneficio de este enfoque es que permite el bloqueo temporal de la edad de la madre en el apareamiento, disminuyendo la variabilidad en la respuesta inmune. Este procedimiento se utiliza aquí.

1. Coloque a los machos en jaulas limpias y permítales aclimatarse durante un mínimo de 2 h. Esto disminuye la probabilidad de agresión femenina ya que los machos ya formarán un olor dominante en la jaula.
2. Establezca parejas reproductoras de macho único y hembra soltera agregando la hembra a la jaula del macho. Antes de colocarla en la jaula, pésela y registre el peso. Agregue un pequeño puñado de semillas de girasol a cada jaula para aumentar la eficiencia del apareamiento.
3. Para determinar el rango de aumento de peso, realice los siguientes pasos.
   1. Obtenga un grupo de prueba de hembras y establezca parejas de apareamiento, registrando el peso en el momento del apareamiento.
   2. Cuando las hembras comiencen a aparecer visiblemente embarazadas, péselas y divídalas en subconjuntos de 8.5 g, 9.5 g, 10.5 g y 11.5 g de peso ganado. Los fetos en E12.5 acaban de comenzar a desarrollar dígitos distintos en sus patas. Utilice la morfología fetal para determinar el aumento de peso promedio para alcanzar E12.5.
4. A los 12 días después del apareamiento, pesar a las hembras y determinar el aumento de peso. En una instalación de prueba, las hembras ganan constantemente 9.5-10.5 g desde el momento del apareamiento hasta E12.5. Inyectar vía i.p. la dosis de poli(I:C) solubilizado determinada en el paso 2.3.2 cuando el aumento de peso de la hembra cae dentro del rango predeterminado.
5. Observe la respuesta a MIA en presas utilizando los siguientes parámetros.
   1. Comportamiento de enfermedad: Recopile puntajes subjetivos en una escala de 1 a 3 para determinar qué tan activas se vuelven las presas en respuesta a ser manipuladas, donde 1 es poco o ningún movimiento en respuesta a ser manejado y 3 es una respuesta normal a la captura y restricción. Los animales con mayores respuestas inmunes mostrarán menos resistencia a la manipulación⁸.
   2. Respuesta febril: Usando un termómetro IR, recoja las temperaturas previas a la inyección y 2,5 h después de la inyección. Los animales con respuestas inmunes de mayor magnitud a menudo muestran hipotermia en respuesta a una mayor actividad inmune⁸.
   3. Cambio de peso: Pesar los animales a las 24 h después de la inyección. Los animales con respuestas inmunes de mayor magnitud generalmente pierden más peso⁸.
   4. Mida los niveles gestacionales de IL-6 de la siguiente manera⁸.
      1. A las 2,5 h después de la inyección, recolectar sangre con el método preferido. Permita que la sangre se coagule durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12-24 h, centrifugar las muestras de sangre a 3.768 x g a 4 °C durante 8 min.
      2. Recoger el suero y almacenar a -80 °C hasta su análisis. Aísle el suero y mida los niveles de IL-6 a través de ELISA o Luminex. Mantenga las herramientas de medición consistentes ya que existe una variabilidad significativa en la concentración total medida con diferentes modalidades y fabricantes.
      3. Aloje individualmente la presa después de la inyección con el enriquecimiento adecuado, como anidamientos y dispositivos de enriquecimiento. Mantener todo el enriquecimiento consistente ya que las alteraciones en el enriquecimiento pueden tener impactos significativos en el comportamiento de los roedores 24,25,26,27,28,29.
6. El tiempo de gestación para ratones C57 oscila entre 18,5 y 20,5 días. Realice controles de camada para determinar si los animales nacieron dentro de este rango para asegurarse de que la inyección se realizó en el momento correcto. Cuando verifique si hay camadas, moleste la jaula lo menos posible. El estrés inmediatamente después de que nace la camada puede aumentar el riesgo de canibalización.

Figura 2. Inducción MIA. La inducción de MIA requiere una evaluación del embarazo, inyección i.p. de poli(I: C) y controles de camada para garantizar el momento correcto de la inflamación materna. Después de evaluar el día gestacional, ya sea a través del apareamiento cronometrado o el método de aumento de peso, administre una inyección i.p. de poli (I: C) en E12.5. Recoger una muestra de sangre a las 2,5 h después de la inyección para confirmar la activación inmune y determinar el nivel de activación de IL-6. Las camadas nacerán aproximadamente E18.5-E20.5. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Investigación de alteraciones en el comportamiento en MIA adulta y crías control (opcional)

1. A partir de P60 y antes de realizar pruebas de comportamiento, aclimatar a los animales al contacto humano con un manejo suave durante 1 minuto al día durante 3 días consecutivos. Asegúrese de que los días de cambio de jaula no ocurran el mismo día en que se realizan las pruebas de comportamiento.
2. Siempre permita que los ratones se aclimaten a la sala de pruebas durante 30-60 minutos antes de comenzar las pruebas de comportamiento. Use habitaciones con poca luz (15-20 lux) para minimizar la ansiedad.
3. Para el aseo repetitivo, coloque a los ratones solos en jaulas limpias y sin ropa de cama con tapas. Usando una cámara, grabe a los ratones en estas jaulas durante 20 minutos. Los primeros 10 minutos funcionan como un período de aclimatación, los últimos 10 minutos son el período de prueba.
4. Usando videos guardados y un cronómetro, anote el tiempo de aseo acumulado para cada mouse durante el período de prueba de 10 minutos. Otros comportamientos que se pueden calificar a partir de estos videos incluyen la crianza (pararse sobre las patas traseras), congelarse y saltar⁸.
5. Utilice otras pruebas comunes para el modelo MIA, como la inhibición de prepulso (PPI) 14,30,31,32, campo abierto 12,33,34, enfoque social de 3 cámaras^13,35,36, reconocimiento de objetos novedosos 37, laberinto en y 30^, laberinto elevado más³³ y condicionamiento de contexto / miedo indicado ³⁸.
6. Inmunotransferencia postnatal⁸ (opcional)
   1. En P0, decapitar rápidamente y diseccionar el tejido cerebral fetal en HBSS, congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -80 ° C.
   2. Interrumpir muestras utilizando un sonicador de sonda con una amplitud del 20% durante 5 s en 2x tampón Laemmli, luego desnaturalizar a 85 °C durante 5 min. Centrífuga lisado a 16.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Recoger sobrenadante y almacenar a -80 °C.
   3. Mida el contenido total de proteína utilizando un kit comercial de ensayo de proteínas BCA, siguiendo las instrucciones del fabricante, y use albúmina sérica bovina como estándar de calibración.
   4. Añadir ditiothreitol como agente reductor a las muestras como una concentración final de 100 mM. Calentar a 85 °C durante 2 min antes de cargarlo en un gel.
   5. Ejecutar 5 μg/carril de proteína en condiciones reductoras en geles TGS al 7,5% y transferir electroforéticamente a las membranas de PVDF. Bloquear las membranas con tampón de bloqueo e incubar con los anticuerpos elegidos.
   6. Lavar tres veces con TBS + 0,05% Tween 20 e incubar las membranas durante 45 min con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia.
   7. Lavar cuatro veces más en TBS/Tween 20 y resultados de imagen. Estandarizar los resultados usando β-tubulina, detectada usando anti-β-tubulina.

Resultados

No todos los animales expuestos a 30 mg/kg de poli(I:C) en E12.5 producen descendencia con anomalías de comportamiento consistentes ^8,31. Aunque tanto 30 mg/kg como 40 mg/kg de poli(I:C) producen de manera confiable comportamientos de enfermedad en las presas, incluyendo disminución de los niveles de actividad, respuestas hipotérmicas y pérdida de peso, y también causan elevaciones significativas en IL-6, solo un subconjunto de camadas expuestas a MIA desarr...

Discusión

La infección materna altera el curso del desarrollo cerebral en humanos y en roedores y primates no humanos ^4,5,7. Aquí, se describe un procedimiento para inducir MIA en ratones en un punto de tiempo gestacional medio usando poli (I: C). Este método incorpora la evaluación del BIR antes del embarazo, lo que aumenta la reproducibilidad y ofrece la oportunidad de investigar mecánicamente los mecanismos que conducen a la resil...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline	Sigma-Aldrich	7647-14-5	Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish	Thomas Scientific	1219Z45	Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels	Bio-rad	4561084	Optional
Ancare Nestlets	Fisher Scientific	NC9365966	Optional
anti-β-tubulin	Millipore	MAB3408	Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I	Bio-rad	171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate	Bio-rad	171304070M
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher	23209	Optional
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle	Spectrum	552-58457-083
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9779-10G	Optional
Environmental enrichment	Bio-serv	K3327 and K3322	Optional
Ethovision	Noldus	Ethovision	Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies	Li-cor	925-32213 and 925-68072	Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed)	Various vendors		Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS	ThermoFisher	14060040	Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Invivogen	#tlrl-pic-5	Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer	AIMS	1000	Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software	Licor	5.2	Optional
Laemmli buffer	Bio-rad	1610737EDU	Optional
Luminex200	ThermoFisher	APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube	Sarstedt	16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Sigma-Aldrich	#P0913	Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A	AbCam	ab76063	Optional
monoclonal anti-STAT3	Cell signaling	12640S	Optional
Observer	Noldus	Observer	Optional
Odyssey blocking buffer (TBS)	Li-cor	927-50003	Optional
Odyssey CLx imaging system	Li-cor	9140	Optional
Omnipure PBS	Millipore	65054L	Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23227	Optional
polyclonal anti_TH	Pel-Freez	P4101-150	Optional
PVDF membrane	Bio-rad	162-0177	Optional
Qsonica Sonicator Q500	Fisher Scientific	15-338-282	Optional
Quick blood stopper	Petco	17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile	USA Scientific	1615-5500
Soldering stand	Amazon	B08Y12QC73	Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds	Bio-serv	S5137-1	Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set,	Bio-rad	171G5007M
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Optional
Tween 20	Bio-rad	23209	Optional