Gerando um Modelo Reprodutível de Ativação Imune Materna de Gestações Médias usando Poly(I:C) para Estudo de Suscetibilidade e Resiliência em Descendentes

Resumo

A infecção materna é um fator de risco para distúrbios do neurodesenvolvimento. Modelos de camundongos de ativação imune materna (MIA) podem elucidar o impacto da infecção no desenvolvimento e função cerebral. Aqui, diretrizes gerais e um procedimento são fornecidos para produzir descendentes confiáveis e suscetíveis expostos ao MIA.

Resumo

A ativação imune materna (MIA) durante a gravidez está consistentemente ligada ao aumento do risco de distúrbios neurodesenvolvimentais e neuropsiquiátricos na prole. Modelos animais de MIA são usados para testar a causalidade, investigar mecanismos e desenvolver diagnósticos e tratamentos para esses distúrbios. Apesar de seu uso generalizado, muitos modelos de MIA sofrem de falta de reprodutibilidade e quase todos ignoram dois aspectos importantes desse fator de risco: (i) muitos descendentes são resilientes ao MIA e (ii) descendentes suscetíveis podem exibir combinações distintas de fenótipos. Para aumentar a reprodutibilidade e modelar a suscetibilidade e a resiliência à AIM, a imunorreatividade basal (BIR) de camundongos fêmeas antes da gravidez é usada para prever quais gestações resultarão em descendentes resilientes ou descendentes com anormalidades comportamentais e moleculares definidas após a exposição à MIA. Aqui, um método detalhado de indução de MIA via injeção intraperitoneal (i.p.) do RNA de fita dupla (dsRNA) viral mimético poli(I:C) aos 12,5 dias de gestação é fornecido. Este método induz uma resposta inflamatória aguda na barragem, o que resulta em perturbações no desenvolvimento do cérebro em camundongos que mapeiam domínios de impacto semelhante em transtornos psiquiátricos e do neurodesenvolvimento (NDDs) humanos.

Introdução

Evidências epidemiológicas ligam a infecção materna ao aumento do risco de doenças psiquiátricas e DDNs, incluindo esquizofrenia (SZ) e transtorno do espectro autista (TEA)^{1,2,3,4,5,6,7}. O modelo de camundongos com AIM foi desenvolvido para testar a causalidade e o papel mecanicista da AIM na etiologia desses distúrbios, bem como para identificar biomarcadores moleculares e desenvolver ferramentas diagnósticas e terapêuticas ^4,6. Apesar da utilidade desse modelo e de sua crescente popularidade, há uma variabilidade considerável nos protocolos de indução de AIM dentro do campo, dificultando a comparação dos resultados entre os estudos e a replicação dos achados ^8,9. Além disso, a maioria das iterações do modelo não investiga dois importantes aspectos translacionais da AIM: (i) muitos descendentes são resilientes ao MIA e (ii) descendentes suscetíveis podem exibir combinações distintas de fenótipos⁸.

Para gerar um modelo de MIA reprodutível, os pesquisadores devem relatar pelo menos uma medida quantitativa da magnitude da MIA induzida em barragens. Para induzir a AIM durante a gestação, nosso laboratório realiza injeções intraperitoneais (i.p.) do RNA de fita dupla viral mimetizado poliinosítico: ácido policitidílico [poli(I:C)]. Poly(I:C) induz uma cascata imune semelhante aos vírus influenza, pois é reconhecida pelo receptor toll-like 3 (TLR3)¹⁰. Como resultado, a poli(I:C) ativa a resposta de fase aguda que resulta em rápida elevação das citocinas pró-inflamatórias 8,11,12. Estudos prévios demonstraram que a elevação de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a interleucina-6 (IL-6), é necessária para produzir anormalidades comportamentais e neuropatologia na prole como resultado da AIM^11,12,13. Assim, o nível de IL-6 no soro materno coletado durante seu pico em 2,5 h após a injeção de poli(I:C) é uma medida quantitativa convincente de MIA que pode ser usada para comparar resultados entre laboratórios dentro do campo.

A fim de gerar um modelo de MIA que aborde os elementos translacionalmente essenciais de resiliência e suscetibilidade com um único protocolo de indução ^8,14, os pesquisadores podem combinar abordagens típicas de indução com a caracterização da imunorreatividade basal da barragem (BIR) antes da gravidez⁸. Recentemente, descobriu-se que camundongos C57BL/6 fêmeas virgens mostram uma ampla gama de respostas de IL-6 a uma exposição de baixa dose a poli(I:C) antes da gravidez⁸. É apenas um subconjunto dessas fêmeas que passam a produzir descendentes suscetíveis, e apenas em certas magnitudes de ativação imunológica, conforme ditado pela combinação de BIR e dose poli(I:C)⁸. A MIA induz fenótipos em um padrão U invertido; os descendentes apresentam as maiores aberrações comportamentais e moleculares quando as mães são moderadamente imunorreativas, e a magnitude da inflamação materna atinge, mas não excede, uma faixa crítica⁸. Aqui, um método detalhado de como criar de forma confiável descendentes resilientes e suscetíveis com fenótipos comportamentais divergentes como resultado da injeção gestacional média de poli(I:C) é fornecido.

Protocolo

Todos os protocolos são realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia-Davis (IACUC).

1. Preparação animal

1. Ao adquirir animais, mantenha os seguintes parâmetros consistentes para garantir a máxima reprodutibilidade.
   1. Local do fornecedor e do fornecedor: como relatado anteriormente, os camundongos do tipo selvagem C57BL/6J exibem respostas diferentes à mesma dose de poli(I:C), dependendo do fornecedor⁸. Escolha um fornecedor e uma cepa de mouse que mostrem uma resposta consistente. Para os experimentos aqui, camundongos C57BL/6 obtidos de Charles River exibiram mudanças consistentes no comportamento após a exposição à MIA gestacional média, enquanto aqueles comprados da Taconic mostram uma resposta de maior magnitude, com algumas diferenças entre os grupos de tratamento em comparação com os camundongos Charles River⁸.
   2. Tensão: Os camundongos C57BL/6J são os mais utilizados, mas os camundongos BTBR e outras cepas apresentam respostas diferenciais à AIM 9 da gestação^média. Observe essas respostas diferenciais, pois elas aumentam a reprodutibilidade do método e podem ser uma variável potencial em contribuir para resultados diferenciais na prole.
   3. Para garantir uma variabilidade mínima, use apenas fêmeas virgens para estudos de MIA⁸ e observe claramente os detalhes nos métodos.
   4. Idade no momento do envio e período de aclimatação: camundongos enviados antes de 7 semanas apresentam sistemas endócrinos desregulados¹⁵. Permitir que os animais se aclimatem por um período mínimo de 48 h^16,17. Encomende ratos para serem enviados a 7 semanas (± 2 dias) e injete BIR a 8 semanas (± 2 dias).
   5. Idade no acasalamento: o sistema imunológico dos animais é dinâmico ao longo de sua vida útil. Tome cuidado para minimizar a variabilidade, mantendo a idade no acasalamento/injeção o mais consistente possível^18,19,20. Acasalar camundongos fêmeas às 9 semanas (± 2 dias). Não use machos com mais de 6 meses de idade para acasalamento.

2. Teste e preparação do lote Poly (I:C)

1. Prepare poli(I:C) de alto peso molecular conforme descrito abaixo.
   1. Autoclave 1,5 mL de tubos de microcentrífuga para armazenamento. O poli(I:C) ressuspenso pode ser armazenado a -20 °C, mas descongelamentos repetidos podem afetar a potência. Aqueça o banho-maria a 70 °C.
   2. Usando a técnica estéril, adicione 10 mL de solução salina fisiológica estéril (NaCl 0,9%) ao poli(I:C) liofilizado usando uma seringa. Aqueça em banho-maria a 70 °C durante 15 minutos para permitir o recozimento completo. Retire e deixe arrefecer até à temperatura ambiente.
   3. Em um exaustor estéril, adicione mais 40 mL de solução salina fisiológica ao frasco e inverta várias vezes para misturar. Remova a parte superior do frasco de poli(I:C) ou use uma seringa para alíquota em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Conservar a -20 °C.
2. Preparar poli(I:C) de peso molecular misto conforme descrito abaixo.
   1. Autoclave 1,5 mL de tubos de microcentrífuga para armazenamento. A poli(I:C) ressuspensa pode ser armazenada a -20 °C, mas descongelamentos de congelamento repetidos podem afetar a potência. Ajuste o banho-maria para 50 °C.
   2. Usando a técnica estéril, adicione 10 mL de NaCl estéril a 0,9% ao poli(I:C) liofilizado e prenda a tampa. Aqueça em banho-maria a 50 °C durante 25 minutos para permitir o recozimento completo. Retire e deixe arrefecer até à temperatura ambiente.
   3. Usando a técnica estéril, alíquota em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazenar a -20 °C.
3. Administrar poli(I:C) através de injeções intraperitoneais (i.p.) conforme descrito abaixo.
   1. Pese o rato para determinar a dosagem precisa. Utilizando uma agulha de insulina de 0,5 cc, elabore poli(I:C) ressuspenso.
   2. Usando a outra mão, insira a agulha a uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm entre os dois mamilos anteriores em um ângulo de cerca de 45°.
   3. Desenhe para determinar se não há sangue ou urina na seringa antes de injetar. Se ocorrer uma das duas situações, reposicione a agulha e tente novamente. Injete lentamente. Se o poli(I:C) borbulhar, a injeção provavelmente foi subcutânea. Uma colocação de injeção bem-sucedida resultará em nada sendo elaborado uma vez que a agulha é inserida, e nenhum vazamento uma vez que é removido.
4. Testar a potência do lote poli(I:C) MMW conforme descrito abaixo⁸.
   1. Alguns fabricantes permitirão que os pesquisadores coloquem uma retenção em um lote total ou parcial enquanto a potência é testada para que várias garrafas possam ser obtidas mais tarde simultaneamente. Normalmente, estes podem ser armazenados liofilizados a -20 °C durante vários anos se o congelamento-descongelamento for evitado.
   2. Obter ou criar 30 barragens grávidas para teste. Em E12.5, realize injeções i.p. de 20, 30 e 40 mg/kg em um mínimo de 10 camundongos por dose.
   3. Às 2,5 h após a injeção, colete sangue através do sangramento da cauda. Observe que o sangue periférico e o sangue do tronco podem diferir nos níveis de citocinas, portanto, mantenha o método de coleta consistente dentro de um estudo.
   4. Permita que o sangue coagule durante a noite à temperatura ambiente. Após 12-24 h, girar as amostras de sangue a 3.768 x g a 4 °C durante 8 min. Recolher o soro e conservar a -80 °C até analisar.
   5. Isole o soro e meça os níveis de IL-6 via ELISA ou Luminex. Mantenha as ferramentas de medição consistentes, pois há uma variabilidade significativa na concentração total medida com diferentes modalidades e fabricantes. Determinar a magnitude da resposta à IL-6 necessária para induzir fenótipos utilizando uma coorte piloto.

3. Teste de imunorreatividade basal (BIR)

Observação : a Figura 1 mostra o esquema das etapas. Use um poli(I:C) de peso molecular diferente para o teste BIR em comparação com o gestacional para diminuir a probabilidade de respostas imunes adaptativas ao composto.

1. Encomende ratos fêmeas virgens para serem enviados com 7 semanas de idade. Na chegada, agrupe e abrigue de quatro a cinco ratos em uma gaiola e mantenha o grupo alojado até o acasalamento. Use entalhe auricular ou qualquer outro sistema de identificação.
2. Injete fêmeas por via intraperitoneal com 5 mg/kg de poli(I:C) 1 semana após a chegada. Às 2,5 h após a injeção, quando a IL-6 circulante for mais alta⁶, colete sangue total de animais injetados através de um corte de cauda.
3. Permita que o sangue coagule durante a noite à temperatura ambiente. Após 12-24 h, girar as amostras de sangue a 3.768 x g a 4 °C durante 8 min.
4. Recolher um mínimo de 32 μL de soro de cada amostra. Congelar a -80 °C até estar pronto para testar citocinas. Para medir os níveis de IL-6 de forma mais consistente, utilize um ensaio multiplex, como o Luminex. Mantenha as ferramentas de medição consistentes, pois há uma variabilidade significativa na concentração total medida com diferentes modalidades e fabricantes.
   1. Para o protocolo de ensaio de Luminex, consulte Bruce et ^al.21.
5. Usando níveis relativos de IL-6, divida os animais em grupos BIR baixo (quartil inferior), médio (dois quartis médios) e alto (quartil mais alto).

4. Método de sangramento da cauda para coleta de sangue

NOTA: Para evitar o uso de sedativos potencialmente imunomoduladores, use o método de sangramento da cauda da coleta de sangue.

1. Para configurar, coloque um suporte de solda e um copo de contenção em uma superfície do lado da mão não dominante. Em uma placa de Petri de 35 mm, adicione 1-2 mL de óleo comestível de grau alimentício. Retire a tampa da rolha de sangue rápida e coloque perto da configuração.
2. Coloque algumas camadas de papel toalha no suporte de solda e o primeiro tubo capilar em um clipe, posicionando-o perto de onde a ponta da cauda do mouse será mantida e mantida paralela à superfície da mesa. Tenha uma lâmina de barbear à mão.
3. Para coletar o sangue, execute as seguintes etapas.
   1. No momento necessário, retire o mouse da gaiola e coloque sob o copo com a cauda saindo do entalhe na base. Usando uma lâmina de barbear fresca, prenda a extremidade (1-2 mm) da cauda e colete a primeira gota de sangue no tubo capilar preso ao suporte de solda.
   2. Mergulhe os dedos da mão dominante no óleo comestível e use para espremer da base da cauda até a ponta, guiando a ponta da cauda para o tubo capilar para coletar gotas resultantes de sangue. Continue até que ~200 μL de sangue tenham sido coletados.
   3. Coloque uma pequena tampa final na extremidade cônica do tubo capilar antes da tampa superior. Se a tampa superior for colocada primeiro, a amostra será expelida da extremidade cônica do tubo. Coloque o tubo no invólucro externo protetor.
   4. Deixe coagular durante a noite à temperatura ambiente. Arrefecer uma microcentrífuga a 4 °C e girar o sangue para baixo, tal como indicado no passo 3.3.

Figura 1. A linha do tempo para testar a imunorreatividade basal e o acasalamento de fêmeas virgens. Encomende ratos para chegar a 7 semanas de idade e permitir que se acostumem à instalação por 1 semana. Injetar animais com 5 mg/kg de poli(I:C) e 2,5 h depois extrair sangue. Deixe o sangue coagular durante a noite e, em seguida, centrifugar a 3.768 x g, 4 °C durante 8 min. Coletar soro e avaliar os níveis relativos de IL-6 via ELISA ou Multiplex. Com 9 semanas de idade, configure pares de acasalamento. Criado usando BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Método baseado no peso para acasalamento e injeção gestacional de E12.5

Observação : a Figura 2 mostra o esquema das etapas. Dois métodos podem ser usados para configurar pares de acasalamento e determinar o ponto de tempo E12.5. O primeiro, o acasalamento cronometrado, é descrito em outro lugar²². Cálculos baseados no peso também podem ser usados para avaliar uma gravidez E12.5²³. O benefício dessa abordagem é que ela permite o bloqueio temporal da idade da barragem no acasalamento, diminuindo a variabilidade na resposta imune. Este procedimento é usado aqui.

1. Coloque os machos em gaiolas limpas e deixe-os se aclimatar por um mínimo de 2 h. Isso diminui a probabilidade de agressão feminina, pois os machos já formarão um cheiro dominante na gaiola.
2. Configure pares reprodutores machos únicos e fêmeas únicas, adicionando a fêmea à gaiola do macho. Antes de colocá-la na gaiola, pese-a e registre o peso. Adicione um pequeno punhado de sementes de girassol a cada gaiola para aumentar a eficiência do acasalamento.
3. Para determinar a faixa de ganho de peso, execute as etapas a seguir.
   1. Obter um grupo de teste de fêmeas e configurar pares de acasalamento, registrando o peso no momento do acasalamento.
   2. Quando as fêmeas começarem a aparecer visivelmente grávidas, pese-as e divida em subconjuntos de 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g e 11,5 g de peso ganho. Os fetos em E12.5 apenas começaram a desenvolver dígitos distintos em suas patas. Use a morfologia fetal para determinar o ganho de peso médio para atingir E12,5.
4. Aos 12 dias após o acasalamento, pesar as fêmeas e determinar o ganho de peso. Em uma instalação de teste, as fêmeas ganham consistentemente 9,5-10,5 g do momento do acasalamento para E12,5. Injectar via i.p. a dose de poli(I:C) solubilizada determinada na etapa 2.3.2 quando o ganho de peso da fêmea se situar dentro do intervalo predeterminado.
5. Observe a resposta ao MIA em barragens usando os seguintes parâmetros.
   1. Comportamento de doença: Coletar pontuações subjetivas em uma escala de 1-3 para como as barragens ativas se tornam em resposta a serem manuseadas, onde 1 é pouco ou nenhum movimento em resposta a ser manuseado e 3 é uma resposta normal à captura e contenção. Animais com maiores respostas imunes apresentarão menor resistência ao manejo⁸.
   2. Resposta febril: Usando um termômetro IR, colete as temperaturas pré-injeção e 2,5 h pós-injeção. Animais com respostas imunes de maior magnitude frequentemente apresentam hipotermia em resposta a maior atividade imune⁸.
   3. Mudança de peso: Pesar os animais 24 h após a injeção. Animais com respostas imunes de maior magnitude geralmente perdem mais peso⁸.
   4. Meça os níveis gestacionais de IL-6 da seguinte forma⁸.
      1. Às 2,5 h após a injeção, recolher sangue com o método preferido. Permita que o sangue coagule durante a noite à temperatura ambiente. Após 12-24 h, girar as amostras de sangue a 3.768 x g a 4 °C durante 8 min.
      2. Recolher o soro e conservar a -80 °C até analisar. Isole o soro e meça os níveis de IL-6 via ELISA ou Luminex. Mantenha as ferramentas de medição consistentes, pois há uma variabilidade significativa na concentração total medida com diferentes modalidades e fabricantes.
      3. Embale individualmente a barragem após a injeção com enriquecimento apropriado, como ninhos e dispositivos de enriquecimento. Manter todo o enriquecimento consistente, pois alterações no enriquecimento podem ter impactos significativos no comportamento dos roedores 24,25,26,27,28,29.
6. O tempo de gestação para camundongos C57 varia de 18,5 a 20,5 dias. Realize verificações de cama para determinar se os animais nasceram dentro desse intervalo para garantir que a injeção foi realizada no ponto de tempo correto. Ao verificar se há ninhadas, perturbe a gaiola o mínimo possível. O estresse imediatamente após o nascimento da ninhada pode aumentar o risco de canibalização.

Figura 2. Indução de MIA. A indução da MIA requer avaliação da gravidez, injeção i.p. de poli(I:C) e verificações de ninhada para garantir o momento correto da inflamação materna. Depois de avaliar o dia gestacional, seja através do acasalamento cronometrado ou do método de ganho de peso, administrar uma injeção i.p. de poli(I:C) em E12.5. Recolha uma amostra de sangue às 2,5 h após a injeção para confirmar a ativação imunitária e determinar o nível de ativação da IL-6. As ninhadas nascerão aproximadamente em E18.5-E20.5. Criado usando BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Investigação de alterações de comportamento em MIA adulta e prole controle (opcional)

1. A partir do P60 e antes de realizar testes comportamentais, aclimate os animais ao contato humano com manuseio suave por 1 min por dia durante 3 dias consecutivos. Certifique-se de que os dias de mudança de gaiola não ocorram no mesmo dia em que os testes comportamentais são realizados.
2. Sempre permita que os ratos se acostumem à sala de testes por 30-60 minutos antes de iniciar os testes comportamentais. Use quartos mal iluminados (15-20 lux) para minimizar a ansiedade.
3. Para uma limpeza repetitiva, coloque os ratos sozinhos em gaiolas limpas e sem roupa de cama com tampas. Usando uma câmera, registre os ratos nessas gaiolas por 20 minutos. Os primeiros 10 minutos funcionam como um período de aclimatação, os últimos 10 minutos são o período de teste.
4. Usando vídeos salvos e um cronômetro, marque o tempo de preparação cumulativo para cada mouse durante o período de teste de 10 minutos. Outros comportamentos que podem ser pontuados a partir desses vídeos incluem a criação (em pé sobre as patas traseiras), o congelamento e o salto⁸.
5. Use outros testes comuns para o modelo MIA, como inibição de pré-pulso (PPI) 14,30,31,32, campo aberto^12,33,34, abordagem social de 3 câmaras ^13,35,36, reconhecimento de novos objetos³⁷, y-maze^30, labirinto elevado mais 33 e condicionamento de contexto / medo^{sinalizado 38}.
6. Imunoblotting pós-natal⁸ (opcional)
   1. Em P0, decapitar rapidamente e dissecar o tecido cerebral fetal em HBSS, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.
   2. Interromper as amostras usando um sonicator de sonda com uma amplitude de 20% por 5 s em 2x tampão Laemmli, depois desnaturar a 85 °C por 5 min. Centrifugar lisado a 16.000 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante e conservar a -80 °C.
   3. Meça o teor de proteína total usando um kit comercial de ensaio de proteína BCA, seguindo as instruções do fabricante, e use albumina sérica bovina como padrão de calibração.
   4. Adicionar o ditiotreitol como agente redutor às amostras como concentração final de 100 mM. Aqueça a 85 °C durante 2 minutos antes de carregar num gel.
   5. Execute 5 μg/lane de proteína sob condições redutoras em géis TGS a 7,5% e transfira eletroforeticamente para membranas PVDF. Bloqueie as membranas com tampão de bloqueio e incube com os anticorpos escolhidos.
   6. Lave três vezes com TBS + Tween 20 a 0,05% e incube as membranas por 45 min com anticorpos secundários marcados com fluorescência.
   7. Lave mais quatro vezes em TBS/Tween 20 e resultados de imagem. Padronizar os resultados usando β-tubulina, detectada usando anti-β-tubulina.

Resultados

Nem todos os animais expostos a 30 mg/kg de poli(I:C) em E12.5 produzem descendentes com anormalidades comportamentais consistentes ^8,31. Embora tanto 30 mg/kg quanto 40 mg/kg de poli(I:C) produzam de forma confiável comportamentos de doença em barragens, incluindo diminuição dos níveis de atividade, respostas hipotérmicas e perda de peso, e também causem elevações significativas na IL-6, apenas um subconjunto de ninhadas expostas à IAM continuará a de...

Discussão

A infecção materna altera o curso do desenvolvimento cerebral em humanos e em roedores e primatas não humanos ^4,5,7. Aqui, um procedimento para induzir MIA em camundongos em um ponto de tempo médio gestacional usando poli(I:C) é descrito. Esse método incorpora a avaliação da BIR antes da gravidez, o que aumenta a reprodutibilidade e oferece a chance de investigar mecanicamente os mecanismos que levam à resiliência e su...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline	Sigma-Aldrich	7647-14-5	Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish	Thomas Scientific	1219Z45	Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels	Bio-rad	4561084	Optional
Ancare Nestlets	Fisher Scientific	NC9365966	Optional
anti-β-tubulin	Millipore	MAB3408	Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I	Bio-rad	171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate	Bio-rad	171304070M
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher	23209	Optional
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle	Spectrum	552-58457-083
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9779-10G	Optional
Environmental enrichment	Bio-serv	K3327 and K3322	Optional
Ethovision	Noldus	Ethovision	Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies	Li-cor	925-32213 and 925-68072	Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed)	Various vendors		Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS	ThermoFisher	14060040	Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Invivogen	#tlrl-pic-5	Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer	AIMS	1000	Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software	Licor	5.2	Optional
Laemmli buffer	Bio-rad	1610737EDU	Optional
Luminex200	ThermoFisher	APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube	Sarstedt	16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Sigma-Aldrich	#P0913	Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A	AbCam	ab76063	Optional
monoclonal anti-STAT3	Cell signaling	12640S	Optional
Observer	Noldus	Observer	Optional
Odyssey blocking buffer (TBS)	Li-cor	927-50003	Optional
Odyssey CLx imaging system	Li-cor	9140	Optional
Omnipure PBS	Millipore	65054L	Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23227	Optional
polyclonal anti_TH	Pel-Freez	P4101-150	Optional
PVDF membrane	Bio-rad	162-0177	Optional
Qsonica Sonicator Q500	Fisher Scientific	15-338-282	Optional
Quick blood stopper	Petco	17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile	USA Scientific	1615-5500
Soldering stand	Amazon	B08Y12QC73	Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds	Bio-serv	S5137-1	Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set,	Bio-rad	171G5007M
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Optional
Tween 20	Bio-rad	23209	Optional