Generazione di un modello riproducibile di attivazione immunitaria materna a metà gestazionale utilizzando poli (I: C) per studiare la suscettibilità e la resilienza nella prole

Riepilogo

L'infezione materna è un fattore di rischio per i disturbi dello sviluppo neurologico. I modelli murini di attivazione immunitaria materna (MIA) possono chiarire l'impatto dell'infezione sullo sviluppo e sulla funzione del cervello. Qui vengono fornite linee guida generali e una procedura per produrre una prole resiliente e suscettibile esposta a MIA.

Abstract

L'attivazione immunitaria materna (MIA) durante la gravidanza è costantemente legata ad un aumentato rischio di disturbi dello sviluppo neurologico e neuropsichiatrico nella prole. I modelli animali di MIA sono utilizzati per testare la causalità, studiare i meccanismi e sviluppare diagnostica e trattamenti per questi disturbi. Nonostante il loro uso diffuso, molti modelli di MIA soffrono di una mancanza di riproducibilità e quasi tutti ignorano due aspetti importanti di questo fattore di rischio: (i) molti figli sono resilienti al MIA e (ii) la prole suscettibile può mostrare combinazioni distinte di fenotipi. Per aumentare la riproducibilità e modellare sia la suscettibilità che la resilienza alla MIA, l'immunoreattività basale (BIR) dei topi femmina prima della gravidanza viene utilizzata per prevedere quali gravidanze si tradurranno in prole resiliente o prole con anomalie comportamentali e molecolari definite dopo l'esposizione a MIA. Qui, viene fornito un metodo dettagliato per indurre MIA tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) del poli(I:C) mimica virale a doppio filamento (dsRNA) a 12,5 giorni di gestazione. Questo metodo induce una risposta infiammatoria acuta nella madre, che si traduce in perturbazioni nello sviluppo del cervello nei topi che mappano domini influenzati in modo simile nei disturbi psichiatrici e dello sviluppo neurologico umano (NDD).

Introduzione

L'evidenza epidemiologica collega l'infezione materna ad un aumentato rischio di malattie psichiatriche e NDD, tra cui la schizofrenia (SZ) e il disturbo dello spettro autistico (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Il modello murino MIA è stato sviluppato per testare la causalità e il ruolo meccanicistico del MIA nell'eziologia di questi disturbi, nonché per identificare biomarcatori molecolari e^{sviluppare strumenti} diagnostici e t....

Protocollo

Tutti i protocolli sono eseguiti sotto l'approvazione dell'Università della California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione degli animali

1. Quando si acquisiscono animali, mantenere coerenti i seguenti parametri per garantire la massima riproducibilità.
   1. Fornitore e posizione del fornitore: come riportato in precedenza, i topi selvatici C57BL / 6J mostrano risposte diverse alla stessa dose di poli (I: C) a seconda del fornitore⁸. Scegli un fornitore e un ceppo di mouse che mostrino una risposta coerente. Per gli esperimenti qui, i topi C57BL / 6 ott....

Risultati

Non tutti gli animali esposti a 30 mg/kg di poli (I:C) a E12.5 producono prole con anomalie comportamentali costanti ^8,31. Sebbene sia 30 mg / kg che 40 mg / kg di poli (I: C) producano in modo affidabile comportamenti di malattia nelle dighe, tra cui diminuzione dei livelli di attività, risposte ipotermiche e perdita di peso, e causino anche aumenti significativi di IL-6, solo un sottogruppo di cucciolate esposte a MIA continuerà a sviluppare anomalie comporta.......

Discussione

L'infezione materna altera il corso dello sviluppo cerebrale nell'uomo e sia nei roditori che nei primati non umani ^4,5,7. Qui, viene delineata una procedura per indurre MIA nei topi a metà gestazione usando poli (I: C). Questo metodo incorpora la valutazione del BIR prima della gravidanza, che aumenta la riproducibilità e offre la possibilità di studiare meccanicamente i meccanismi che portano alla resilienza e alla suscetti.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline	Sigma-Aldrich	7647-14-5	Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish	Thomas Scientific	1219Z45	Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels	Bio-rad	4561084	Optional
Ancare Nestlets	Fisher Scientific	NC9365966	Optional
anti-β-tubulin	Millipore	MAB3408	Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I	Bio-rad	171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate	Bio-rad	171304070M
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher	23209	Optional
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle	Spectrum	552-58457-083
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9779-10G	Optional
Environmental enrichment	Bio-serv	K3327 and K3322	Optional
Ethovision	Noldus	Ethovision	Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies	Li-cor	925-32213 and 925-68072	Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed)	Various vendors		Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS	ThermoFisher	14060040	Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Invivogen	#tlrl-pic-5	Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer	AIMS	1000	Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software	Licor	5.2	Optional
Laemmli buffer	Bio-rad	1610737EDU	Optional
Luminex200	ThermoFisher	APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube	Sarstedt	16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Sigma-Aldrich	#P0913	Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A	AbCam	ab76063	Optional
monoclonal anti-STAT3	Cell signaling	12640S	Optional
Observer	Noldus	Observer	Optional
Odyssey blocking buffer (TBS)	Li-cor	927-50003	Optional
Odyssey CLx imaging system	Li-cor	9140	Optional
Omnipure PBS	Millipore	65054L	Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23227	Optional
polyclonal anti_TH	Pel-Freez	P4101-150	Optional
PVDF membrane	Bio-rad	162-0177	Optional
Qsonica Sonicator Q500	Fisher Scientific	15-338-282	Optional
Quick blood stopper	Petco	17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile	USA Scientific	1615-5500
Soldering stand	Amazon	B08Y12QC73	Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds	Bio-serv	S5137-1	Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set,	Bio-rad	171G5007M
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Optional
Tween 20	Bio-rad	23209	Optional