Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Resumen

Este protocolo describe métodos para realizar imágenes de resonancia magnética, limpieza e inmunoetiquetado de cerebros de ratones intactos utilizando iDISCO+, seguido de una descripción detallada de imágenes utilizando microscopía de hoja de luz y análisis posteriores utilizando NuMorph.

Resumen

La limpieza de tejidos seguida de microscopía de lámina de luz (LSFM) permite obtener imágenes de resolución celular de la estructura cerebral intacta, lo que permite el análisis cuantitativo de los cambios estructurales causados por perturbaciones genéticas o ambientales. Las imágenes de todo el cerebro dan como resultado una cuantificación más precisa de las células y el estudio de las diferencias específicas de la región que pueden pasarse por alto con la microscopía comúnmente utilizada del tejido seccionado físicamente. El uso de microscopía de hoja de luz para obtener imágenes de cerebros despejados aumenta en gran medida la velocidad de adquisición en comparación con la microscopía confocal. Aunque estas imágenes producen grandes cantidades de datos estructurales cerebrales, la mayoría de las herramientas computacionales que realizan la cuantificación de características en imágenes de tejido despejado se limitan a contar poblaciones de células dispersas, en lugar de todos los núcleos.

Aquí, demostramos NuMorph (morfometría basada en nuclear), un grupo de herramientas de análisis, para cuantificar todos los núcleos y marcadores nucleares dentro de las regiones anotadas de un cerebro de ratón postnatal del día 4 (P4) después de limpiar e obtener imágenes en un microscopio de hoja de luz. Describimos imágenes por resonancia magnética (IRM) para medir el volumen cerebral antes de la contracción causada por los pasos de deshidratación de limpieza de tejidos, limpieza de tejidos utilizando el método iDISCO +, incluido el inmunomarcado, seguido de microscopía de hoja de luz utilizando una plataforma disponible comercialmente para obtener imágenes de cerebros de ratones a resolución celular. Luego demostramos esta canalización de análisis de imágenes utilizando NuMorph, que se utiliza para corregir diferencias de intensidad, unir mosaicos de imágenes, alinear múltiples canales, contar núcleos y anotar regiones cerebrales a través del registro en atlas disponibles públicamente.

Diseñamos este enfoque utilizando protocolos y software disponibles públicamente, permitiendo a cualquier investigador con el microscopio y los recursos computacionales necesarios realizar estas técnicas. Estas herramientas de limpieza de tejidos, imágenes y computación permiten la medición y cuantificación de la organización tridimensional (3D) de los tipos de células en la corteza y deben ser ampliamente aplicables a cualquier diseño de estudio de ratón de tipo salvaje / knockout.

Introducción

Las imágenes de todo el cerebro a resolución de una sola célula son un desafío importante en neurociencia. Las imágenes cerebrales de resolución celular permiten un análisis detallado y un mapeo a nivel de sistema de los circuitos cerebrales y cómo esos circuitos se ven interrumpidos por factores de riesgo genéticos o ambientales para trastornos neuropsiquiátricos, comportamiento celular en embriones en desarrollo, así como circuitos neuronales en el cerebro adulto ^1,2,3. Existen múltiples métodos histológicos que permiten obtener imágenes de alta resolución del cerebro 3D re....

Protocolo

Todos los ratones fueron utilizados de acuerdo con y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

1. Disección y perfusión del ratón

NOTA: Las siguientes disecciones se realizaron en ratones P4 y P14 utilizando una jeringa. El volumen de líquido de perfusión variará dependiendo de la edad del animal.

1. Perfusión
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído (PFA) es un producto químico peligroso. Realice todos los pasos de perfusión en una campana extractora de humos químicos.
   1. Antes de la cirugía, administra....

Resultados

Como el protocolo iDISCO+ introduce una contracción significativa del tejido, que es fácilmente perceptible a simple vista (Figura 2B), agregamos un paso de resonancia magnética a esta tubería antes de la limpieza del tejido para cuantificar la contracción inducida por la limpieza del tejido. El flujo de trabajo comienza con la extracción del tejido no cerebral de la imagen de RM (Figura 2C). A continuación, se aplica una transformación rígida (3 ángul.......

Discusión

Los métodos de limpieza de tejidos son técnicas útiles para medir la organización celular 3D del cerebro. Hay una gran cantidad de métodos de limpieza de tejidos descritos en la literatura, cada uno con sus ventajas y limitaciones 6,7,8,9. Las opciones de herramientas computacionales para analizar los tipos de células en las imágenes eliminadas de tejido son relativamente limitadas. Otra.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)