Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Resumen

Este protocolo describe métodos para realizar imágenes de resonancia magnética, limpieza e inmunoetiquetado de cerebros de ratones intactos utilizando iDISCO+, seguido de una descripción detallada de imágenes utilizando microscopía de hoja de luz y análisis posteriores utilizando NuMorph.

Resumen

La limpieza de tejidos seguida de microscopía de lámina de luz (LSFM) permite obtener imágenes de resolución celular de la estructura cerebral intacta, lo que permite el análisis cuantitativo de los cambios estructurales causados por perturbaciones genéticas o ambientales. Las imágenes de todo el cerebro dan como resultado una cuantificación más precisa de las células y el estudio de las diferencias específicas de la región que pueden pasarse por alto con la microscopía comúnmente utilizada del tejido seccionado físicamente. El uso de microscopía de hoja de luz para obtener imágenes de cerebros despejados aumenta en gran medida la velocidad de adquisición en comparación con la microscopía confocal. Aunque estas imágenes producen grandes cantidades de datos estructurales cerebrales, la mayoría de las herramientas computacionales que realizan la cuantificación de características en imágenes de tejido despejado se limitan a contar poblaciones de células dispersas, en lugar de todos los núcleos.

Aquí, demostramos NuMorph (morfometría basada en nuclear), un grupo de herramientas de análisis, para cuantificar todos los núcleos y marcadores nucleares dentro de las regiones anotadas de un cerebro de ratón postnatal del día 4 (P4) después de limpiar e obtener imágenes en un microscopio de hoja de luz. Describimos imágenes por resonancia magnética (IRM) para medir el volumen cerebral antes de la contracción causada por los pasos de deshidratación de limpieza de tejidos, limpieza de tejidos utilizando el método iDISCO +, incluido el inmunomarcado, seguido de microscopía de hoja de luz utilizando una plataforma disponible comercialmente para obtener imágenes de cerebros de ratones a resolución celular. Luego demostramos esta canalización de análisis de imágenes utilizando NuMorph, que se utiliza para corregir diferencias de intensidad, unir mosaicos de imágenes, alinear múltiples canales, contar núcleos y anotar regiones cerebrales a través del registro en atlas disponibles públicamente.

Diseñamos este enfoque utilizando protocolos y software disponibles públicamente, permitiendo a cualquier investigador con el microscopio y los recursos computacionales necesarios realizar estas técnicas. Estas herramientas de limpieza de tejidos, imágenes y computación permiten la medición y cuantificación de la organización tridimensional (3D) de los tipos de células en la corteza y deben ser ampliamente aplicables a cualquier diseño de estudio de ratón de tipo salvaje / knockout.

Introducción

Las imágenes de todo el cerebro a resolución de una sola célula son un desafío importante en neurociencia. Las imágenes cerebrales de resolución celular permiten un análisis detallado y un mapeo a nivel de sistema de los circuitos cerebrales y cómo esos circuitos se ven interrumpidos por factores de riesgo genéticos o ambientales para trastornos neuropsiquiátricos, comportamiento celular en embriones en desarrollo, así como circuitos neuronales en el cerebro adulto ^1,2,3. Existen múltiples métodos histológicos que permiten obtener imágenes de alta resolución del cerebro 3D reconstruido; sin embargo, estas técnicas requieren equipos costosos y especializados, pueden no ser compatibles con el inmunomarcaje y la naturaleza bidimensional (2D) de algunos métodos puede provocar daño tisular y cizallamiento durante la sección ^4,5.

Los avances recientes han proporcionado un enfoque alternativo para obtener imágenes de cerebros enteros que no requieren seccionamiento de tejidos; Implican el uso de la limpieza de tejidos para hacer que los cerebros sean transparentes. La transparencia se logra en la mayoría de los métodos de limpieza de tejidos mediante la eliminación de lípidos, ya que son una fuente importante de dispersión de la luz, y la coincidencia del índice de refracción (RI) del objeto con el RI de la solución de inmersión de la muestra durante la obtención de imágenes. La luz puede entonces pasar a través del límite entre los materiales sin ser dispersada 6,7,8,9.

Los métodos de limpieza de tejidos, como iDISCO+, a menudo se combinan con imágenes 3D rápidas utilizando microscopía de excitación de fotón único, como LSFM ^6,7,10. Dentro de los tejidos transparentes marcados con un fluoróforo, las imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz se seccionan por excitación con un plano delgado de luz¹¹. La principal ventaja de LSFM es que una sola sección óptica se ilumina a la vez, con toda la fluorescencia de las moléculas dentro de esa sección siendo excitada, lo que minimiza el fotoblanqueo. Además, la obtención de imágenes de un segmento óptico completo permite la detección basada en la cámara de ese segmento excitado, lo que aumenta la velocidad en relación con el escaneo puntual¹². LSFM produce de forma no destructiva secciones ópticas bien registradas que son adecuadas para la reconstrucción 3D.

Mientras que el método iDISCO+ permite la limpieza económica del tejido en ~3 semanas, los pasos de deshidratación dentro del protocolo pueden conducir a la contracción del tejido y a la posible alteración de la morfología de la muestra, afectando así las mediciones volumétricas ^6,10. Agregar un método de imagen secundario, como la resonancia magnética, que se utilizará antes del procedimiento de limpieza de tejido puede medir el grado de contracción inducida por la limpieza de tejido en toda la muestra. Durante los pasos de deshidratación, las diferencias en las propiedades mecánicas entre la materia gris y blanca pueden conducir a deformaciones no uniformes de la materia cerebral, lo que resulta en deformaciones de volumen inducidas por la limpieza de tejidos diferentes entre muestras de tipo salvaje y mutantes y pueden confundir las interpretaciones de las diferencias volumétricas en estas muestras^10,13 . La RM se realiza perfundiendo primero al animal con un agente de contraste (p. ej., gadolinio), seguido de incubar el tejido extraído de interés en una solución de inmersión (p. ej., fomblin) antes de la obtención de imágenes¹⁴. La resonancia magnética es compatible con la limpieza de tejido y la realización de LSFM en la misma muestra.

LSFM se utiliza a menudo para crear imágenes de microscopía a gran escala para la visualización cualitativa del tejido cerebral de interés en lugar de la evaluación cuantitativa de la estructura cerebral (Figura 1). Sin una evaluación cuantitativa, es difícil demostrar diferencias estructurales resultantes de insultos genéticos o ambientales. A medida que mejoran las tecnologías de limpieza de tejidos e imágenes, junto con la disminución de los costos de almacenamiento y potencia informática, la cuantificación de las localizaciones de tipo celular dentro del tejido de interés se está volviendo más accesible, lo que permite que más investigadores incluyan estos datos en sus estudios.

Con más de 100 millones de células en el cerebro del ratón¹⁵ y sesiones de imágenes de todo el cerebro que pueden generar terabytes de datos, existe una mayor demanda de herramientas avanzadas de análisis de imágenes que permitan la cuantificación precisa de las características dentro de las imágenes, como las células. Existe una gran cantidad de métodos de segmentación para imágenes limpiadas de tejido que aplican umbrales para la intensidad de tinción nuclear y filtran objetos con formas, tamaños o densidades predefinidas^10,16,17,18. Sin embargo, las interpretaciones inexactas de los resultados pueden surgir de variaciones en parámetros como el tamaño de la celda, el contraste de la imagen y la intensidad del etiquetado. Este documento describe nuestro protocolo establecido para cuantificar los núcleos celulares en el cerebro del ratón. Primero, detallamos los pasos para la recolección de tejido del cerebro del ratón P4, seguido de un protocolo de limpieza de tejidos e inmunoetiquetado optimizado a partir del método iDISCO + disponible públicamente¹⁰. En segundo lugar, describimos la adquisición de imágenes mediante resonancia magnética y microscopía de hoja de luz, incluidos los parámetros utilizados para capturar imágenes. Finalmente, describimos y demostramos NuMorph¹⁹, un conjunto de herramientas de análisis de imágenes que nuestro grupo ha desarrollado que permite la cuantificación específica del tipo de célula después de la limpieza del tejido, el inmunomarcaje con marcadores nucleares y la obtención de imágenes de hojas de luz de regiones anotadas.

Protocolo

Todos los ratones fueron utilizados de acuerdo con y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

1. Disección y perfusión del ratón

NOTA: Las siguientes disecciones se realizaron en ratones P4 y P14 utilizando una jeringa. El volumen de líquido de perfusión variará dependiendo de la edad del animal.

1. Perfusión
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído (PFA) es un producto químico peligroso. Realice todos los pasos de perfusión en una campana extractora de humos químicos.
   1. Antes de la cirugía, administrar pentobarbital mediante inyección intraperitoneal (100 mg/kg) y permitir que el anestésico surta efecto.
   2. Una vez que el animal haya alcanzado un plano quirúrgico de anestesia, use el método de respuesta de pellizco del dedo del pie para confirmar la falta de respuesta.
   3. Haga una incisión lateral debajo de la caja torácica para exponer la cavidad torácica del animal.
   4. Usando tijeras quirúrgicas curvas, corte cuidadosamente a través de la caja torácica hasta la clavícula en un lado del animal y haga un corte idéntico en el lado opuesto, permitiendo que el esternón se levante, exponiendo el corazón.
   5. Sin dañar la aorta descendente, recorte cuidadosamente cualquier tejido conectado al corazón antes de hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir que la sangre fluya fuera de la vasculatura.
   6. Usando un método basado en jeringa, perfundir el ratón a través del ventrículo izquierdo con 10 ml y 7 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para P14 y P4, respectivamente, con una tasa de perfusión de 1,5 ml / min a través del sistema.
   7. Una vez que la sangre esté limpia, perfundir nuevamente con 10 mL de PBS + 4% PFA y 7 mL de PBS + 4% PFA para P14 y P4, respectivamente, a 4 °C con una velocidad de perfusión de 1.5 mL/min para fijar el animal.
      NOTA: Se observarán temblores de fijación y el animal estará rígido al finalizar. Si utiliza RM en muestras, perfundir con volúmenes similares de PBS y PFA para cada punto de tiempo + agente de contraste de RM a base de gadolinio al 20% en la solución de PFA.
   8. Retire la cabeza con tijeras quirúrgicas y aplique gotas con PBS + 4% PFA durante 24 h a 4 °C para una fijación completa.
      NOTA: En esta etapa, el cerebro permanece intacto con el cráneo puesto (ver Sección 2). Punto de pausa: los cerebros pueden almacenarse durante varios meses en esta etapa en PBS + 0,1% de azida de sodio a 4 °C.

2. Imágenes de la estructura cerebral macroscópica basadas en RM con cráneo intacto y análisis

NOTA: El cerebro debe ser perfundido e incubado en gadolinio como se describió anteriormente sin ser removido del cráneo. Toda resonancia magnética ocurre antes de la extracción del cerebro del cráneo para evitar la pérdida involuntaria de tejido durante la disección. Las imágenes con un cráneo intacto también proporcionan apoyo al cerebro en el portamuestras (es decir, la jeringa) durante la preparación de la muestra y la obtención de imágenes.

1. Preparación de muestras
   NOTA: Los siguientes pasos están optimizados para muestras de cerebro de ratón P4 y P14. El tamaño de la jeringa necesaria dependerá del tamaño físico de la muestra.
   1. Si se realiza una resonancia magnética en la muestra, retire la piel del cráneo e incube en PBS + gadolinio al 3% durante 23 días a 4 °C antes de obtener la imagen¹⁴. Después de 23 días, enjuague las muestras rápidamente en PBS.
   2. Use jeringas de 5 ml para crear un soporte de muestra para MRI, usando pistones de jeringa para cerrar cada extremo del soporte hecho con la jeringa²⁰. Use piezas de plástico para sujetar el cráneo firmemente en su lugar en el soporte (Figura 2A). Retire las marcas de la jeringa con etanol para evitar artefactos en las imágenes.
   3. Coloque de forma segura el cráneo en el portamuestras y llénelo con una solución de inmersión compatible con MRI (consulte la Tabla de materiales). Cierre el soporte y retire todas las burbujas de aire con una jeringa.
      NOTA: Punto de pausa: El cráneo puede almacenarse en la solución de inmersión durante varios meses antes de la obtención de imágenes.
2. Imágenes de la estructura cerebral macroscópica (IRM)
   1. Imagen de las muestras con un sistema de resonancia magnética animal de diámetro horizontal de 9,4 T/30 cm utilizando una bobina de volumen de 15 mm y una secuencia basada en eco de espín con los siguientes parámetros: Resolución espacial: 60 μm x 60 μm x 60 μm; tiempo total de escaneo: 7 h 12 min; tiempo de eco (TE): 6,83 ms; tiempo de repetición (TR): 40 ms; ángulos de giro de excitación / reenfoque: 90/180 grados; tamaño de la imagen: 166 x 168 x 209 vóxeles; Campo de visión (FOV): 9.9 mm x 10.1 mm x 12.4 mm; ancho de banda: 100.000 kHz.
3. Análisis computacional de la estructura cerebral macroscópica
   1. Retire el cráneo circundante de las imágenes de resonancia magnética sin procesar rastreando manualmente el cerebro del ratón utilizando un software de segmentación. A continuación, aplique la operación de multiplicación en forma de vóxel entre la imagen de la máscara y la imagen de resonancia magnética sin procesar para generar la imagen de resonancia magnética del cerebro despojado del cráneo.
      NOTA: La salida es una imagen de máscara binaria donde la intensidad de los vóxeles cerebrales se establece en 1 y 0 de lo contrario.
   2. Aplique el registro de imágenes rígidas (estimando solo la traslación y la rotación) utilizando 'flirt' en el paquete FSL^21,22 para alinear la imagen de resonancia magnética despojada del cráneo (imagen en movimiento) con la imagen de microscopía de hoja de luz correspondiente (imagen de referencia).
   3. Aplicar el registro no rígido (utilizando 'SyN' en el software ANTS²³) para encontrar las correspondencias punto a punto entre la imagen de resonancia magnética alineada rígidamente en el paso 2.3.2 a la imagen de hoja de luz (misma imagen de referencia en el paso 2.3.2).
      NOTA: La salida incluye la imagen de resonancia magnética deformada y el campo de deformación asociado con los cambios de volumen de la resonancia magnética a las imágenes de la hoja de luz.
   4. Calcule el determinante jacobiano en el campo de deformación generado en el paso 2.3.3, que cuantifica el cambio de volumen en una vecindad local de vóxel 3 x 3 x 3.
   5. Alinee las imágenes despojadas de cráneo con el Atlas Cerebral del Ratón de Desarrollo Allen utilizando el registro de imágenes deformables.
      NOTA: La correspondencia espacial punto a punto establecida permite la anotación automática de las regiones cerebrales de interés en la nueva imagen del ratón (Figura 2C-H).

3. Disección cerebral del cráneo

1. Haga una incisión en la línea media a lo largo de la parte superior del cráneo desde el cuello hasta la nariz para exponer el cráneo.
2. Exponga la base del cráneo recortando el músculo restante del cuello y todos los demás músculos residuales.
3. Usando tijeras quirúrgicas afiladas, corte cuidadosamente a lo largo de la superficie interna del cráneo, teniendo cuidado de no dañar el cerebro manteniendo una suave presión hacia arriba mientras corta con el equipo quirúrgico afilado.
4. Use pinzas para pelar las dos mitades cortadas del cráneo lejos del cerebro y recorte cuidadosamente el exceso de grasa adherida al cerebro.
5. Use unas tijeras quirúrgicas para recortar cualquier duramadre que conecte el cerebro con el cráneo, y luego use una espátula para extraer suavemente el cerebro de la cabeza.
6. Retire el cerebro, lave con PBS y luego cambie a PBS con azida de sodio al 0,1% y manténgalo a 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo.

4. Limpieza de tejidos

NOTA: Este protocolo está adaptado del protocolo iDISCO+ para ratones P4⁶, con cambios menores. Algunos detalles pueden cambiar para diferentes puntos de tiempo / especies / experimentos). PRECAUCIÓN: El metanol, el diclorometano (DCM) y el éter dibencílico (DBE) son sustancias químicas peligrosas. Estos pasos de limpieza de tejidos se realizan en una campana extractora de humos químicos.

1. Validación de anticuerpos
   NOTA: Es necesario verificar la compatibilidad del metanol de los anticuerpos no probados, ya que pueden verse afectados negativamente por los lavados de metanol severos requeridos en el protocolo iDISCO +. Para obtener una lista de anticuerpos que han demostrado funcionar en iDISCO+, consulte el sitio web²⁴.
   1. Recolectar secciones congeladas de 10 μm del tejido fijo PFA de interés en portaobjetos estereológicos.
   2. Incubar las secciones en metanol al 100% durante 3 h a temperatura ambiente.
   3. Rehidratar en PBS antes de proceder con los protocolos estándar de inmunohistoquímica para determinar si el anticuerpo muestra el patrón esperado de fluorescencia después de los lavados de metanol. Para el control positivo, use un portaobjetos no tratado con metanol.
2. Preparación del tampón
   1. Prepare los buffers según el protocolo oficial iDISCO. Consulte la Tabla de materiales para conocer la composición de los tampones y otras soluciones utilizadas en este protocolo.
3. Pretratamiento
   1. Deshidratar la muestra con series de metanol/PBS: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 h cada uno a temperatura ambiente.
      NOTA: El uso de PBS durante la deshidratación ayuda a prevenir el agrietamiento de las muestras en los lavados con metanol.
   2. Lavar la muestra en metanol al 100% durante 1 h, y luego enfriar a 4 °C durante 1 h antes de incubar durante la noche agitando en MCD al 66% / metanol al 33% a temperatura ambiente.
   3. Lave la muestra 2 veces en metanol al 100% a temperatura ambiente y luego enfríela a 4 °C.
   4. Utilizar fresco 5%_H2O2en metanol para blanquear la muestra durante la noche a 4 °C.
   5. Rehidratar la muestra con series de metanol/PBS: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 h cada uno a temperatura ambiente y lavar 2 veces durante 1 h en PTx.2 a temperatura ambiente.
   6. Incubar la muestra en 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO a 37 °C durante la noche.
   7. Incubar la muestra en 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Desoxicolato/0,1% NP40/20% DMSO a 37 °C durante la noche.
   8. Lavar en PTx.2 a temperatura ambiente durante 1 h dos veces.
4. Inmunomarcaje
   1. Incubar las muestras en solución de permeabilización a 37 °C durante 2 días (~48 h).
   2. Bloquear las muestras en solución de bloqueo a 37 °C durante 2 días (~48 h).
   3. Incubar las muestras con anticuerpos primarios en PTwH / 5% DMSO / 3% Serum a 37 °C durante 4 días (~96 h) (por ejemplo, conejo (Rb) Brn2/POU3F2 mAb (1:100) y anticuerpo anti-Ctip2 rata (Rt) (1:400) (Tabla de materiales).
   4. Lavar 3 x 1 h en PTwH. Lavar durante otras 2 h en PTwH. Dejar en la solución de lavado durante la noche a temperatura ambiente.
   5. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios y un colorante nuclear, como TO-PRO-3, en PTwH / 3% de suero a 37 °C durante 4 días (~96 h; por ejemplo, cabra anti-Rb(1:50) y (cabra anti-Rt(1:200)) (Tabla de materiales).
   6. Lavar 3 x 1 h en PTwH Lavar durante otras 2 h en PTwH. Dejar en la solución de lavado durante la noche a temperatura ambiente.
5. Claro
   1. Deshidratar en metanol/PBS serie-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h cada uno a temperatura ambiente. Incubar durante 3 h, con agitación, en 66% DCM / 33% metanol a temperatura ambiente.
      NOTA: La muestra se puede dejar durante la noche a temperatura ambiente inmediatamente después de la deshidratación en metanol al 100%.
   2. Incubar en DCM al 100% durante 15 min dos veces a temperatura ambiente (con agitación) para lavar el MeOH.
   3. Incubar en éter de dibencilo (DBE) sin agitar a temperatura ambiente. Asegúrese de que el tubo esté lleno casi completamente con DBE para evitar la oxidación de la muestra. Termine de mezclar la solución invirtiendo un par de veces antes de la imagen.

5. Imágenes de hoja de luz

NOTA: Se obtuvieron imágenes de los cerebros iDISCO con un microscopio de lámina de luz, equipado con un objetivo 2X / 0.5 NA, una cámara semiconductora complementaria de óxido metálico y un software de operación y adquisición de imágenes de microscopio a 0.75 x 0.75 x 4 μm / vóxel para el punto de tiempo P4, ya que esto permitió una resolución de una sola célula dentro de la corteza (Figura 3A, B).

1. Montaje de muestras
   1. Monte cuidadosamente la muestra en el soporte de tamaño de muestra correcto, de modo que la muestra esté orientada con la dimensión z de no más de 5,2 mm de profundidad debido a la distancia nominal de trabajo del microscopio de lámina óptica (5,7 mm menos 0,5 mm de margen de seguridad)²⁵.
   2. Coloque el soporte en la base de la muestra con el tornillo del soporte en un ángulo de 45° con respecto a los soportes de la cuna (Figura 1B). Coloque la base de modo que la trayectoria de la luz sea perpendicular a la muestra (Figura 1C).
2. Parámetros de imagen
   1. Ajuste el cuerpo del zoom en el microscopio a un aumento de 4x o superior con un rendimiento de 0,75 μm/píxel.
      NOTA: Los análisis computacionales de una sola célula en imágenes de láminas de luz P4 se pueden realizar con cualquier microscopio de hoja de luz disponible comercialmente que permita una resolución de 0,75 x 0,75 x 4 μm/vóxel o superior. Una resolución más baja es suficiente para los cerebros en puntos de tiempo posteriores en los que los núcleos están más escasamente distribuidos.
   2. En el software de adquisición de imágenes, seleccione una sola hoja de luz con un NA = ~0,08 (9 μm de espesor/4 μm de paso z).
      NOTA: Esta configuración combinada con el enfoque dinámico horizontal permite obtener imágenes de todo el cerebro a una resolución de una sola célula del cerebro de un ratón en un tiempo razonable. Para un cerebro postnatal del día 4 (P4), el tiempo de adquisición de imágenes se estima en 11-15 h para tres canales, dependiendo del tamaño del cerebro.
   3. Para garantizar que la resolución axial se mantenga a lo largo del ancho de la imagen, seleccione Enfoque dinámico horizontal y aplique el número recomendado de pasos en función de la longitud de onda del láser. Para todo un cerebro de ratón P4, establezca el enfoque dinámico horizontal en 11. Ajuste el enfoque fino para cada canal con respecto al canal de registro.
      NOTA: Aquí, el canal TO-PRO-3 (647 nm) está registrado en el Allen Developmental Mouse Brain Atlas, ya que esto etiqueta todos los núcleos.
   4. Ajuste la potencia del láser por canal con respecto a las propiedades del canal.
      NOTA: Las longitudes de onda más largas requieren una mayor potencia láser en comparación con las longitudes de onda más cortas. Por ejemplo, el canal de 780 nm necesita ser fotografiado a una alta potencia láser (70% - 75%) y baja exposición (50 ms), mientras que el canal de 647 nm requiere una potencia láser promedio (40% - 45%) y baja exposición (50 ms).
   5. Ajuste el ancho de la hoja de luz a ~ 50% para asegurarse de que la potencia de la hoja se distribuye de manera óptima en la dimensión y para este tamaño de muestra.
      NOTA: En combinación con el enfoque dinámico horizontal, un ancho de hoja del 50% proporciona una distribución media de la potencia en toda la imagen con un riesgo reducido de fotoblanqueo²⁵.
   6. Establezca Número de mosaicos con respecto al tamaño de la muestra con una superposición recomendada del 15% entre mosaicos y capture imágenes para cada canal secuencialmente para cada pila en una posición de mosaico determinada.

6. Procesamiento de imágenes usando NuMorph

NOTA: La canalización de NuMorph tiene tres partes principales para el análisis de imágenes 3D: preprocesamiento, análisis y evaluación. Estas partes se han organizado en NMp_template.m, NMa_template.m y NMe_template.m, respectivamente, que se analizan a continuación. Además, se agrega NM_setup.m para descargar e instalar los paquetes de software necesarios para que NuMorph funcione sin problemas. NM_samples.m también proporciona una plantilla para introducir información de adquisición de imágenes.

1. Configuración de NuMorph
   1. Descargue e instale el administrador de entorno conda para Linux²⁶. Descargue e instale las herramientas de procesamiento de imágenes NuMorph¹⁹ .
   2. En la línea de comandos, ejecute Matlab. Ejecute NM_setup.m desde NuMorph para descargar e instalar los paquetes de software de análisis de imágenes necesarios para los análisis.
      NOTA: Este paso garantiza que el entorno conda esté configurado correctamente, así como que todas las herramientas y complementos necesarios para que Matlab ejecute cada una de las tres tuberías se descarguen e instalen correctamente. Los más notables aquí son Elastix para ejecutar el registro y 3D-Unet para la detección y conteo de células.
2. Especifique nombres de muestra, directorios de entrada y salida, información de canal y parámetros de imágenes de hoja de luz editando el archivo NM_samples.m.
   NOTA: Aquí, se recomienda verificar dos veces para asegurarse de que la información correcta, especialmente el directorio de entrada de imágenes, se especifique correctamente. Por lo general, los errores no se llaman aquí hasta que se ejecutan los pasos posteriores.
3. Preprocesamiento de imágenes
   1. Ajuste de intensidad
      1. En el NMp_template, establezca el ajuste de intensidad = true.
         NOTA: Establezca en true si se requiere un ajuste de intensidad. Si no es así, establezca el ajuste de intensidad = false. También hay una opción para usar 'actualizar' para sobrescribir los parámetros de ajuste anteriores.
      2. Set use processed images = false al trabajar con un nuevo conjunto de imágenes. De lo contrario, indique cualquier dataset de imagen guardado previamente en el directorio de salida (por ejemplo, "alineado", "cosido") para usarlo en los pasos de procesamiento posteriores.
         NOTA: Esta opción se proporciona en el caso de que las imágenes de entrada ya se hayan procesado previamente. En este caso, las imágenes preprocesadas se utilizarán como imágenes de entrada y la opción se establecerá en el nombre del subdirectorio en el directorio de salida.
      3. Set save images = true.
         NOTA: El uso de esta opción garantiza que las imágenes procesadas se guarden en el directorio de salida; de lo contrario, solo se calcularán y guardarán los parámetros.
      4. Set save samples = true.
         NOTA: Esta opción garantiza que los resultados de muestra se guarden para cada paso principal.
      5. Set adjust tile shading = basic para aplicar corrección de sombreado usando el algoritmo BaSiC²⁷ o manual para aplicar corrección de sombreado de mosaico usando mediciones del microscopio de hoja de luz en anchos específicos de hoja de luz.
         NOTA: Esta opción corrige la iluminación desigual a lo largo de la dimensión y causada por la forma de la cintura de la hoja.
   2. Alineación del canal de imagen
      1. En NMp_template, establezca alineación de canales = true. Establezca esta opción en true si se requiere alineación de canales. Si no es así, establézcalo en false. Establezca el método de alineación de canales en traslación (rígido) o elastix (no rígido).
         NOTA: El método de traslación utiliza enfoques de registro 2D rígidos para alinear múltiples canales, mientras que el método elastix utiliza B-splines no rígidos²⁸ para corregir la deriva rotacional, que puede ocurrir durante la adquisición de imágenes largas¹⁹.
   3. Costura iterativa de imágenes
      1. En NMp_template, establezca imágenes de puntada = true.
         NOTA: Establezca esta opción en true si se requiere costura.
      2. Establecer refinamiento de tamizar = verdadero.
         NOTA: Esta opción se utiliza para refinar aún más la traducción en xy utilizando la transformación de característica invariante^{de escala 29}.
      3. Establecer parámetros de alineación de carga = true.
         NOTA: Esta opción utiliza las traducciones de alineación de canales durante la costura. Esta opción se recomienda con imágenes multicanal. De lo contrario, se establece en false.
      4. Establezca la superposición = 0,15 para que coincida con las superposiciones de mosaicos durante la creación de imágenes.
   4. Para ejecutar cualquiera de estos pasos de preprocesamiento, ejecute lo siguiente en Matlab fuera NMp_template entorno:
      1. Especifique el nombre de la muestra. Set config = NM_config(process,sample).
      2. Ejecute cualquiera de los pasos de preprocesamiento especificando NM_process(config,stage) y especifique la etapa utilizando intensity, align, o stitch para cualquiera de los procesos. Compruebe el directorio de salida para los archivos de salida para cada una de las etapas (Figura 3 y Figura 4).
4. Análisis de imágenes
   1. Antes de NuMorph
      1. Comience con una imagen de atlas 3D y una imagen de anotación asociada que asigne cada vóxel a una estructura particular.
         NOTA: Aquí se utiliza el Atlas Cerebral de Ratón de Desarrollo P4 Allen generado a partir del MagellanMapper³⁰ .
      2. Alinee tanto la imagen del atlas como el archivo de anotación para asegurarse de que coinciden correctamente en la orientación correcta.
   2. Dentro de NuMorph
      NOTA: Ahora que el atlas y sus anotaciones están alineados correctamente, los archivos tienen que ser "munged" o procesados dentro de NuMorph para que puedan guardarse para su uso posterior. Para ello, utilice la función munge_atlas para especificar las entradas como se muestra a continuación.
      1. Especifique Atlas_file: (cadena). Proporcione la ruta de acceso completa al archivo atlas.
      2. Especifique Annotation_file: (cadena). Proporcione la ruta de acceso completa a las anotaciones asociadas.
      3. Especifique la resolución: (1x3 numérico). Especifique la resolución y, x y z del atlas como micras por píxel.
      4. Especifique la orientación: (1 x 3 caracteres). Proporcione la orientación del atlas y asegúrese de que coincida con la configuración de la muestra en la cuna (anterior (a) / posterior (p), superior (s) / inferior (i), izquierda (l) / derecha (r)).
      5. Especificar hemisferio: especifique qué hemisferio cerebral se visualizó ("izquierda", "derecha", "ambos", "ninguno").
      6. Especifique out_resolution:(int). Especifique la resolución isotrópica de la salida del atlas en micras. (valor predeterminado: 25).
      7. Ejecute el comando "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, resolución, orientación, hemisferio)" para generar anotaciones mung en /data/annotation_data y una copia de la imagen del atlas en /data/atlas.
      8. Lea la estructura de Matlab y el archivo atlas para verificar que ambos archivos estén correctamente modificados en la orientación correcta.
         NOTA: Se puede realizar un paso adicional de clasificación celular para cuantificar los tipos de células en función de la colocalización de marcadores de proteínas inmunomarcados.
   3. Remuestreo
      1. En NMa_template, establezca imágenes de remuestreo = true, si realiza el registro de imágenes para hacer referencia al atlas o para generar volúmenes de muestreo reducido de conjuntos de datos de alta resolución.
         NOTA: El archivo NMa_template.m se utilizará para establecer los parámetros de remuestreo, registro, detección de núcleos y recuento de células.
      2. Establezca la resolución de remuestreo para que coincida con el atlas.
         NOTA: Aquí se utiliza una resolución isotrópica de²⁵ μm 3/vóxel porque el atlas de referencia está en esta resolución.
      3. Especifique el número de canal que se va a volver a muestrear mediante canales de remuestreo = [ ].
         NOTA: Aquí, el número de canal está configurado para que coincida con el canal nuclear. Si esta opción está vacía, solo se volverá a muestrear el canal de registro.
   4. Registro
      1. En NMa_template, establezca imágenes de registro = true. Se establece en true si es necesario registrarse. Si no es así, establezca registro = false.
      2. Especifique el archivo atlas para que coincida con el archivo en el directorio atlas.
      3. Establecer parámetros de registro = predeterminado.
         NOTA: Esta opción utiliza una transformación afín seguida de B spline para estimar la correspondencia espacial. De lo contrario, defina un nuevo conjunto de parámetros de registro a través de Elastix en /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Set save registered images = true.
         NOTA: Los archivos de salida del registro y el remuestreo se pueden descargar e inspeccionar visualmente en Matlab u otras herramientas de visualización como FIJI³¹.
   5. Detección, recuento y clasificación de núcleos
      NOTA: Los errores que se producen aquí pueden deberse a que no se especifica correctamente el archivo de anotaciones o a que no coincide la antigüedad de la muestra con la anotación correcta.
      1. En NMa_template, establezca ambos núcleos de recuento y clasifique las celdas = verdadero.
      2. Set count method = 3dunet.
         NOTA: Esta opción permite el uso del modelo 3D-Unet entrenado¹⁹. De lo contrario, seleccione Hessian que utiliza el método de detección de blobs de Hessian.
      3. Establezca min_intensity para definir un umbral de intensidad mínimo para los objetos detectados.
         NOTA: Se determina empíricamente un umbral apropiado basado en la relación señal-ruido del etiquetado nuclear.
      4. Establezca classify_method en cualquiera de los umbrales, que se basa en una intensidad de fluorescencia no supervisada en posiciones centroides o svm, que modela un clasificador de máquina de vectores de soporte lineal supervisado (SVM).
         NOTA: Este paso clasificará todas las celdas detectadas en cuatro clases principales con imágenes de 3 canales. Con este protocolo, se generan Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2⁺, Ctip2-/Brn2^- y Outliers.
   6. Pasos de análisis
      1. Especifique el nombre de la muestra. Set config =NM_config(analyze,sample).
      2. Ejecute cualquiera de los pasos de análisis especificando NM_analyze(config,stage) y especifique la fase mediante resamplear, registrar, contar o clasificar. Compruebe en el directorio de salida los archivos de salida para cada una de las etapas (Figura 5).
   7. Clasificación de tipo celular y análisis de grupos
      1. En NMe_template, establezca update = true y sobrescriba todas las estadísticas anteriores calculadas.
         NOTA: El NMe_template.m ofrece la opción de realizar análisis de grupos de tipo celular en las regiones cerebrales del mismo cerebro que se está analizando.
      2. Establezca compare_structures_by en cualquiera de los índices para comparar por todas las anotaciones únicas o en una tabla para comparar estructuras según la tabla.
      3. Establezca el template_file, que especifica todos los índices de estructura posibles y debe existir en /annotations.
      4. Establezca structure_table y especifique las estructuras que desea evaluar.
      5. Especifique el recuento de celdas y la clasificación de tipo de celda como se describe en NMa_template.m.
      6. Establezca compare_groups para especificar los grupos que desea comparar.
      7. Establezca emparejado en verdadero o falso para realizar la prueba t emparejada o la prueba t de dos muestras.
   8. Ejecutar análisis.
      NOTA: Para realizar este paso, ejecute lo siguiente en Matlab fuera del entorno NMe_template.m.
      1. Especifique el nombre de la muestra. Set config =NM_config(evaluate,sample).
      2. Ejecute el paso de análisis especificando NM_evaluate(config,stage) y especifique la etapa. Compruebe en el directorio de salida los archivos de salida para el análisis de grupo.

Resultados

Como el protocolo iDISCO+ introduce una contracción significativa del tejido, que es fácilmente perceptible a simple vista (Figura 2B), agregamos un paso de resonancia magnética a esta tubería antes de la limpieza del tejido para cuantificar la contracción inducida por la limpieza del tejido. El flujo de trabajo comienza con la extracción del tejido no cerebral de la imagen de RM (Figura 2C). A continuación, se aplica una transformación rígida (3 ángul...

Discusión

Los métodos de limpieza de tejidos son técnicas útiles para medir la organización celular 3D del cerebro. Hay una gran cantidad de métodos de limpieza de tejidos descritos en la literatura, cada uno con sus ventajas y limitaciones 6,7,8,9. Las opciones de herramientas computacionales para analizar los tipos de células en las imágenes eliminadas de tejido son relativamente limitadas. Otra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)